CN102706978B

CN102706978B - 一种野菊花提取物及其指纹图谱检测方法

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Publication number: CN102706978B
Application number: CN2012101784159A
Authority: CN
Inventors: 李铮; 刘洋; 胡宇驰; 汪国鹏; 潘艳丽; 方敏
Original assignee: BEIJING DRUG CONTROL INST
Current assignee: BEIJING DRUG CONTROL INST
Priority date: 2012-06-01
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2032-06-01
Also published as: CN102706978A

Abstract

本发明提供了一种野菊花提取物及其指纹图谱检测方法。具体地，制备野菊花提取物的方法包括以下步骤：将野菊花药材粉碎；加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟；再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟；提取液回收乙醇并浓缩、干燥，即得。还提供了由该方法制备得到的野菊花提取物，用指纹图谱方法检测和评价野菊花药材或野菊花提取物的方法，用指纹图谱方法检测和评价野菊花药材或野菊花提取物的方法，以及以原型吸收成分和/或代谢成分为指标用指纹图谱方法检测和评价野菊花药材或野菊花提取物的方法。本发明方法可以有效地用于野菊花或其提取物的质量控制。

Description

一种野菊花提取物及其指纹图谱检测方法

技术领域

本发明属于药物制备、药物分析和药物代谢技术领域。具体涉及中药野菊花提取物的制备，以及通过中药指纹图谱方法进行野菊花提取物质量检测和控制；一方面通过高效液相色谱(HPLC)指纹图谱针对野菊花活性成分进行多成分全面质量检测和控制，另一方面通过锁定原型吸收成分，进行具体成分的质量检测和控制。

背景技术

中药中含有多种化学成分，并被同时服用到体内，产生治疗作用。但中药内含化学成分的极性差距显著，经常是既含有极性很小的化学成分又含有极性很大的化学成分，单一溶剂通常难以提取出各类极性成分。所以采用不同极性试剂经两步或多步提取可尽量提取出各类剂型化学成分，保证提取物中各类成分的充分包含。另外，由于提取物中成分复杂，为了实现质量控制的目的，还需要科学有效的检测手段针对中药含有的化学成分进行检测。

指纹图谱技术是一种成熟的中药成分检测方法，在中药等植物药质量控制中的应用，已成为国内外公认的最有效手段之一。美国FDA在1996年颁布的《FDA关于植物制品的指南》和2004年的《植物药产品的行业指南》中，要求对植物原料、植物药中间品和植物药产品以指纹图谱进行质量控制，提出了建设性意见。英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会也接受色谱指纹图谱。中国国家食品药品监督管理局于2000年发布了《中药注射剂的指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，明确要求对新申请的中药注射剂和已上市的中药注射剂实行指纹图谱标准，中国国家药典委员会于2002年发布了《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》，对色谱指纹图谱的技术内容提出了指导性意见。化学成分色谱指纹图谱，尤其是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱直接显示多种具体化学成分的指纹特征信息，便于从成分整体上进行多成分质量控制，在国际上容易获得认可，因此中药采用HPLC指纹图谱进行质量控制，是国际认可、技术合理的有效质量控制手段。

采用具体某种中药内含成分进行中药质量控制，成分的选择直接决定中药质量控制水平的高低。最理想的备选成分是药效明确，机制清楚，原型吸收并达到靶点的长时间、高浓度驻留，但符合此高要求的成分常难明确，所以间接阻碍了中药质量控制水平的提升。但药效-质量关联的质控目标要求我们实践创新方法，逐渐接近目标；所以对中药多成分中主要通过吸收入血产生药效的情况开展研究，将可以原型吸收入血作为质控成分的筛选原则，可以更接近药效-质量关联的质控目标。

野菊花为菊科多年生草本植物野菊的头状花序，外形与菊花相似，野生于山坡草地、田边路旁。以色黄无梗、完整、气香、花未全开者为佳。野菊花含可广泛用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、风火赤眼、头痛眩晕等病证。同时又有很好的降压作用，可用于高血压病的辅助治疗。野菊花中的化学活性成分与其功效作用密切相关。其大多以适当形式吸收进入血液循环系统后，运送到相应的作用部位才能产生疗效。所以通过提取物指纹图谱与口服提取物后生物样品指纹图谱的比较分析，明确野菊花中的原型吸收成分作为检测具体成分，并结合野菊花总体成分指纹图谱综合进行质量控制，是创新性的检测和质控方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种野菊花提取物的制备方法，并运用HPLC指纹图谱的方法对其进行检测和质量控制。为实现此目的，一方面通过高效液相色谱(HPLC)指纹图谱进行多成分全面质量检测和控制，另一方面通过中药代谢方法锁定原型吸收成分，进行具体成分的质量检测和控制，使野菊花的药效物质更加明确。

为此，本发明第一方面提供了制备野菊花提取物的方法，其包括以下步骤：将野菊花药材粉碎；加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟；药再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟；提取液回收乙醇并浓缩、干燥，即得。

根据本发明第一方面的方法，其中水提取时，水的用量是药材重量的5-20倍，例如5-15倍，例如5-10倍。

根据本发明第一方面的方法，其中水提取时，是以煎煮的方式提取。在一个实施方案中，煎煮的时间为30-120分钟，例如30-90分钟，例如30-60分钟，例如约45分钟。

根据本发明第一方面的方法，其中水提取时，是以回流的方式提取。在一个实施方案中，回流的时间为30-120分钟，例如60-120分钟，例如约100分钟。

根据本发明第一方面的方法，其中加乙醇提取时，所用乙醇的量是水体积的1-2倍，优选1倍。

根据本发明第一方面的方法，其中乙醇提取时，是以回流的方式提取。在一个实施方案中，回流的时间为30-90分钟，例如30-60分钟，例如约45分钟。

本发明第二方面提供了一种野菊花提取物，其是基本上按照本发明第一方面的方法提取得到的。

本发明第二方面提供了一种野菊花提取物，其是以野菊花为药材经如下步骤的方法提取得到的：将野菊花药材粉碎；加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟；再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟；提取液回收乙醇并浓缩、干燥，即得。

根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中水提取时，水的用量是药材重量的5-20倍，例如5-15倍，例如5-10倍。

根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中水提取时，是以煎煮的方式提取。在一个实施方案中，煎煮的时间为30-90分钟，例如30-60分钟，例如约45分钟。

根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中水提取时，是以回流的方式提取。在一个实施方案中，回流的时间为30-120分钟，例如60-120分钟，例如约100分钟。

根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中加乙醇提取时，所用乙醇的量是水体积的1-2倍，优选1倍。

根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中乙醇提取时，是以回流的方式提取。在一个实施方案中，回流的时间为30-90分钟，例如30-60分钟，例如约45分钟。

本发明第三方面提供了用指纹图谱方法检测野菊花药材或野菊花提取物的方法，该方法包括如下步骤：

(a)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物，所述供测试的野菊花药材照本发明第一方面所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述供测试的野菊花提取物，二者可称为供试品，或者可称为供试品提取物)；

(b)另取对照的野菊花药材或对照的野菊花提取物，所述对照的野菊花药材照本发明第一方面所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述对照的野菊花提取物，二者可称为对照品，或者可称为对照品提取物)；

(c)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱(HPLC)分析；

(d)高效液相色谱条件为：色谱柱为C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；流速0.8~1.2ml/min；采用200-400nm波长紫外检测记录每一波长下成分响应值的方式检测；梯度洗脱方式为：

(e)吸取步骤(c)的供试品溶液和对照品溶液，分别将其注入高效液相色谱中，照(d)项所述色谱条件进行洗脱，分别得到供试品HPLC图和对照品HPLC图；

(f)比较步骤(e)所得供试品HPLC图和对照品HPLC图，如果二图峰形基本一致，表明供试品为野菊花正品或野菊花提取物正品，否则供试品不是野菊花正品或野菊花提取物正品。

根据本发明第三方面的方法，其中所述C₁₈色谱柱是Thermo scientificODS-2 Hypersil C₁₈色谱柱。在一个实施方案中，所述Thermo scientificODS-2 Hypersil C₁₈色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。

根据本发明第三方面的方法，其中(d)项所述流动相的流速为1.0ml/min。

根据本发明第三方面的方法，其中(d)项所述波长为267nm。

根据本发明第三方面的方法，其中(d)项中所述色谱柱的柱温控制在30℃。

本发明第四方面提供了用指纹图谱方法检测野菊花药材或野菊花提取物的方法，该方法包括如下步骤：

(i)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物，所述供测试的野菊花药材照本发明第一方面所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述供测试的野菊花提取物，二者可称为供试品，或者可称为供试品提取物)；

(ii)另取对照的野菊花药材或对照的野菊花提取物，所述对照的野菊花药材照本发明第一方面所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述对照的野菊花提取物，二者可称为对照品，或者可称为对照品提取物)；

(iii)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱(HPLC)分析；

(iv)高效液相色谱条件为：色谱柱为C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；流速0.8~1.2ml/min；采用200-400nm波长紫外检测记录每一波长下成分响应值的方式检测；梯度洗脱方式为：

(v)吸取步骤(iii)的供试品溶液和对照品溶液，分别将其注入高效液相色谱中，照(iv)项所述色谱条件进行洗脱，分别得到供试品HPLC图和对照品HPLC图；

(vi)比较步骤(v)所得供试品HPLC图和对照品HPLC图，如果二图峰形基本一致，表明供试品为野菊花正品或野菊花提取物正品，否则供试品不是野菊花正品或野菊花提取物正品；

(vii)使哺乳动物分别口服步骤(i)的供试品提取物或者步骤(ii)的对照品提取物，口服后0.5-10小时内取生物样品，提取该生物样品，得到生物供试品溶液(由步骤(i)的供试品提取物口服后获得)或生物对照品溶液(由步骤(ii)的对照品提取物口服后获得)；

(viii)吸取步骤(vii)的生物供试品溶液和生物对照品溶液，分别将其注入高效液相色谱中，照(iv)项所述色谱条件进行洗脱，分别得到生物供试品HPLC图和生物对照品HPLC图；

(ix)比较步骤(viii)所得生物供试品HPLC图和生物对照品HPLC图，如果二图峰形基本一致，表明供试品为野菊花正品或野菊花提取物正品，否则供试品不是野菊花正品或野菊花提取物正品。

本发明第四方面的方法可通过步骤(vi)和步骤(ix)两种方式以体外样品和体内样品来验证药物或提取物的真伪或质量。

根据本发明第四方面的方法，其中所述C₁₈色谱柱是Thermo scientificODS-2 Hypersil C₁₈色谱柱。在一个实施方案中，所述Thermo scientificODS-2 Hypersil C₁₈色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。

根据本发明第四方面的方法，其中(iv)项所述流动相的流速为1.0ml/min。

根据本发明第四方面的方法，其中(iv)项所述波长为267nm。

根据本发明第四方面的方法，其中(iv)项中所述色谱柱的柱温控制在30℃。

根据本发明第四方面的方法，其中(vii)项中所述生物样品选自血样、尿样及唾液样品。

根据本发明第四方面的方法，其中(vii)项中所述哺乳动物选自人、大鼠、小鼠、狗、猴等。在一个实施方案中，所述哺乳动物是大鼠。

本发明第五方面提供了以原型吸收成分和/或代谢成分为指标用指纹图谱方法检测野菊花药材或野菊花提取物的方法，该方法包括如下步骤：

(1)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物，所述供测试的野菊花药材照本发明第一方面所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述供测试的野菊花提取物，二者可称为供试品，或者可称为供试品提取物)；

(2)另取对照的野菊花药材或对照的野菊花提取物，所述对照的野菊花药材照本发明第一方面所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述对照的野菊花提取物，二者可称为对照品，或者可称为对照品提取物)；

(3)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱(HPLC)分析；

(4)高效液相色谱条件为：色谱柱为C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；流速0.8~1.2ml/min；采用200-400nm波长紫外检测记录每一波长下成分响应值的方式检测；梯度洗脱方式为：

(5)吸取步骤(3)的供试品溶液和对照品溶液，分别将其注入高效液相色谱中，照(4)项所述色谱条件进行洗脱，分别得到供试品HPLC图和对照品HPLC图；

(6)比较步骤(5)所得供试品HPLC图和对照品HPLC图，如果二图峰形基本一致，表明供试品为野菊花正品或野菊花提取物正品，否则供试品不是野菊花正品或野菊花提取物正品；

(7)使哺乳动物分别口服步骤(1)的供试品提取物或者步骤(2)的对照品提取物，口服后0.5-10小时内取生物样品，提取该生物样品，得到生物供试品溶液(由步骤(1)的供试品提取物口服后获得)或生物对照品溶液(由步骤(2)的对照品提取物口服后获得)；

(8)吸取步骤(7)的生物供试品溶液和生物对照品溶液，分别将其注入高效液相色谱中，照(4)项所述色谱条件进行洗脱，分别得到生物供试品HPLC图和生物对照品HPLC图；

(9)比较步骤(8)所得生物供试品HPLC图和生物对照品HPLC图，如果二图峰形基本一致，表明供试品为野菊花正品或野菊花提取物正品，否则供试品不是野菊花正品或野菊花提取物正品；

(10)比较步骤(5)的对照品溶液HPLC图与步骤(8)所得生物对照品HPLC图，确定对照品表征的原型吸收成分和/或代谢成分；

(11)比较步骤(5)的供试品溶液HPLC图与步骤(8)所得生物供试品HPLC图，如果该供试品显示具有与步骤(10)所述原型吸收成分和/或代谢成分色谱峰，则表明供试品为野菊花正品或野菊花提取物正品，否则供试品不是野菊花正品或野菊花提取物正品。

本发明第五方面的方法可通过步骤(6)和步骤(9)两种方式以体外样品和体内样品来验证药物或提取物的真伪或质量；同时步骤(10)和步骤(11)补充性地以原型吸收成分和/或代谢成分来验证药物或提取物的真伪或质量。

根据本发明第五方面的方法，其中所述C₁₈色谱柱是Thermo scientificODS-2 Hypersil C₁₈色谱柱。在一个实施方案中，所述Thermo scientificODS-2 Hypersil C₁₈色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。

根据本发明第五方面的方法，其中步骤(4)中所述流动相的流速为1.0ml/min。

根据本发明第五方面的方法，其中步骤(4)中所述波长为267nm。

根据本发明第五方面的方法，其中步骤(4)中所述色谱柱的柱温控制在30℃。

根据本发明第五方面的方法，其中步骤(7)中所述哺乳动物选自人、大鼠、小鼠、狗、猴等。在一个实施方案中，所述哺乳动物是大鼠。

根据本发明第五方面的方法，其中步骤(7)中所述生物样品包括但不限于血样、尿样及唾液样品。

根据本发明第五方面的方法，其中步骤(10)中获得2个代谢成分。在一个实施方案中，所述2个代谢成分的保留时间分别约为46.56min和47.90min。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明中，在获取生物样品时，例如获取本发明第五方面步骤(7)所述生物样品时，可以参考本领域的一般方法进行处理。例如，可以将实验动物(例如大鼠)或人口服野菊花提取物后的生物样品(如：血样、尿样及唾液样品)等通过加入3-5倍量甲醇、乙腈等提取成分，也可结合高氯酸等沉淀生物干扰物的方法除杂，涡旋混匀1-3min，4000-9000r/min离心3~5min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液，由此可以用于HPLC分析。

在本发明中，“约”、“基本上”等用语均可根据本领域的常规方式理解。例如，谱图峰形基本一致，应理解为谱图的保留时间、相对峰强的偏差均不超过20%。

在本发明中，在进行高效液相色谱(HPLC)分析时，可以使用C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；流速0.8~1.2ml/min；采用200-400nm波长紫外检测记录每一波长下成分响应值的方式检测；梯度洗脱方式可以为0min→5min→10min→15min→20min→25min→30min→40min→45min→50min→55min→60min，乙腈5%→5%→18%→18%→25%→25%→30%→55%→70%→75%→80%→80%。本发明人发现，使用Thermo scientific ODS-2Hypersil C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)时，如果上述梯度洗脱条件作细微改变(例如在每个时间点乙腈浓度改变10%以上时)，则难以获得原型吸收成分和代谢成分之间的有效色谱分离。

在本发明的一个实施方案中，特别是本发明第五方面的一个实施方案中，提供了野菊花药材高效液相色谱指纹图谱的测定方法，包括以下步骤：

(1)野菊花提取物的制备：采用先用水回流提取，再加入乙醇进行第二次回流提取的2步提取法，制备野菊花提取物。野菊花药材粉碎后，加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟，再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟，提取液回收乙醇并浓缩而得野菊花提取物；

(2)野菊花提取物的鉴定及指纹图谱质量检测：取提取物少量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后，滤液作为供试品溶液进行高效液相色谱(HPLC)分析，色谱柱为C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；流速0.8~1.2ml/min；采用200-400nm波长紫外检测记录每一波长下成分响应值的方式检测；梯度洗脱方式为：0min→5min→10min→15min→20min→25min→30min→40min→45min→50min→55min→60min，乙腈5%→5%→18%→18%→25%→25%→30%→55%→70%→75%→80%→80%；由此获得的野菊花提取物的HPLC指纹图谱，可用于药材或其提取物的鉴定和质量检测及控制；

(3)野菊花提取物中原型吸收成分的锁定，并用于质量评价：

将实验动物及人口服野菊花提取物后的生物样品(如：血样、尿样及唾液样品)等通过加入3-5倍量甲醇、乙腈等提取成分，也可结合高氯酸等沉淀生物干扰物的方法除杂，涡旋混匀1-3min，4000-9000r/min离心3~5min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液，进行高效液相色谱(HPLC)分析，使用C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；流速0.8~1.2ml/min；采用200-400nm波长紫外检测记录每一波长下成分响应值的方式检测；梯度洗脱方式为0min→5min→10min→15min→20min→25min→30min→40min→45min→50min→55min→60min，乙腈5%→5%→18%→18%→25%→25%→30%→55%→70%→75%→80%→80%；由此获得野菊花提取物的生物样品HPLC指纹图谱，并与野菊花提取物的HPLC指纹图谱比较，锁定原型吸收成分进行质量控制。

可见，本发明大体上提供了一种野菊花药材提取物的制备方法，并运用HPLC指纹图谱的方法对其进行质量检测。野菊花药材粉碎后，加水提取30-90分钟，再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟，提取液回收乙醇并浓缩而得野菊花提取物。取提取物少量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经微孔滤膜过滤后，滤液作为供试品溶液进行高效液相色谱(HPLC)分析，色谱柱为C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；采用梯度洗脱方式；采用200-400nm波长紫外检测记录每一波长下成分响应值的方式检测；获得野菊花提取物的HPLC指纹图谱，用于其整体质量控制。将实验动物及人口服野菊花提取物后的生物样品进行除杂处理后，进行相同HPLC条件下的指纹图谱实验，并与提取物指纹图谱比较，锁定原型吸收成分作为药材质控成分。

本发明具有如下显著的优点和用途：

(1)本发明提供的野菊花提取物中，既包含极性小成分，也包含极性大成分，成分种类全面；

(2)本发明通过HPLC色谱指纹图谱，既进行多成分全面检测，又对被吸收成分具体检测。

附图说明

图1是本发明提供的野菊花提取物色谱指纹图谱，图中显示了保留时间约为46.56min、47.90min处出现两个色谱峰。上述保留时间的色谱峰均并未出现在相应提取物的生物样品中，是新色谱峰(即代谢成分)。

具体实施方式

下面通过具体的实施例/实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

本发明的优选实施例如下(该优选实施例的任一技术特征或者参数均可各自独立地或者组合地适用于本发明第一至第五方面的任一实施方案)：

(1)仪器和药品：使用Waters1525高效液相色谱仪；LG16-W高速离心机；QL-901涡旋混合器；野菊花药材购于中草药商店；其他试剂为色谱纯或分析纯。

(2)动物：清洁级健康SD大鼠，240~260g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供；合格证号：SCXK(京)2006-2009。饲养于符合国家标准的屏障环境中，室温22~24℃，相对湿度60%，常规饲养喂养，自由饮水。

(3)供试品溶液的制备：精密称取药材粉末10g，置于容量瓶中，加入70ml的蒸馏水溶液，加热回流50min，再加入水体积2倍的95%乙醇继续加热回流提取60分钟，滤液冷却后取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

(4)指纹图谱的制作：色谱柱为Thermo scientific ODS-2Hypersil C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；采用梯度洗脱方式0min→5min→10min→15min→20min→25min→30min→40min→45min→50min→55min→60min，乙腈5%→5%→18%→18%→25%→25%→30%→55%→70%→75%→80%→80%；流速1ml/min；检测波长267nm；柱温30℃；在此条件下分析供试品溶液，得到野菊花药材的指纹图谱；

(5)野菊花血清样品的制备：SD大鼠，250g，灌胃给予野菊花水提液4ml，1h后腹主动脉取血6ml，9000r/min离心3min，取上层血清，加5倍量甲醇沉淀蛋白，涡旋混匀2min，9000r/min离心5min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；按野菊花药材指纹图谱条件测定；

(6)野菊花入血成分的确定：通过野菊花药材与血清指纹图谱比较，野菊花药材大鼠灌胃后，2个代谢成分。保留时间分别为：46.56min和47.90min。

Claims

1.一种野菊花药材或野菊花提取物的指纹图谱检测方法，该方法包括如下步骤：

(a)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物；所述供测试的野菊花药材照如下方法制备提取物：将野菊花药材粉碎，加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟，再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟，提取液回收乙醇并浓缩、干燥，即得；供测试的野菊花药材经提取所得提取物以及所述供测试的野菊花提取物二者称为供试品提取物；

(b)另取对照的野菊花药材或对照的野菊花提取物；所述对照的野菊花药材照步骤(a)所述提取物制备方法制备其提取物；对照的野菊花药材经提取所得提取物以及所述对照的野菊花提取物二者称为对照品提取物；

(c)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱分析；

(d)高效液相色谱条件为：色谱柱为Thermo scientific ODS-2Hypersil C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；流速0.8～1.2ml/min；采用267nm波长紫外检测；梯度洗脱方式为：

0min→ 5min→ 10min→ 15min→ 20min→ 25min→ 乙腈 5%→ 5%→ 18%→ 18%→ 25%→ 25%→ 30minV 40min→ 45min→ 50min→ 55min→ 60min 乙腈 30%→ 55%→ 70%→ 75%→ 80%→ 80%

(f)比较步骤(e)所得供试品HPLC图和对照品HPLC图。

2.一种野菊花药材或野菊花提取物的指纹图谱检测方法，该方法包括如下步骤：

(i)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物；所述供测试的野菊花药材照如下方法制备提取物：将野菊花药材粉碎，加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟，再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟，提取液回收乙醇并浓缩、干燥，即得；供测试的野菊花药材经提取所得提取物以及所述供测试的野菊花提取物二者称为供试品提取物；

(ii)另取对照的野菊花药材或对照的野菊花提取物；所述对照的野菊花药材照步骤(i)所述提取物制备方法制备其提取物；对照的野菊花药材经提取所得提取物以及所述对照的野菊花提取物二者称为对照品提取物；

(iii)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱分析；

(iv)高效液相色谱条件为：色谱柱为Thermo scientific ODS-2Hypersil C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；流速0.8～1.2ml/min；采用267nm波长紫外检测；梯度洗脱方式为：

0min→ 5min→ l0min→ l5min→ 20min→ 25min→ 乙腈 5%→ 5%→ 18%→ 18%→ 25%→ 25%→ 30min→ 40min→ 45min→ 50min→ 55min→ 60min 乙腈 30%→ 55%→ 70%→ 75%→ 80%→ 80%

(vi)比较步骤(v)所得供试品HPLC图和对照品HPLC图；

(vii)使哺乳动物分别口服步骤(i)的供试品提取物或者步骤(ii)的对照品提取物，口服后0.5-10小时内取生物样品，提取该生物样品，得到由步骤(i)的供试品提取物口服后获得的生物供试品溶液或由步骤(ii)的对照品提取物口服后获得的生物对照品溶液；

(ix)比较步骤(viii)所得生物供试品HPLC图和生物对照品HPLC图。

3.根据权利要求2所述的方法，其中：所述C₁₈色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。

4.根据权利要求2所述的方法，其中(iv)项所述流动相的流速为1.0ml/min。

5.根据权利要求2所述的方法，其中(iv)项中所述色谱柱的柱温控制在30℃。

6.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(vii)中所述哺乳动物选自人、大鼠、小鼠、狗、猴。

7.一种以原型吸收成分和/或代谢成分为指标的野菊花药材或野菊花提取物的指纹图谱检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物；所述供测试的野菊花药材照如下方法制备提取物：将野菊花药材粉碎，加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟，再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟，提取液回收乙醇并浓缩、干燥，即得；供测试的野菊花药材经提取所得提取物以及所述供测试的野菊花提取物二者称为供试品提取物；

(2)另取对照的野菊花药材或对照的野菊花提取物；所述对照的野菊花药材照步骤(1)所述提取物制备方法制备其提取物；对照的野菊花药材经提取所得提取物以及所述对照的野菊花提取物二者称为对照品提取物；

(3)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱分析；

(4)高效液相色谱条件为：色谱柱为Thermo scientific ODS-2Hypersil C₁₈色谱柱，流动相为0.1%的磷酸水溶液-乙腈；流速0.8～1.2ml/min；采用267nm波长紫外检测；梯度洗脱方式为：

0min→ 5min→ 10min→ 15min→ 20min→ 25min→ 乙腈 5%→ 5%→ 18%→ 18%→ 25%→ 25%→ 30min→ 40min→ 45min→ 50min→ 55min→ 60min 乙腈 30%→ 55%→ 70%→ 75%→ 80%→ 80%

(6)比较步骤(5)所得供试品HPLC图和对照品HPLC图；

(7)使哺乳动物分别口服步骤(1)的供试品提取物或者步骤(2)的对照品提取物，口服后0.5-10小时内取生物样品，提取该生物样品，得到由步骤(1)的供试品提取物口服后获得的生物供试品溶液或由步骤(2)的对照品提取物口服后获得的生物对照品溶液；

(9)比较步骤(8)所得生物供试品HPLC图和生物对照品HPLC图；

(11)比较步骤(5)的供试品溶液HPLC图与步骤(8)所得生物供试品HPLC图。

8.根据权利要求7的方法，其中：所述C₁₈色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。

9.根据权利要求7的方法，其中(4)项所述流动相的流速为1ml/min。

10.根据权利要求7的方法，其中(4)项中所述色谱柱的柱温控制在30℃。

11.根据权利要求7的方法，其中步骤(7)中所述哺乳动物选自人、大鼠、小鼠、狗、猴。

12.根据权利要求7的方法，其中步骤(7)中所述生物样品选自血样、尿样及唾液样品。

13.根据权利要求7的方法，其中步骤(10)中获得2个代谢成分，其保留时间分别为46.56min和47.90min。