CN102049028B

CN102049028B - 通络祛痛膏指纹图谱的测定方法

Info

Publication number: CN102049028B
Application number: CN201010547044A
Authority: CN
Inventors: 申桂芬; 聂红梅; 王岩; 熊维政; 张军兵; 武惠斌
Original assignee: LINGRUWEIYE TECH Co Ltd BEIJING; BEIJING INSTITUTE OF PHARMACEUTICAL RESEARCH HENAN LINGRUI PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: LINGRUWEIYE TECH Co Ltd BEIJING; BEIJING INSTITUTE OF PHARMACEUTICAL RESEARCH HENAN LINGRUI PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2030-11-17
Also published as: CN102049028A

Abstract

本发明涉及通络祛痛膏HPLC指纹图谱的测定方法，并通过大量实验建立通络祛痛膏成品药膏指纹图谱建立的方法及其标准HPLC指纹图谱。首先制备通络祛痛膏成品贴片的供试品溶液，将样品置于具塞三角瓶中，用75％的甲醇溶液进行水浴回流，过0.45μm滤膜，进样量10μl；采用梯度洗脱，流动相A为0.1％磷酸水溶液或冰醋酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，流速为1.0ml/min，检测波长250nm和280nm，柱温30℃；照高效液相色谱法测定，得到通络祛痛膏的指纹图谱。此种方法测定的指纹图谱重复性高，可作为测定通络祛痛膏中化学组分的方法，也可作为鉴定通络祛痛膏质量控制方法。

Description

通络祛痛膏指纹图谱的测定方法

技术领域

本发明涉及中药指纹图谱的测定方法，具体地说是用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱方法来测定通络祛痛膏成品的化学成分的方法。

背景技术

骨性关节病、骨质增生性疾病可发生于任何年龄，骨性关节病、骨质增生行疾病的发病率随着年龄的增加而增加，以40岁以上的中老年为多，该病具有发病率高，病程长，治疗后极易复发等特点。每年都有很多患者因没有接受很好的治疗而离开人世，令人悲痛。目前治疗的方法有很多，最常见的几种是药物治疗、物理治疗、牵引按摩、手术治疗、中医外贴治疗等。内服药物治疗对患者的肠胃造成一定伤害，且很难达到病根，因此起效速度慢，无法根治。手术治疗的危险性大，恢复期慢，容易带来身体的二次伤害。以上两种治疗不建议骨性关节病、骨质增生性疾病患者使用，因为考虑到患者大多都是中老年人，这两种治疗都很高危。像物理治疗、牵引按摩根本不能治愈病症可缓解疼痛，起辅助治疗的作用。中医外贴法治疗，中医认为骨质增生与外伤、劳损、瘀血阻络、感受风寒湿邪、痰湿内阻、肝肾亏虚等有关，中医膏药针对病因病症用药，药效可直达病灶，起到标本兼治的功效！同时使用方便、安全可靠，比较适合中老年患者使用。通络祛痛膏正是这一中医精华，由当归、川芎、红花、山奈、花椒、肉桂、干姜等具有活血行气、活血通经，祛瘀止痛、祛风散寒功效的药材组成，是遵循中药归经原则，运用药物互相协调为用的效能，组成的多味药物大组方，共收活血通络，散寒祛湿，消肿止痛之功能，适用于骨性关节病见瘀血停滞、寒湿阻络之证。

对于治疗关节刺痛或钝痛，关节僵硬，屈伸不利，畏寒肢冷等临床症状，虽然中药的单一靶点的作用强度低于西药，但是其多途径、多靶点、动态整体治疗、毒副作用小的特性则远非西药所能企及，疗效确切的中成药的综合治疗效果要超过西药。通络祛痛膏目前的质量标准只控制处方中某一味药中一种成分阿魏酸的含量以及部分药材中单一成分的薄层鉴别，难以从整体上反映产品的质量或从整体上控制产品的质量。因此，如何从整体上更好的控制产品质量一直是我公司积极研究的课题。

中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用HPLC指纹图谱的方法控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用时提取物所得物质群的整体作用结果，对这样一个整体的质量控制，采用的是HPLC指纹图谱的方法。随着研究的深入，人们逐渐认识到，中药、尤其是复方中药，其中所含的任一成分都不能代表其整体疗效，从现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别与主要有效成分含量测定结合的方式已是发展的趋势。

通络祛痛膏临床上用于腰部、膝部骨性关节炎属瘀血停滞、寒湿阻络证，证见：关节刺痛或钝痛，关节僵硬，屈伸不利，畏寒肢冷。其治疗效果已经得到多年临床的验证，而是否能够保证药物的质量以及通络祛痛膏的质量，是决定通络祛痛膏疗效的基础。要控制通络祛痛膏的功效，只针对其一、二个化学成分进行表征可控制时不够的，必须对它的物质群整体予以控制。指纹图谱作为中药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。目前如何能够从整体上、从更宏观的角度对通络祛痛膏制剂进行质量控制的宏观质量控制方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种通络祛痛膏指纹图谱的测定方法，通过此方法，可控制通络祛痛膏的质量。

本发明可以通过下述步骤实施：

(a)供试品溶液的制备：取通络祛痛膏适量，加入甲醇，与水一定比例的甲醇、乙醇，与水一定比例的乙醇中的至少一种溶剂提取，置具塞三角瓶中，回流提取或超声提取，过滤膜，取续滤液作为供试品溶液备用。

(b)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为磷酸水溶液或冰醋酸水溶液或磷酸水溶液加三乙胺或冰醋酸水溶液加三乙胺或水，流动相B为乙腈；检测波长220～300nm；

(c)测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

优选的本发明可以通过下述步骤实施，所述步骤(a)中所述的加50％～100％的甲醇溶液或50％～100％的乙醇溶液。

进一步优选的本发明可以通过下述步骤实施：所述步骤(a)中加50％～100％的甲醇溶液或50％～100％的乙醇溶液20～100ml，超声提取或回流提取，用0.2um或0.45um滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液备用；

所述步骤(b)中色谱条件：进样量5～40ul；检测波长为250～280nm；柱温20～40℃。

更进一步优选的本发明可以通过下述步骤实施：所述步骤(a)中供试品溶液的制备：取样品适量，加75％～100％的甲醇溶液或75％～100％的乙醇溶液30～50ml，超声提取0.5～3h或回流提取0.5～3h，溶液用0.2um或0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用。

所述步骤(b)中色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为0.1～1％的磷酸水溶液或为0.1～1％冰醋酸水溶液或为0.1～1％的磷酸水溶液加0.1～1％的三乙胺或为0.1～1％的冰醋酸水溶液加0.1～1％的三乙胺，流动相B为乙腈或甲醇；梯度洗脱程序：A相(％)70～0～70∶B相(％)30～100～30，梯度时间0～105min。流速1.0ml/min，进样量10～20ul；检测波长为250～280nm；柱温20～40℃。

再更进一步优选的本发明可以通过下述步骤实施：所述步骤(a)中供试品溶液的制备：取样品适量，加甲醇溶液或75％的乙醇溶液30ml，超声提取2h或回流提取2h，溶液用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用。

所述步骤(b)中色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为0.1～1％的磷酸水溶液或为0.1～1％冰醋酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：

0分钟时，流动相A为60％，流动相B为40％；

30分钟时，流动相A为40％，流动相B为60％；

35分钟时，流动相A为30％，流动相B为70％；

70分钟时，流动相A为0％，流动相B为100％；

70.01分钟时，流动相A为60％，流动相B为40％；

90分钟，流动相A为40％，流动相B为60％；

流速1.0ml/min，进样量10～20ul；检测波长为250nm和280nm；柱温28～32℃。

最佳的本发明中可以通过下述步骤实施：所述步骤(a)中供试品溶液的制备：取样品片1片，加75％乙醇溶液30ml，回流提取2h，补足失重，放置室温，溶液用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用。

所述步骤(b)中色谱条件：所述步骤(b)中色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为0.1的磷酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：

0分钟时，流动相A为60％，流动相B为40％；

40分钟时，流动相A为40％，流动相B为60％；

45分钟时，流动相A为30％，流动相B为70％；

75分钟时，流动相A为0％，流动相B为100％；

75.01分钟时，流动相A为60％，流动相B为40％；

105分钟，流动相A为40％，流动相B为60％；

流速1.0ml/min，进样量10ul；检测波长为250mm和280nm；柱温30℃。

本发明中，选用100％甲醇、75％乙醇、75％甲醇和100％乙醇作为提取溶剂超声提取所获得的通络祛痛膏指纹图谱整体效果优于水、50％甲醇、50％乙醇的提取效果；优选100％的甲醇和75％乙醇30ml作为提取溶剂超声均有较好的提取效果；进一步优选75％乙醇30ml回流提取所得指纹图谱的整体效果较好；再进一步优选75％乙醇30ml回流提取2h所得指纹图谱的整体效果最佳。

按照本发明的方法测定的是通络祛痛膏16批次的样品的指纹图谱，按照上述方法测定的指纹图谱中，16批次样品的指纹图谱与标准图谱指纹比较其相似度均大于0.9，通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱250nm的标准指纹图谱和混合对照图谱的比对以及相似度结果，所述图谱的图形如说明书附图中的图1、图2和图3所示；通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱280nm的标准指纹图谱和混合对照图谱的比对和16批次样品的指纹图谱和相似度结果，所述图谱的图形如说明书附图中的图4、图5和图6所示。

本发明对通络祛痛膏的半成品胶浆进行了测定，9批次的胶浆的指纹图谱与其标准指纹图谱比较其相似度均大于0.9，所述图谱的图形如说明书中附图中的图7、图8、图9、图10和图11所示。

本发明通过测定通络祛痛膏半成品胶浆和成品的指纹图谱发现，胶浆和成品的吸收峰数量基本一致。因胶浆是制剂过程中最后的半成品，所以胶浆和成品的吸收峰数量和峰位基本一致，说明半成品和成品之间是有前后秉承关系的。说明采用测定通络祛痛膏指纹图谱作为通络祛痛膏质量鉴别的控制标准比单独以阿魏酸或其中某一成分作为质量标准更能够客观的反映产品的内在成分的有无与其含量，以全面控制产品的质量。

本发明的优点如下：

(1)以通络祛痛膏成品建立的HPLC指纹图谱，代表着通络祛痛膏成品中大部分的化学成分，能有效地表征通络祛痛膏成品的质量。从而实现对通络祛痛膏最大可能的化学成分进行检测，有利于对成品质量的全面监控。

(2)以通络祛痛膏成品指纹图谱图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相应量的变化，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定通络祛痛膏制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为更全面、准确评价通络祛痛膏的质量提供了新的对照标准，将更加保证通络祛痛膏的质量及其临床的疗效。

(3)本发明具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好，适用于通络祛痛膏成品的整体质量控制。

(4)本发明建立的指纹图谱能够表达该产品的特征(包括8个已知成分)，具有较好的专属性。

本发明提供了一种通络祛痛膏成品的检测方法，本发明是通过大量实验所得的切实可行的方法，具有重复性。在本发明中利用高效液相，在相同测定条件下所获得的通络祛痛膏成品的指纹图谱、通络祛痛膏半成品胶浆的指纹图谱重合性好，测定重复性好，可以利用通络祛痛膏指纹图谱的标准指纹图谱来控制半成品胶浆的质量，达到更科学的控制制剂质量的目的。

附图说明

下面给出通络祛痛膏成品、通络祛痛膏半成品的指纹图谱，已在进一步说明本发明，但不对不发明限制。

图1通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱250nm下的标准指纹图谱和混合对照比对的图谱

图2通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱250nm下16批次样品指纹图谱和标准指纹图谱的比对

图3通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱250nm下16批次样品指纹图谱和标准指纹图谱的相似度结果

图4通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱280nm下的标准指纹图谱和混合对照比对的图谱

图5通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱280nm下16批次样品指纹图谱和标准指纹图谱的比对

图6通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱280nm下16批次样品指纹图谱和标准指纹图谱的相似度结果

图7通络祛痛膏HPLC指纹图谱半成品胶浆和成品制剂在250nm下各自的标准指纹图谱的比对

图8通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱250nm下半成品胶浆9批次样品指纹图谱和标准指纹图谱

图9通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱250nm下半成品胶浆9批次样品指纹图谱和标准指纹图谱的相似度结果

图10通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱280nm下半成品胶浆9批次样品指纹图谱和标准指纹图谱

图11通络祛痛膏制剂HPLC指纹图谱280nm下半成品胶浆9批次样品指纹图谱和标准指纹图谱相似度结果

具体实施方式

下面列举实施例进一步详细说明本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明没有限制。

实施例一

1、供试品溶液的制备：取样品适量，分别采用100％甲醇溶液、乙醇、75％乙醇溶液作为提取溶剂，超声提取0.5h，溶液用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用。

2、HPLC分析条件

Kromasil 100-5C₁₈分析柱(4.6mm×250mm，5um)；流动相：A为0.2％磷酸水溶液，B相为甲醇，流速1.0ml/min；检测波长220～300nm；柱温30℃，进样15ul。

梯度洗脱程序如下表：

3、测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到相应的图谱，得到相应色谱条件下的HPLC图谱。

实施例二

1、供试品溶液的制备：取样品适量，分别采用75％甲醇溶液、甲醇、乙醇、75％乙醇溶液作为提取溶剂，回流提取1h，溶液用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用。

2、HPLC分析条件

Kromasil 100-5C₁₈分析柱(4.6mm×250mm，5um)；流动相：A为水，B相为乙腈，流速1.0ml/min；检测波长220～300nm；柱温30℃，进样20ul。

梯度洗脱程序如下表：

实施例三

1、供试品溶液的制备：取样品适量，分别采用75％甲醇溶液、甲醇、乙醇、75％乙醇溶液作为提取溶剂，回流提取2h，溶液用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用。

2、HPLC分析条件

资生堂MG C₁₈(4.6mm×250mm，5um)；流动相：A相为0.2％磷酸和0.4％三乙胺混合水溶液(v/v)，B相为乙腈，流速1.0ml/min；检测波长220～300nm；柱温30℃，进样20ul。

梯度洗脱程序如下表：

3、测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到相应的图谱。

实施例四

1、供试品溶液的制备：取样品1贴，采用100％乙醇溶液作为提取溶剂，回流提取1h，溶液用0.2um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用。

2、HPLC分析条件

资生堂MG C₁₈(4.6mm×250mm，5um)；流动相：A相为1％磷酸水溶液，B相为乙腈，流速1.0ml/min；检测波长220～300nm；柱温30℃，进样15ul。

梯度洗脱程序如下表：

实施例五

1、供试品溶液的制备：取样品1贴，采用100％甲醇溶液作为提取溶剂，超声提取1h，溶液用0.2um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用。

2、HPLC分析条件

资生堂MG C₁₈(4.6mm×250mm，5um)；流动相：A相为0.2％冰醋酸加0.2％三乙胺混合水溶液，B相为乙腈，流速1.0ml/min；检测波长250nm和280nm；柱温30℃，进样20ul。

梯度洗脱程序如下表：

实施例六

1、供试品溶液的制备：取样品1贴，采用100％甲醇溶液作为提取溶剂50ml，超声提取1h，溶液用0.2um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用。

2、HPLC分析条件

资生堂MG C₁₈(4.6mm×250mm，5um)；流动相：A相为0.5％磷酸水溶液，B相为乙腈，流速1.0ml/min；检测波长250nm和280nm；柱温30℃，进样20ul。

梯度洗脱程序如下表：

实施例七

1、供试品溶液的制备：取样品1贴，采用100％甲醇溶液作为提取溶剂30ml，置于具塞的三角瓶中，密封，超声提取2h，冷却至室温，溶液用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用，进样20ul。

2、HPLC分析条件

资生堂MG C₁₈(4.6mm×250mm，5um)；流动相：A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈，流速0.8ml/min；检测波长250nm和280nm；柱温30℃。

梯度洗脱程序如下表：

实施例八(通络祛痛膏指纹图谱的构建方法)

1、仪器与试剂

仪器：Shimadzu 2010AHT液相色谱，包括四元泵，在线脱气机，自动进样器，双通道检测器，柱温箱，LCSolution工作站；BS210电子天平、METTTERAE240(梅特勒-托利多(上海)有限公司)、数显恒温水浴锅、KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)

试剂：乙腈(色谱纯，公司名称？)，甲醇(色谱纯，公司名称？)，磷酸(分析纯)，娃哈哈纯净水

2、指纹图谱方法的构建

2.1不同色谱柱对通络祛痛膏成品的分离效果的比较

2.1.1供试品溶液的制备：取样品1贴，采用100％甲醇溶液作为提取溶剂30ml，置于具塞的三角瓶中，密封，超声提取1h，冷却至室温，溶液用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用，进样30ul。

2.1.2 HPLC分析条件

分别采用资生堂MG C₁₈(4.6mm×250mm，5um)、Kromasil 100-5C₁₈分析柱(4.6mm×250mm，5um)、Agilent ZORBAX Eclipse PlusC₁₈(4.6mm×250mm，5um)进行分析；流动相：A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈，流速1.0ml/min；检测波长250nm和280nm；柱温30℃。

梯度洗脱程序如下表：

2.1.3测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到相应的图谱。

2.1.4结果比较三种不同品牌的色谱柱，从HPLC图谱中可以看出资生堂MG分析柱(4.6mm×250mm，5um)较其他两种色谱柱分析的样品的整体分离效果和峰形均较好，故采用此色谱柱进行通络祛痛膏制剂的指纹图谱分析较佳。

2.2不同色谱柱柱温对通络祛痛膏成品分离效果的比较

2.2.1供试品溶液同“2.1.1项”下的供试品溶液，进样30ul。

2.2.2 HPLC分析条件

采用资生堂MG C₁₈(4.6mm×250mm，5um)进行分析；流动相：A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈，流速1.0ml/min；检测波长250nm和280nm；测定柱温为25℃、30℃、35℃和40℃。

2.2.3测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到相应的图谱。

2.2.4结果比较不同柱温下的HPLC图谱，从图谱中可以看出柱温为30℃样品被分离的效果最好。

2.3不同提取溶剂对通络祛痛膏成品提取整体效果的比较

2.3.1不同提取溶剂的比较样品的制备：如下表所示

取同一批次的样品10贴，分别按照表中所用方法，将上述样品分别置于具塞三角瓶中，密封，分别超声(回流)提取1h，冷却至室温，溶液用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用，分别进样30ul，进行HPLC分析。

2.3.2 HPLC色谱条件

资生堂MG C₁₈(4.6mm×250mm，5um)；流动相：A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈，流速1.0ml/min；检测波长250nm和280nm；柱温30℃。

梯度洗脱程序如下表：

2.3.3测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到相应的图谱。

2.3.4结果比较各个样品的HPLC图谱，从图谱的整体峰数和峰高来比对，10个样品中100％甲醇溶液回流、100％乙醇溶液超声和75％乙醇溶液回流的效果较其他样品的整体提取效果要好；再比较这三者之间可以得知75％乙醇回流的样品相对于100％甲醇回流和100％乙醇超声的整体提取效果稍好些，因此制剂样品的最佳提取方式为以75％乙醇为提取溶剂回流提取。

2.4不同提取时间的比较

2.4.1不同提取时间样品的制备

取同一批次的样品3贴，分别置于具塞三角瓶中，分别精密加入75％乙醇溶液30ml，分别回流0.5h、1h和2h，冷却至室温，提取溶液分别用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用，分别进样30ul，进行HPLC分析。

2.4.2 HPLC色谱条件

色谱条件同“2.1.2项”下。

2.4.3测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到相应的图谱。

2.4.4结果比较各个样品的HPLC图谱，从图谱的整体峰数和峰高来比对，3个样品中75％乙醇回流0.5h、1h和2h三者之间无明显的差别，从样品提取完全和节约时间的角度考虑，选用提取1h比较合适。

实施例九(通络祛痛膏成品指纹图谱方法学验证和指纹图谱测定)

1、供试品溶液的制备取样品1贴，置于具塞三角瓶中，精密加入75％乙醇溶液30ml，称重，回流1h，冷却至室温，补足失重，提取溶液用0.45um滤膜滤过。取续滤液作为供试品溶液备用，进行HPLC分析。

2、HPLC色谱条件

资生堂MG分析柱(4.6mm×250mm，5um)；流动相：A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈，流速1.0ml/min；检测波长250nm和280nm；柱温30℃，进样10ul。

梯度洗脱程序如下表：

3、指纹图谱方法验证

以同一批通络祛痛膏成品进行指纹图谱方法学考察，选择大黄酸的色谱峰为参照峰，计算此色谱峰的保留时间和峰面积的RSD％值。

3.1精密度试验

按“1项”下方法制备样品，依照“2项”下色谱条件进行分析，取同一份供试品溶液连续进样6针，结果见表1，结果表明，该色谱峰的保留时间RSD％为0.29％，峰面积RSD％为0.20，表明仪器精密度良好。

表1精密度试验

3.2重复性试验

取同一批次的样品6贴，分别按“1项”下方法制备样品溶液，依照“2项”下色谱条件进行分析，结果见表2，结果表明，该色谱峰的保留时间RSD％为0.24，峰面积RSD％为4.60表明方法重复性良好，符合色谱指纹图谱研究的要求。

表2重复性试验

3.3样品溶液的稳定性

取精密度试验下的样品，分别在样品在0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h不同时间点进行测定，结果见表3。各该色谱峰的保留时间RSD％为？0.45，峰面积RSD％为0.25，表明供试品溶液的成分至少在72h内是稳定的。、

表3重复性试验

4、通络祛痛膏成品指纹图谱的测定

4.1指纹图谱的采集

按照“1”项下供试品溶液制备方法制备16批次的通络祛痛膏成品样品溶液，仪，取样品溶液依次进样，记录各批次的HPLC色谱图。分别进行测定。通过记录105min图谱(见图12)，可以看到80min再无色谱峰出现，从而确定指纹图谱的图谱分析时间确定为80min。

4.2 HPLC色谱条件

色谱条件同“2项”的HPLC色谱条件。

4.3通络祛痛膏成品HPLC色谱指纹图谱相似度的评价

国家药典委颁布的《中药色谱指纹相似度评价系统A版》软件和指纹图谱软件Chromap1.51版对通络祛痛膏成品和半成品胶浆的HPLC指纹图谱进行相似度分析。结果16批次通络祛痛膏的成品和标准指纹图谱的相似度计算结果均大于0.9(见图3和图6)，16批次的通络祛痛膏成品指纹图谱和标准指纹图谱的直观比较图(见图2和图5)，表明各批次通络祛痛膏成品各批次之间的具有良好的一致性，本方法可用于综合评价通络祛痛膏成品的整体质量。

Claims

1.一种通络祛痛膏的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(a)供试品溶液的制备：取通络祛痛膏1贴，置于具塞三角瓶中，精密加75％乙醇溶液30ml，称重，回流1h，冷却至室温，补足失重，提取溶液用0.45μm滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到通络祛痛膏的指纹图谱；

其中高效液相色谱条件为：色谱柱为资生堂MG分析柱4.6mm×250mm 5μm，采用梯度洗脱，流动相A为0.1％的磷酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序：

0分钟时，流动相A为60％，流动相B为40％；

40分钟时，流动相A为40％，流动相B为60％；

45分钟时，流动相A为30％，流动相B为70％；

75分钟时，流动相A为0％，流动相B为100％；

75.01分钟时，流动相A为60％，流动相B为40％；

105分钟，流动相A为60％，流动相B为40％；

流速1.0ml/min，进样量10μl，检测波长为250nm和280nm，柱温30℃。

2.一种通络祛痛膏半成品胶浆的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(a)供试品溶液的制备：取通络祛痛膏半成品胶浆1g，精密加75％乙醇溶液30ml，称重，回流1h，冷却至室温，补足失重，提取溶液用0.45μm滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法进行测定，得到通络祛痛膏半成品胶浆的指纹图谱；

0分钟时，流动相A为60％，流动相B为40％；

40分钟时，流动相A为40％，流动相B为60％；

45分钟时，流动相A为30％，流动相B为70％；

75分钟时，流动相A为0％，流动相B为100％；

75.01分钟时，流动相A为60％，流动相B为40％；

105分钟，流动相A为60％，流动相B为40％；