KR101831436B1

KR101831436B1 - 크로마토그래프지문의 유사성 비교를 통한 원료의 품질 평가 방법

Info

Publication number: KR101831436B1
Application number: KR1020170068100A
Authority: KR
Inventors: 권성원; 박정일; 이광진; 이성임; 임요한
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2018-02-22

Abstract

본 발명은 크로마토그래프지문의 유사성 비교를 통한 원료의 품질 평가 방법에 관한 것으로, 본 발명을 이용하면 원료 내 대사체 성분 정보에 대한 이해(시너지효과와 직결된 성분들의 조성비율, 성분들의 부분적/전반적 농도 이상 등)가 직관적으로 가능하다. 따라서, 복합 유사성 지표와 통계 분석을 통해 원료를 품질평가 함으로써 더 엄격하고 과학적으로 생약 원료의 품질을 판단할 수 있다.

Description

크로마토그래프지문의 유사성 비교를 통한 원료의 품질 평가 방법{A method for evaluating the quality of raw materials by comparing the similarity of chromatographic fingerprints}

본 발명은 크로마토그래프지문의 유사성 비교를 통한 원료의 품질 평가 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 본 발명은 (a) 평가대상 원료의 대사체를 추출하는 단계; (b) 상기 원료의 대사체 정보(크로마토그램)를 크로마토그래피법에 의해 수득하는 단계; (c) 상기 크로마토그램에서 기준 원료의 크로마토그램의 각 검출 피크에 상응하는 i번째 피크에 대한 면적값(yi)을 각각 산출하여 평가대상 원료의 데이터 벡터로 산출하는 단계; (d) 기준원료의 크로마토그램의 각 검출 피크에 대한 면적값(xi)의 데이터 벡터 (기준원료의 데이터 벡터)와 상기 (b) 단계의 평가대상 원료의 데이터 벡터의 코사인 유사도 (cosine similarity, index c)를 산출하는 단계; (e) 상기 코사인 유사도가 임계값 이상인 평가대상 원료의 데이터 벡터와 기준원료의 데이터 벡터간의 상대값의 평균 (index a) 및 상기 상대값의 최대 차이 (index m)를 산출하는 단계; 및 (f) 상기 산출된 index c, a 및 m에 따라 통계모델을 구축하여 기준 원료 대비 평가대상 원료의 품질을 평가하는 단계를 포함하는 원료의 품질 평가 방법에 관한 것이다.

국내에서 유통되고 있는 생약의 80%가 중국 등에서 수입되고 있다. FTA와 같은 세계 무역경제의 글로벌화에 따라 수많은 생약이 외국에서 수입될 경우, 원산지 및 그 품질을 점검, 관리할 수 있는 시험법 개발이 필요하다. 유통되는 생약의 유효성분은 개체마다 차이가 매우 크다. 따라서, 생약 원료의 화학적 성분에 근거한 품질 구분은 의약산업의 건전한 발전 및 국민 건강을 위해 필수적이다.

전통적으로 생약의 품질 구분에는 형태학적, 세포학적, 해부학적 및 생리학적 방법이 사용되어 왔다.

형태학적인 평가는 생약의 형태, 크기, 색깔, 표면의 특징, 냄새, 맛 등 오감에 의한 외부 형태학적 평가 즉, 경험을 바탕으로 하는 관능검사와 현미경 감별에 의한 내부 형태학적 평가로 구분된다. 그러나, 많은 경우에 감별자의 주관적인 관점에 의존할 뿐 아니라 대부분의 생약이 가공하지 않은 상태(crude drug)로 존재하는 것만이 아니고, 가루로 가공되거나 절편으로 잘려 구분이 용이하지 않다.

이화학적인 평가는 대한약전 또는 대한약전외한약(생약)규격집의 규격시험으로서 생약의 특성에 따라 건조감량, 회분시험, 산불용성시험, 엑스함량 및 정유함량시험을 선별적으로 시험하고, 그 생약이 함유하고 있는 성분을 정성반응이나 박층크로마토그래프법 등으로 확인한다. 경우에 따라서는 약효성분 또는 지표성분에 대한 함량시험을 흡광도 측정법, 액체크로마토그래프법 또는 기체크로마토그래프법으로 시험하고 있다.

고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC)와 다수 자외선 파장을 동시 분석할 수 있는 다이오드어레이검출기(Diode array detector, DAD)의 조합은 결과를 쉽게 재현할 수 있고 검출 감도가 높아 생약 원료 분석에 보편적으로 사용된다. 그러나, 크로마토그래프법을 이용한 지표 성분 함량 평가는 표준물질이 대개 비싼 가격을 형성하고 있다는 것과 다양한 유효성분의 영향을 품질결정에 반영하지 못하는 단점이 있다.

크로마토그래프법을 이용한 다른 방법인 단일 유사성 지표를 이용한 크로마토그래프지문 평가의 경우, 잘 알려진 유사성 지표를 이용, 크로마토그래프지문의 유사성을 평가하여 품질을 결정하지만 실제 많은 원료들은 그 크로마토그래프지문으로부터 다차원 데이터를 형성하였을 때 크게 차이 나는 다양한 값으로 구성되어 있어 현재 활용되는 지표만을 적용하는 것은 품질 평가에 오류를 발생시켜 적절하지 않다.

이에 본 발명자들은 유사성을 다양한 관점에서 정확하게 평가하여, 기준원료와 동일하거나 그와 상응하는 품질의 원료를 찾아내기 위해 기존 방법과 달리 복합 유사성 지표를 이용하여 원료의 품질 평가 방법을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은

(a) 평가대상 원료의 대사체를 추출하는 단계;

(b) 상기 원료의 대사체 정보(크로마토그램)를 크로마토그래피법에 의해 수득하는 단계;

(c) 상기 크로마토그램에서 기준 원료의 크로마토그램의 각 검출 피크에 상응하는 i번째 피크에 대한 면적값(yi)을 각각 산출하여 평가대상 원료의 데이터 벡터로 산출하는 단계;

(d) 기준원료의 크로마토그램의 각 검출 피크에 대한 면적값(xi)의 데이터 벡터 (기준원료의 데이터 벡터)와 상기 (b) 단계의 평가대상 원료의 데이터 벡터의 코사인 유사도 (cosine similarity, index c)를 산출하는 단계;

(e) 상기 코사인 유사도가 임계값 이상인 평가대상 원료의 데이터 벡터와 기준원료의 데이터 벡터간의 상대값의 평균 (index a) 및 상기 상대값의 최대 차이 (index m)를 산출하는 단계; 및

(f) 상기 산출된 index c, a 및 m에 따라 통계모델을 구축하여 기준 원료 대비 평가대상 원료의 품질을 평가하는 단계를 포함하는 원료의 품질 평가 방법을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

(a) 평가대상 원료의 대사체를 추출하는 단계;

(f) 상기 산출된 index c, a 및 m에 따라 통계모델을 구축하여 기준 원료 대비 평가대상 원료의 품질을 평가하는 단계를 포함하는 원료의 품질 평가 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

(a) 평가대상 원료의 대사체를 추출하는 단계;

본 발명의 방법에서 상기 (a) 단계는 평가대상 원료의 대사체를 추출하는 단계이다.

상기 ‘평가대상 원료’는 평가자가 평가하고자 하는 원료일 수 있다.

상기 평가대상 원료의 대사체는 기준 원료 대사체를 추출하면서 동일한 실험 조건에서 추출되는 것이거나, 기준 원료 대사체가 기존에 존재하여 평가대상 원료의 대사체만 따로 추출되는 것일 수 있다.

본 발명의 방법에서 상기 ‘원료’는 종류가 제한되지 않으며, 천연물, 식품, 식물 등을 다양하게 포함할 수 있다. 상기 ‘원료’는 삽주(Atractylodes japonica Koidzumi), 백출(Atractylodes macrocephala Koidzumi), 갈근, 감초, 강활, 강황, 건강, 계지, 고본, 고삼, 구기자, 금은화, 길경, 단삼, 당귀, 대황, 도인, 독활, 마황, 맥문동, 목통, 목향, 박하, 반하, 방기, 방풍, 백지, 복령, 복분자, 사인, 산수유, 산약, 산조인, 삼칠, 상엽, 상백피, 상심자, 생강, 생지황, 석창포, 세신, 숙지황, 승마, 시호, 신이, 애엽, 연교, 오가피, 오미자, 용담, 우슬, 울금, 육계, 육두구, 원지, 익모초, 인삼, 인진호, 자소엽, 작약, 지모, 지실, 진피, 차전자, 창출, 천궁, 천마, 천남성, 천문동, 청피, 치자, 택사, 포공영, 하고초, 하수오, 행인, 향부자, 현삼, 현호색, 형개, 홍삼, 홍화, 황금, 황기, 황련, 황백, 회향, 후박, 흑삼 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 대사체란 대사(metabolism) 과정에서 생성되는 물질로, 본 명세서에서는 품질 판별에 기준이 되는 성분을 의미한다. 본 발명의 실시예에서는 백출과 삽주의 대사체를 추출하여 비교하였으나, 위의 실시예에 한정되지 않는다.

상기 대사체를 추출하는 방법은 대사체 분석 분야에 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이라면 제한 없이 선택하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등으로 대사체를 추출할 수 있다.

또한 추출 용매로는 물, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 주정, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군에서 선택하여 대사체 추출물을 제조할 수 있으나, 그 추출 용매에 한정되지 않는다.

상기 (b) 단계는 상기 원료의 대사체 정보(크로마토그램)를 크로마토그래피법에 의해 수득하는 단계이다.

상기 ‘크로마토그램’은 특수 검출기를 통해 추출물을 통과시킴으로써 검출되는 성분들에 대한 UV/VIS 흡광도, 이온화 강도, 핵자기 공명 시그널, 광산란도, 반사 지수 및 다른 물리적 성질에 기초하는 크로마토그래피 분석 결과의 도해를 말한다.

상기 크로마토그래피는 바람직하게는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, high performance (high pressure) liquid chromatography의 약어)로 물질의 혼합물을 분리하는 확립된 수단인데, 생화학, 분석화학과 임상화학에서 널리 쓰인다. 상기 ‘HPLC’는 가장 간단한 경우에 이동상(mobile phase)을 담고 있는 용리액 저장조(eluent reservoir)를 갖춘 펌프, 시료 부가 시스템, 정지상(stationary phase)을 담고 있는 분리용 컬럼과 감지기로 이루어진다. 덧붙여서 분획 수집기(fraction collector)를 더 갖추고 있을 수 있는데, 여기서는 분리 후 각각을 따로 수집하여 추후 용도에 사용하는 것이 가능하다. 상기 크로마토그래피는 기준 원료 및 평가대상 원료의 대사체 성분 수준 측정 시 크로마토그래피 실시가 동일한 조건 하에서 행해지는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 조건은 컬럼의 종류, 온도, 이동상 속도, 전개 용액의 종류일 수 있다.

상기 ‘크로마토그램’은 대사체 수준을 측정한 것으로 공지된 것이라면 제한 없이 선택하여 얻을 수 있으나, 구체적으로 자외선(UV)/가시광선(Visible) 검출기, 질량 분광계(MS) 검출기, 핵자기공명(NMR) 검출기, 반사지수(RI) 검출기, 광산란 검출기(ELSD)를 이용하여 크로마토그램 결과를 측정할 수 있다. 상기 자외선/가시광선 검출기는 DAD일 수 있다.

상기 ‘DAD’는 Diode Array Detector의 약자로, 투명한 셀에 빛을 조사했을 때 흡수되는 흡광도에 따라 물질을 검출한다. 전 파장을 한 번에 찍는 장점이 있으며, 분석이 진행된 후에 원하는 파장을 골라서 확인할 수 있다. 본 발명의 DAD의 파장은 바람직하게는 200 내지 750 nm의 영역 또는 200 내지 400 nm 영역에서 측정한 결과를 분석한 것일 수 있다.

상기 (b)단계는 (c)단계의 데이터 벡터를 계산하기 위해 먼저 크로마토그램을 크로마토그래피법에 의해 수득하는 것을 의미한다.

상기 (c) 단계는 상기 크로마토그램에서 기준 원료의 크로마토그램의 각 검출 피크에 상응하는 피크에 대한 면적 값(yi)을 각각 산출하여 평가대상 원료의 데이터 벡터로 산출하는 단계이다.

구체적으로, 기준 원료의 성분(Peak)을 나타낸 검출 피크를 기준으로 하여, 그에 상응하는 피크에 해당하는 면적(Area) 값을 각각 산출하여 데이터 벡터를 산출할 수 있다.

보다 구체적인 과정은 다음과 같다.

먼저, 시간에 따라 검출되는 물질(피크)들을 크로마토그램끼리 매칭시킨다. 이 때, 같은 시간에 검출되는 물질이 동일한지를 검증하기 위해서 분석 결과 얻어지는 스펙트럼을 활용한다.

두 물질이 같은 시간에 검출되고 스펙트럼이 동일하다면 같은 물질로 간주하고, 기준 원료를 기준으로 피크 순서 및 면적을 계산하여 데이터 벡터를 산출한다.

상기 (d) 단계는 기준원료의 크로마토그램의 각 검출 피크에 대한 면적값(xi)의 데이터 벡터 (기준원료의 데이터 벡터)와 상기 (b) 단계의 평가대상 원료의 데이터 벡터의 코사인 유사도 (cosine similarity, index c)를 산출하는 단계이다.

본 발명의 상기 코사인 유사도는 동일한 양의 원료를 기준으로 측정하며, 그 구체적인 내용 및 계산식은 다음과 같다.

xi : 기준 시료의 크로마토그램 i번째 피크 면적

yi : 평가 대상 시료의 크로마토그램 i번째 피크 면적

n : 총 피크의 개수

상기 총 피크의 개수는 일반적으로 피크의 높이가 크로마토그램 노이즈의 높이보다 3 배 이상인 것(검출한계 이상인 것)을 모두 포함한 수이다.

상기 코사인 유사도는 평가 대상 시료의 성분 조성비율이 기준 시료의 것과 동등한지 평가한 값이다. 조성비율이 동일하면 지표 값은 1이다. 동일하지 않은 경우 지표 값은 0까지 작아진다.

<계산식 1>

상기 (e) 단계는 상기 코사인 유사도가 임계값 이상인 평가대상 원료의 데이터 벡터와 기준원료의 데이터 벡터간의 상대값의 평균 (index a) 및 상기 상대값의 최대 차이 (index m)를 산출하는 단계이다.

상기 코사인 유사도가 임계값 이상인 평가대상 원료를 선별하는 것은 구체적으로 다음과 같다.

평가대상 원료의 기원종이 기준 원료와 다를 경우, 성분 조성의 차이가 크기 때문에 코사인 유사도(index c)의 구별만으로도 품질을 판정할 수 있다. 구체적으로, 코사인 유사도의 임계값을 정하여 임계값 이하인 코사인 유사도를 갖는 평가대상 원료는 기준 원료와 상이한 종류이거나 품질을 갖는 것으로 판단할 수 있다. 코사인 유사도의 임계값 기준은 바람직하게 0.7 내지 1일 수 있으나, 이는 평가자가 주관적으로 설정할 수 있다.

본 발명의 상기 index a 및 m 은 동일한 양의 원료를 기준으로 측정하며, 그 구체적인 내용 및 계산식은 다음과 같다.

xi : 기준 시료의 크로마토그램 i번째 피크 면적

yi : 평가 대상 시료의 크로마토그램 i번째 피크 면적

n : 총 피크의 개수

index a는 상기 임계값 이상인 평가대상 원료에 대하여, 각 성분마다 상대 값(평가 대상 시료/기준 시료의 성분 면적)을 형성한 후 이것들의 평균을 지표 값으로 한 값이다. 이 지표 값이 1보다 클 경우는 검증 받아야 할 원료의 성분들 농도가 전반적으로 높다고 할 수 있고 작을 경우는 성분들 농도가 전반적으로 낮다고 할 수 있다. 1일 경우에 이상적이다. index a 값은 품질 평가에 더 변별력을 가하기 위하여 기준 원료의 성분과 전반적인 농도 차이를 확인하는 값이다.

<계산식 2>

index m은 앞서 계산한 상대 값 중 최대값과 최소값을 찾은 후 최대값, 1/최소값 중 더 큰 값을 이 유사성 지표로 사용한 값이다. 이 값이 크면 적어도 한 성분에서 농도차이가 크다는 것을 나타낸다. 따라서 이 지표는 1보다 큰 값을 가지며 1일 경우에 이상적이다. index m은 크로마토그램 성분 면적의 소수 부분적 차이를 확인하는 값이다.

<계산식 3>

본 발명의 (f) 단계는 상기 산출된 index c, a 및 m에 따라 통계모델을 구축하여 평가 대상 원료들의 기준 원료 대비 구성 성분 동등성을 평가하는 단계이다.

본 발명의 상기 ‘통계 모델’은 커널밀도함수일 수 있다.

본 발명의 상기 ‘통계모델’은 다음과 같이 구축할 수 있다.

index c, a 및 m 으로부터 그 값을 중심으로 하고 면적값이 1인 커널함수들을 형성하고 이것들을 모두 더한 후 시료의 숫자로 나눔으로써 커널확률밀도를 얻을 수 있다. 그 수식은 다음과 같다.

<커널확률밀도 수식>

x는 CAM값의 전치행렬(χ=(c,a,m)^T)을 의미하며, K_H(χ)는 밴드폭 H를 가질 때의 커널 함수를 의미한다 (K_H(χ)=|H|^-½K(H^-½χ)). n은 시료의 숫자를 의미한다. 커널 함수 K의 종류는 추정의 정확도에 크게 영향을 미치지 않는다고 알려져 있기 때문에 아래와 같은 일반적인 커널 함수(standard multivariate normal kernel function)가 사용되었다.

<커널함수 수식>

본 발명의 상기 ‘품질’은 원료가 갖는 성질을 말하며, 바람직하게는 유효 성분의 조성비나 유효 성분의 함량일 수 있다.

본 발명의 상기 ‘품질 평가 방법’은 원료가 갖는 유효 성분의 조성비나 유효 성분의 함량을 복합 유사성 지표와 통계 모델을 이용하여 원료의 품질을 평가하는 방법을 의미하며, 바람직하게는 기준원료와 비교원료의 구성성분이 화학적으로 동등한지 평가하는 것을 의미한다.

이러한 통계 모델에 임계값을 설정함으로써 시료의 품질 적부를 판정할 수 있다. 상기 임계값의 결정은 주관적이며 실시자가 시료 전체 중 몇 %만을 합격으로 간주할 것인지 정함으로써 결정되는 것이다. 지나친 수준이 아니라면 임계 값이 더 엄격해지면 (영역이 작아지면) 전반적으로 더 동등한 시료들이 선별될 수 있다.

본 발명을 이용하면 원료 내 대사체 성분 정보에 대한 이해(시너지효과와 직결된 성분들의 조성비율, 성분들의 부분적/전반적 농도 이상 등)가 직관적으로 가능하다. 따라서, 복합 유사성 지표와 통계 분석을 통해 원료를 품질평가 함으로써 더 엄격하고 과학적으로 생약 원료의 품질을 판단할 수 있다.

도 1은 한국산 삽주, 중국산 삽주, 중국산 백출의 대표 크로마토그램이다.
도 2는 전체시료의 90%를 포함할 것으로 기대되는 영역을 품질판정의 임계 값으로 잡은 결과이다.
도 3은 기준 원료와 화학적 동등성이 떨어져 불합격인 한국산 삽주 7번, 10번, 12번, 16번과 상기 기술한 방법에 의해 합격 판정된 시료들 중 중국산 삽주 3번(CJ3)을 비교한 결과이다.
도 4는 본 방법 발명의 실시 순서를 나타낸 플로우차트이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법>

1. 원료로부터 대사체를 추출하는 단계

단계 1에서는 생약 원료로부터 대사체를 추출하였다.

본 발명에서는 다양한 대사체를 편리하고 신속하게 추출하기 위해 추출용매로 70% 메탄올을 이용하였다. 세말한 원료를 동결 건조하고 100 mg을 정확하게 칭량한다. 이후 70% 메탄올을 2 mL 가한 후 소니케이터에서 1 시간 동안 40 º조건으로 대사체 추출을 진행하였다. 이후 추출용액을 16,000 rcf에서 10 분간 원심분리 한 후 상등액 1 mL을 취한다. 해당 상등액을 0.45 μPTFE filter에 여과한 후 분석 시료로 사용하였다.

2. 대사체를 액체크로마토그래피- 다이오드어레이검출기(LC-DAD)를 이용하여 분석하는 단계

본 발명에서는 Agilent사의 다이오드어레이검출기를 포함한 Agilent 1260 Infinity HPLC system이 사용되었다. 분석 컬럼은 Agilent사의 Polaris 5 Amide-C₁₈column(250 mm x 4.6 mm, 5 μ을 사용하였으며 이동상은 물(Phase A)과 아세토니트릴(Phase B)를 이용하였다. 용매 기울기 조건은 0-5분; 30-50% B, 5-20분; 50-55.5% B, 20-35분; 55.5-78% B, 35분-40분; 78-100% B, 40-45분; 100% B이다. 분석 시료의 투입량은 10 μ로 설정하였다. 크로마토그래프지문 획득을 위한 검출기 파장은 236 nm로 선택되었다.

3. 유사성 지표를 계산하고 품질 평가 통계 모델을 구축함으로써 품질을 판정하는 단계

먼저 기준 시료를 상정하였다. 이후, LC-DAD를 통해 얻은 원료들의 크로마토그래프지문은 기준 원료의 크로마토그래프지문과 비교하여 아래와 같이 유사성 지표를 계산하였다. 한 개의 원료당 세 개의 유사성 지표 값(c, a, m)을 가졌다.

이후 적절한 통계 처리방법을 이용하여 품질 평가 모델을 구축하였다. 본 발명에서는 원료들의 유사성 지표 값들을 바탕으로 커널밀도추정(Kernel density estimation)을 진행하였고 품질 평가 모델을 형성하였다. 밀도를 추정하였을 때 좋은 유사성 지표값들을 갖는 높은 밀도 영역에 위치한 원료만이 품질이 합격 판정되었다. 커널밀도추정은 R program을 이용하여 진행되었다.

< 실시예 > 한국산 삽주 , 중국산 삽주 , 중국산 백출의 품질 평가 모델 제작 및 품질 판정

< 실시예 1> 원료로부터 대사체를 추출하는 과정

국내 시장에서 유통 되는 빈도를 고려하여 서로 다른 생약 원료를 수집하였다. 한국산 삽주(KJ) 20종, 중국산 삽주(CJ) 11종, 중국산 백출(CM) 9종을 준비하였다. 해당 시료를 세말하여 24 시간 동결건조를 진행하였다. 이후 100 mg을 칭량하여 2 mL의 70% 메탄올을 넣고 소니케이터를 이용해 1 시간 동안 40 º조건으로 대사체를 추출하였다. 16,000 rcf에서 10 분간 원심분리 한 후 상등액 1 mL를 0.45 μPTFE filter에 여과한 후 분석에 사용하였다.

< 실시예 2> LC-DAD를 이용하여 크로마토그래프지문을 획득하는 과정

상기 기술된 장비 및 조건을 이용하여 시료 분석을 진행하였다.

한국산 삽주와 중국산 삽주는 전반적인 패턴은 유사하나 성분(Peak)별로 함량(면적) 차이가 있었다. 반면에 중국산 백출은 육안으로 확인했을 때도 삽주와는 전혀 다른 크로마토그래프지문 패턴을 보였다.(도 1 참조)

< 실시예 3> 유사성 지표의 계산

먼저 임의로 하나의 검증된 삽주 시료를 기준 원료로 상정하였다. 분석한 시료 40종의 크로마토그래프지문을 다차원 데이터로 전환하고 기준 원료의 데이터와 비교하여 시료마다 상기 기술된 세 가지 유사성 지표 값(c, a, m)을 도출하였다.

구체적으로, 시간에 따라 검출되는 물질(피크)들을 크로마토그래프지문끼리 매칭시켰다.(도 1 참조) 이 때, 같은 시간에 검출되는 물질이 동일한지를 검증하기 위해서 분석 결과 얻어지는 UV 스펙트럼을 활용하였다. 두 물질이 같은 시간에 검출되고 UV 스펙트럼이 동일하다면 같은 물질로 간주하였다.

상기 c값, a값, m값을 구하기 위한 두 데이터는 다음과 같은 방법으로 계산하였다. 먼저, 시간에 따라 검출되는 물질(피크)들을 크로마토그래프지문끼리 매칭시켰다. 이 때, 같은 시간에 검출되는 물질이 동일한지를 검증하기 위해서 분석 결과 얻어지는 UV 스펙트럼을 활용하였다. 두 물질이 같은 시간에 검출되고 UV스펙트럼이 동일하다면 같은 물질로 간주하였다. 그리고, 성분-피크 면적의 차트를 만든 후, 아래의 계산식에 대입하여 c값, a값, m값을 계산하였다.

여기서 xi, yi : 기준 시료와 평가 대상 시료의 크로마토그래프지문 내 i번째 피크 면적, n: 총 피크의 개수)

한국산 삽주와 중국산 삽주는 기준 원료와 지문의 패턴(성분 조성비율)이 유사하여 c 값이 모두 0.7 이상이면서 대부분이 0.9 이상으로 높은 반면, ‘도 1’에서 육안으로 확인할 수 있듯이 중국산 백출 시료는 기준 원료와는 지문의 패턴이 유사하지 않아 c 값이 0.3 ~ 0.5로 낮았다.

< 실시예 4> 품질 평가 과정

< 실시예 4-1> 통계 분석 전 제거 과정

검증할 원료의 기원종이 기준 원료와 다를 경우, 성분 조성의 차이가 크기 때문에 c 값의 구별만으로도 시료의 품질을 판정할 수 있었다. 본 실시예의 경우 c값이 0.7 이상인 것만 다음 단계의 통계 분석에 사용하였다. 그 결과, 중국산 백출의 c 값은 상당히 낮고 기준 원료(삽주)와 지문의 차이가 육안으로 식별 가능하기 때문에 기준 원료와 화학적으로 상이하여, 이상원료로써 불합격 제거하였다.

< 실시예 4-2> 커널확률밀도 추정

한국산 삽주, 중국산 삽주의 경우 기준 원료(삽주)와 지문 패턴이 유사하여 c 값이 높았다. 유사성 평가에 더 변별력을 가하기 위하여 기준과 전반적인 농도 차이를 확인하는 a 값, 지문 내 소수 부분적 차이를 확인하는 m 값을 추가로 활용하여 남은 31개 시료의 품질을 판정하였다.

시료 31종의 유사성 지표(c, a, m)로부터 그 값을 중심으로 하고 면적값이 1인 커널함수들을 형성하고 이것들을 모두 더한 후 시료의 숫자로 나눔으로써 커널확률밀도를 얻을 수 있었다. (아래 수식 참조)

이 밀도에 임계값을 설정함으로써 시료의 품질 적부를 판정할 수 있었다.

전체시료의 90%를 포함할 것으로 기대되는 영역을 품질판정의 임계 값으로 잡은 결과, 노란색 영역 안에 있는 27개의 시료(점)들은 상대적으로 1에 가까운 c, a, m 값을 가지면서 몰려있기 때문에 높은 품질의 원료로 간주 할 수 있었다. 상대적으로 바깥에 위치한 한국산 삽주 10번(KJ10), 12번(KJ12), 16번(KJ16)은 다른 시료들에 비해 크게 높은 m 값(>3), 낮은 a 값, c 값의 전반적인 영향으로 인하여 품질이 나쁜 원료로 판정되었다. 한편, 한국산 삽주 7번(KJ7)은 c, a 값이 1에 가까운 편이지만 m 값이 4.7로 매우 높기 때문에 나쁜 원료로 판정되었다.(도 2 참조)

기준 원료와 화학적 동등성이 떨어져 불합격인 한국산 삽주 7번, 10번, 12번, 16번과 상기 기술한 방법에 의해 합격 판정된 시료들 중 중국산 삽주 3번(CJ3)을 비교한 결과이다. 중국산 삽주 3번은 불합격 시료들과 비교했을 때 상당히 기준원료와 화학적으로 동등한 것을 확인할 수 있었다. 다른 합격 시료의 경우에도 기준 원료와 화학적 동등성이 실제로 높은 것을 확인할 수 있었다.(도 3 참조)

선행 품질 평가 결과가 부족한 상황에서의 임계값의 결정은 주관적이며, 지나친 수준이 아니라면 임계 값이 더 엄격해지면 (영역이 작아지면) 전반적으로 더 동등한 시료들이 선별될 수 있다.

본 발명의 품질 평가 방법은 기존의 단일유사성 지표로 품질을 판단한 방법들과 달리, 다양한 관점으로 유사성을 엄격하게 평가하고 품질에 대한 기존 선행 평가 정보가 부족한 상황에서 품질의 주관적 결정에 근거를 제공할 수 있어 산업상 이용가능성이 있는 발명이다.

Claims

(a) 평가대상 원료의 대사체를 추출하는 단계;
(b) 상기 원료의 대사체 정보(크로마토그램)를 크로마토그래피법에 의해 수득하는 단계;
(c) 상기 크로마토그램에서 기준 원료의 크로마토그램의 각 검출 피크에 상응하는 i번째 피크에 대한 면적값(yi)을 각각 산출하여 평가대상 원료의 데이터 벡터로 산출하는 단계;
(d) 기준원료의 크로마토그램의 각 검출 피크에 대한 면적값(xi)의 데이터 벡터 (기준원료의 데이터 벡터)와 상기 (b) 단계의 평가대상 원료의 데이터 벡터의 코사인 유사도 (cosine similarity, index c)를 산출하는 단계;
(e) 상기 코사인 유사도가 임계값 이상인 평가대상 원료의 데이터 벡터와 기준원료의 데이터 벡터간의 상대값의 평균 (index a) 및 상기 상대값의 최대 차이 (index m)를 산출하는 단계; 및
(f) 상기 산출된 index c, a 및 m에 따라 통계모델을 구축하여 기준 원료 대비 평가대상 원료의 품질을 평가하는 단계를 포함하는 원료의 품질 평가 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 크로마토그램은 자외선(UV)/가시광선(Visible) 검출기, 질량 분광계(MS) 검출기, 핵자기공명(NMR) 검출기, 반사지수(RI) 검출기, 광산란 검출기(ELSD)로 측정된 것을 특징으로 하는 품질 평가 방법.
제2항에 있어서, 상기 자외선/가시광선 검출기는 DAD인 것을 특징으로 하는 품질 평가 방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 코사인 유사도(index c)의 임계값은 0.7 내지 1인 것을 특징으로 하는 원료의 품질 평가 방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 및 (e) 단계의 index c, a 및 m 은 각각 1에 가까울수록 기준 원료와 화학적 품질이 동등한 것을 특징으로 하는 원료의 품질 평가 방법.
제1항에 있어서, 상기 (f) 단계의 통계 모델은 커널밀도추정인 것을 특징으로 하는 원료의 품질 평가 방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 및 (e) 단계의 index c, a 및 m 은 각각 아래 수식으로 계산된 것을 특징으로 하는 원료의 품질 평가 방법;
제6항에 있어서, 상기 커널밀도추정은 아래 수식으로 구축된 것을 특징으로 하는 원료의 품질 평가 방법;

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제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 대사체는 삽주(Atractylodes japonica Koidzumi), 백출(Atractylodes macrocephala Koidzumi), 갈근, 감초, 강활, 강황, 건강, 계지, 고본, 고삼, 구기자, 금은화, 길경, 단삼, 당귀, 대황, 도인, 독활, 마황, 맥문동, 목통, 목향, 박하, 반하, 방기, 방풍, 백지, 복령, 복분자, 사인, 산수유, 산약, 산조인, 삼칠, 상엽, 상백피, 상심자, 생강, 생지황, 석창포, 세신, 숙지황, 승마, 시호, 신이, 애엽, 연교, 오가피, 오미자, 용담, 우슬, 울금, 육계, 육두구, 원지, 익모초, 인삼, 인진호, 자소엽, 작약, 지모, 지실, 진피, 차전자, 창출, 천궁, 천마, 천남성, 천문동, 청피, 치자, 택사, 포공영, 하고초, 하수오, 행인, 향부자, 현삼, 현호색, 형개, 홍삼, 홍화, 황금, 황기, 황련, 황백, 회향, 후박 및 흑삼으로 이루어진 군에서 선택된 원료에서 추출된 것을 특징으로 하는 원료의 품질 평가 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 대사체는 물, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 주정, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군에서 선택된 용매로부터 추출된 것을 특징으로 하는 원료의 품질 평가 방법.