CN113125620B

CN113125620B - 具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法

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Publication number: CN113125620B
Application number: CN202110381203.XA
Authority: CN
Inventors: 杨海军; 张宁; 刘美辉; 吴洁; 曾庆琪
Original assignee: Jiangsu Health Vocational College
Current assignee: Jiangsu Health Vocational College
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN113125620A

Abstract

本发明公开了具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，它包括步骤1、供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将中药组合物的指纹图谱仪器导出，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次中药组合物的的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成中药组合物的的对照指纹图谱；将中药组合物的指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认主要成分峰。本发明所提供的中药组合物的指纹图谱，能全面，客观地表征中药组合物的的质量。且检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药组合物的检测方法，具体涉及具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法。

背景技术

本中药复方由炒薏仁、炒芡实、肉桂、茯苓、干姜、覆盆子药味成分组成，具有温阳补肾、固精益神、温煦四肢和强腰健体的功效，对脾肾阳虚所致的呕吐泄泻，四肢发凉，畏寒怕冷，腰膝酸软，头晕耳鸣，肾虚遗精，尿频白浊等症状有一定的缓解作用，对改善性功能也有一定的帮助。适合手脚怕冷、容易泄泻、腰膝酸软、经常头晕没力气、尿频、经常耳鸣，头晕眼花和遗精及需要改善性功能的人群。

目前关于该中药组合物的的质量检测方法较少。本发明采用高效液相色谱法建立具有补肾壮阳作用的中药组合物的的指纹图谱检测方法，为具有补肾壮阳作用的中药组合物的的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种具有补肾壮阳作用的中药组合物的的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价具有补肾壮阳作用的中药组合物的的质量，对控制具有补肾壮阳作用的中药组合物的的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品，置于圆底瓶中，加甲醇或乙醇溶液，超声或回流提取，过滤，滤液置于容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

精密称定桂皮醛、6-姜酚、8-姜酚和6-姜烯酚对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；

步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的具有补肾壮阳作用的中药组合物的供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次具有补肾壮阳作用的中药组合物的的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成具有补肾壮阳作用的中药组合物的的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；

步骤5，将步骤3中获得的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱和混合标准品图谱进行比对。

作为优选方案，以上所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤1具有补肾壮阳作用的中药组合物的供试品溶液制备方法为：取8批次的具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品20g，置1000mL锥形瓶中，置于圆底瓶中，加乙醇溶液200.0mL，超声提取30分钟，过滤，滤液置于1000mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：精密称定桂皮醛、6-姜酚、 8-姜酚、6-姜烯酚对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.055mg/mL桂皮醛、0.045mg/mL的6-姜酚、0.052mg/mL 8-姜酚、0.048mg/mL6-姜烯酚组成的混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：210nm，柱温40℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

程序	时间（min）	乙腈体积（%）
			1	0	5
2	20	25
			3	30	25
4	40	32
			5	60	65
6	80	80
			7	95	70

作为优选方案，以上所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，指纹谱图中共有峰10个。其保留时间分别为1号峰36.903min、2号峰41.016min、3号峰47.561min、4号峰58.117min、5号峰60.147min、6号峰67.858min、7号峰72.924min、8号峰79.064min、9号峰84.143min，10号峰89.821，其中1号峰为桂皮醛、3号峰为6-姜酚、5号峰为8-姜酚、7号峰为6-姜烯酚。

指纹图谱检测条件的优化：

1、在样品溶液的制备优化方面

本发明通过对不同提取方法（超声、回流、渗漉等）及不同提取溶剂（甲醇、水、70%乙醇水溶液、85%乙醇水溶液、95%乙醇、无水乙醇）、进行实验比较，结果发现超声提取所得的谱图成分比较全面，分离度良好，故采用超声提取的方法；对提取溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高；故选用甲醇进行提取。

2、在色谱条件进行优化方面

本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取210nm、230nm、254nm、280nm处的色谱图，发现检测波长为210nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选210nm为检测波长；

本发明对流速（1mL/min、0.9mL/min、0.8mL/min）进行筛选，发现具有补肾壮阳作用的中药组合物的中的成分中在流速为1mL/min梯度条件下能够有效地将极性相近的物质分开，各特征峰分离情况较好，故选用流速为1mL/min。

本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸，乙腈和0.05%磷酸水，乙腈-0.1%磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.1%磷酸水为流动相时，具有补肾壮阳作用的中药组合物的中各成分分离效果较好且峰形较为美观，故最终选定以乙腈和0.1%磷酸水为流动相。

在确定最佳流动性组成后，本发明通过大量实验筛选最佳的梯度洗脱程序，实验发现，当采用0~20min 乙腈体积5%~25%；20~30min 乙腈体积25%~25%；30~40min 乙腈体积25%~32%；40~50min 乙腈体积32%~65%；60~80min 乙腈体积65%~70%；80~95min 乙腈体积70%~100%时可实现指纹图谱中各色谱峰的良好分离度。

作为优选方案，以上所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，具有补肾壮阳作用的中药组合物的的药味组成和配比为：炒薏苡仁15~45份、炒芡实15~45份、肉桂15~45份、茯苓17~34份、干姜15~45份、覆盆子15~45份。

作为更加优选方案，以上所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，具有补肾壮阳作用的中药组合物的的药味组成和配比为：炒薏苡仁30份、炒芡实30份、肉桂30份、茯苓30份、干姜30份、覆盆子30份。

有益效果：

1、本发明根据具有补肾壮阳作用的中药组合物的中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价具有补肾壮阳作用的中药组合物的的质量，为保证临床具有补肾壮阳作用的中药组合物的疗效具有重要意义。

2、用本发明所提供的方法所建立的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱，能有效地表征具有补肾壮阳作用的中药组合物的的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定具有补肾壮阳作用的中药组合物的质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明提供的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为本发明混合对照品的色谱图。

图2为本发明的具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品的对照指纹图谱。

图3为本发明具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品的8批次供试品指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例用到的仪器与试剂如下：

实验器材

1.1仪器

日本岛津公司全波段扫描（200-800nm）高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱CTO-20A。

1.2药品与试剂

桂皮醛对照品购自中国药品生物制品检定所；6-姜酚、8-姜酚和6-姜烯酚对照品购自成都维克奇生物科技有限公司；甲醇（分析纯）；磷酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）；水（超纯水）。

实施例1 一种具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

步骤1，具有补肾壮阳作用的中药组合物的供试品溶液的制备：

取8批次的具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品18g（炒薏苡仁3g、炒芡实3g、肉桂3g、茯苓3g、干姜3g、覆盆子3g）置100mL圆底瓶中，加甲醇溶液50mL，超声提取30min，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

精密称定桂皮醛、6-姜酚、 8-姜酚、6-姜烯酚对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.055mg/mL桂皮醛、0.045mg/mL的6-姜酚、0.052mg/mL 8-姜酚、0.048mg/mL6-姜烯酚组成的混合对照品溶液。

步骤3，分别精密吸取8批具有补肾壮阳作用的中药组合物的供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：210nm，柱温40℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

步骤4，将步骤3中获得的8批具有补肾壮阳作用的中药组合物的供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择8批次具有补肾壮阳作用的中药组合物的的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成1批次具有补肾壮阳作用的中药组合物的的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果1批生品具有补肾壮阳作用的中药组合物的中有10个共有峰，对照指纹图谱见图2，8批次供试品的指纹图谱如图3所示。

步骤5，步骤3中获得的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认主要成分，对比出具有补肾壮阳作用的中药组合物的图2和图3中其中1号峰为桂皮醛、3号峰为6-姜酚、5号峰为8-姜酚、7号峰为6-姜烯酚。

同时本发明使用自动生成的对照HPLC指纹图谱R来生成共有色谱峰模式，分析计算8批具有补肾壮阳作用的中药组合物的中药共有色谱峰之间具有相对很好的相似性，说明该方法建立的具有补肾壮阳作用的中药组合物的中药建立的指纹图谱能够很好的检测中药组合物的的质量，结果如表1。

表1各批次样品与共有模式间的相似度

	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	R
										S1	1	0.931	0.986	0.825	0.895	0.916	0.924	0.915	0.985
S2	0.931	1	0.889	0.965	0.939	0.953	0.91	0.952	0.931
										S3	0.986	0.889	1	0.944	0.961	0.914	0.937	0.916	0.932
S4	0.825	0.965	0.944	1	0.914	0.949	0.936	0.911	0.894
										S5	0.895	0.939	0.961	0.914	1	0.89	0.908	0.903	0.981
S6	0.916	0.953	0.914	0.949	0.89	1	0.912	0.938	0.947
										S7	0.924	0.91	0.937	0.936	0.908	0.912	1	0.908	0.924
S8	0.915	0.952	0.916	0.911	0.903	0.938	0.908	1	0.953
										R	0.985	0.931	0.932	0.894	0.981	0.947	0.924	0.953	1

实施例2指纹图谱检测的方法学研究：

1、方法学考察

1.1精密度考察

取具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品18g，按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10μL，按上述实施例1色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，对色谱图中10个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于0.8%，共有峰峰面积RSD均小于1.8%，说明仪器精密度较好。

1.2稳定性考察

取具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品18g，按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0，2，4，8，12，24h进样，记录色谱图，对色谱图中10个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.9%，共有峰峰面积RSD均小于2.1%，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。

1.3重复性考察

取具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品6份，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中10个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.7%，共有峰峰面积RSD均小于1.0%，说明该方法重复性良好。

以上实验结果表明，本发明提供的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价具有补肾壮阳作用的中药组合物的的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

实施例3 功能性实验

1、一种具有补肾壮阳作用的中药组合物，它是由下列重量的原料组成：炒薏苡仁30g、炒芡实30g、肉桂30g、茯苓30g、干姜30g、覆盆子30g。

2、具有补肾壮阳作用的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：取：炒薏苡仁30g、炒芡实30g、肉桂30g、茯苓30g、干姜30g、覆盆子30g，分别加总药材重量分别为10倍、8倍和8倍的乙醇回流提取3次，前2次1小时，第3次1小时，合并三次提取液，浓缩，得到浸膏。加入适量药学上可接受的玉米淀粉、环糊精制备成片剂。每片含有浸膏0.6g。

3、选取20例，手脚冰凉，畏寒怕冷，胃脘疼痛，大便糖稀，兼有早泄的患者。每天服用以上制备得到的片剂4片，每天3次。连续服用1个月，有14人手脚温和，怕冷症状明显减轻。10人胃脘疼痛减弱，大便正常，总有效率为70%。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品，置于圆底瓶中，加甲醇或乙醇溶液，超声提取，过滤，滤液置于容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

步骤5，将步骤3中获得的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱和混合标准品图谱进行比对；

所述的步骤1的中药组合物由薏苡仁15~45份、炒芡实15~45份、肉桂15~45份、茯苓17~34份、干姜15~45份、覆盆子15~45份组成；

步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：210nm，柱温40℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

程序时间/min 乙腈体积/% 1 0 5 2 20 25 3 30 25 4 40 32 5 60 65 6 80 80 7 95 70

。

2.根据权利要求1所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤1具有补肾壮阳作用的中药组合物的供试品溶液制备方法为：取8批次的具有补肾壮阳作用的中药组合物的样品20g，置1000mL圆底瓶中，加乙醇溶液200mL，超声提取30分钟，过滤，滤液置于1000mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤2混合对照品溶液的制备：精密称定桂皮醛、6-姜酚、 8-姜酚、6-姜烯酚对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.055mg/mL的桂皮醛、0.045mg/mL的6-姜酚、0.052mg/mL 的8-姜酚、0.048mg/mL的6-姜烯酚组成的混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有10个峰，其保留时间分别为1号峰36.903min、2号峰41.016min、3号峰47.561min、4号峰58.117min、5号峰60.147min、6号峰67.858min、7号峰72.924min、8号峰79.064min、9号峰84.143min，10号峰89.821min，其中1号峰为桂皮醛、3号峰为6-姜酚、5号峰为8-姜酚、7号峰为6-姜烯酚。

5.根据权利要求1所述的具有补肾壮阳作用的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，具有补肾壮阳作用的中药组合物的药味组成和配比为：炒薏苡仁30份、炒芡实30份、肉桂30份、茯苓30份、干姜30份、覆盆子30份。