CN109856267A - 基于lc-ms技术同时测定中药制剂中多种成分含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药制剂的多种成分含量同时测定的方法，具体采用液相色谱‑质谱联用(LC‑MS)技术，结合多反应监测(MRM)，建立了天龙通络胶囊中多种成分含量的同时测定方法。该方法能快速、有效地对天龙通络胶囊中31种成分的含量进行同时测定，方法准确、灵敏度高、专属性强、重现性好，有利于提高天龙通络胶囊的质量控制水平，保障产品质量。
Description
技术领域
本发明属于中药质量控制技术领域，涉及一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法。具体来说，就是采用一种液相色谱-质谱联用技术，结合多反应监测(MRM)，建立了天龙通络胶囊中多种成分含量的同时测定方法，以提升其质量控制水平。
背景技术
天龙通络胶囊由地龙、天麻、丹参、川芎、人工牛黄等五味中药按照“君臣佐使”的中医药经典配伍理论组方而成，具有祛风通络、活血化瘀、豁痰开窍的功效，临床上用于治疗缺血性脑中风及瘫痪、半身不遂、舌强语塞、手脚麻木等中风后遗症。授权公告号CN102125662 B，其发明名称“一种用于治疗中风的复方中药、其制备方法及其用途”的发明专利公开了该中药制剂制备方法及用途。
天龙通络胶囊的物质基础研究相对较少，现行标准的含量测定项下也只对“臣药”天麻中的成分天麻素进行测定，成分的质量控制方法相对单一而缺乏更好的代表性和全面性。因此，深入天龙通络胶囊的物质基础研究及开发一种同时测定其中多种主要成分的含量测定方法作为其质量控制手段势在必行。本发明研究建立和验证了一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，该方法准确、灵敏度高、专属性强、重现性好，有利于提高天龙通络胶囊的质量控制水平，保障产品质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，建立天龙通络胶囊中31种主要成分的LC-MS(MRM)分离和同时含量测定方法，以提升天龙通络胶囊的质量控制水平。
为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案和步骤实现：
(1)对天龙通络胶囊进行提取。其中，对天龙通络胶囊提取可以采用中药制剂样品溶液的常规提取方式：包括但不限于加热提取、超声提取、索氏提取等，进一步的，优选超声提取；提取溶剂类型包括但不限于甲醇、乙醇、水、不同比例的甲醇-水和不同比例的乙醇-水等；料液比、提取温度、提取时间等可根据具体待测样品进行考察优化。
其中，以HPLC-MS测定的化合物的数量和主要化合物的含量为考察指标，通过对天龙通络胶囊样品进行了提取溶剂类型(甲醇、乙醇、水、50％甲醇-水和50％乙醇-水)、提取溶剂的组成(10％、30％、50％、70％和90％的乙醇-水)、料液比(1∶5、1∶20、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560)、提取温度(20℃、30℃、40℃、50℃)、提取时间(30min，60min，90min，120min)等的考察，优选提取条件。
进一步的，天龙通络胶囊的提取条件优选为50％乙醇-水超声提取30min，提取温度20℃，料液比1∶320。
(2)将天龙通络胶囊样品溶液进行高效液相色谱(HPLC)分离。其中，样品溶液可采用高速离心或0.2μm滤膜过滤等方式进行样品进样前处理；其中，色谱柱采用C18为固定相；流动相包含且不限于甲醇、乙腈，不同浓度的含酸、或含碱、或含缓冲盐等水溶液；柱温、流速、进样体积、流动相组成及梯度洗脱条件根据所用的色谱柱可适当调整。
进一步的，液相(HPLC)条件，优选为流动相A为0.1％甲酸-水(v/v)，流动相B相为乙腈，柱温25℃，流速为1.0mL/min，进样体积为5μL，梯度洗脱条件：0～5min，B为5％；5～13min，B为5％→7％；13～20min，B为7％→10％；20～30min，B为10％→22％；30～35min，B为22％→23％；35～41min，B为23％→24％；41～46min，B为24％→27％；46～59min，B为27％→60％；59～62min，B为60％→80％；62～70min，B为80％→100％；70～75min，B为100％。
(3)质谱(MS)并结合多反应监测(MRM)进行检测分析和31种成分的含量测定。
其中，通过HPLC分离的天龙通络胶囊的多种成分，进入质谱检测器检测分析，优化质谱条件为：Aglient 6460三重四级杆串联质谱检测器(Agilent Corp.，Santa Clara，CA，USA)，Chem Station工作站(Agilent Technologies)；雾化压力35psig；毛细管电压，3500V；干燥气体流速：10L/min；干燥气体温度：350℃。定量采用多重反应监测(MRM)模式，监测化合物从母离子到某一特定子离子的裂解过程。
其中，31种成分及MS-MRM参数如表1：
表1：天龙通络胶囊中31个化合物的MRM参数
所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其中31种成分的含量测定，选用合适的内标物作为内标，以进行多成分含量的同时、准确测定。
进一步的，所述的内标化合物更进一步优化，选择化合物性质稳定且出峰位置合适的的甘草次酸和岩白菜素作为内标化合物，以满足制剂中不同类型成分的准确定量；优选内标化合物的终浓度均为83.33μg/mL。
进一步的，以甘草次酸为内标，定量7个胆酸类化合物(牛磺胆酸，甘氨胆酸，胆酸，熊去氧胆酸，鹅去氧胆酸，甘氨脱氧胆酸和去氧胆酸)；以岩白菜素为内标，定量其余24个化合物(水苏糖，牛磺酸，苹果酸，琥珀酸，天麻素，L-苯丙氨酸，丹参素，原儿茶酸，L-色氨酸，3，4-二羟基苯甲醛，4-羟基苯甲酸，巴利森苷E，绿原酸，香草酸，咖啡酸，4-羟基苯甲醛，巴利森苷B，阿魏酸，异绿原酸A，异绿原酸C，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A)。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案建立了基于LC-MS技术同时测定天龙通络胶囊中多种成分含量的方法，且涵盖各组成单味药的主要成分，该方法操作简便、准确可靠，具备可行性和先进性，摆脱了现行单一成分含量测定的质量控制方法，大大提升了天龙通络胶囊的质量控制水平。
附图说明
图1天龙通络胶囊HPLC-MS总离子流图
图2天龙通络胶囊中31个准确定性和定量的化合物的HPLC-MS总离子流图
具体实施方式
为了更好地说明本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点和精神，下面通过实施例予以进一步阐释，但不构成对本发明的限制。
以下为实施例中所用到的相关试验仪器、标准品、试剂及样品：
实验仪器：
Aglient 1290高效液相色谱系统(Agilent，USA)，含在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、WAD检测器；
Aglient 6460三重四级杆串联质谱检测器(Agilent Corp.，Santa Clara，CA，USA)；Aglient 6545飞行时间四级杆串联质谱检测器(Agilent Corp.，Santa Clara，CA，USA)，含电喷雾离子源(ESI源)，Chem Station工作站(Agilent Technologies)；
色谱柱：Extend C-18column(250mm×4.6mm，5μm，Agilent Technologies，SantaClara，CA，USA)。
Milli-Q去离子水系统(Millipore，Milford，MA，USA)；KH-500DB型数控超声仪。
标准品：水苏糖(Stachyosetetrahydrate)，牛磺酸(Taurine)，苹果酸(Malicacid)，异绿原酸C(Isochlorogenic acid C)，丹参素(Danshensu)，L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)，巴利森苷E(Parishin E)和巴利森苷B(Parishin B)，均购于上海源叶生物科技有限公司(上海，中国)。异绿原酸A(Isochlorogenic acid A)，咖啡酸(Caffeicacid)，绿原酸(Chlorogenic acid)，紫草酸(Lithospermic acid)，迷迭香酸(Rosmarinicacid)，原儿茶酸(Protocatechuic acid)，丹酚酸A(Salvianolic acid A)和丹酚酸B(Salvianolic acid B)，均购于成都曼思特生物科技有限公司(成都，四川)。天麻素(Gastrodin)，L-色氨酸(L-Tryptophan)，香草酸(Vanillic acid)，3，4-二羟基苯甲醛(3，4-Dihydroxybenzaldehyde)，4-羟基苯甲醛(4-Hydroxybenzaldehyde)，阿魏酸(ferulicacid)，牛磺胆酸(Taurocholic acid)，甘氨胆酸(Glycocholic acid)，胆酸(Cholic acid)和甘氨脱氧胆酸(Glycodeoxycholic acid)，均购于阿拉丁(St.Louis，Mo，USA)。丁二酸(Succini acid)，熊去氧胆酸(Ursodesoxycholicacid)和鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholicacid)梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(上海，中国)。4-羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoic acid)，去氧胆酸(Deoxycholic acid)，岩白菜素(Bergenin)和甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)购于成都普瑞法科技开发有限公司(成都，四川)。以上标准品的纯度均≥98％。
HPLC级乙腈(Merck，LiChrosolvReag.PhEur，Acetonitrile，DarmstadtGermany)；色谱乙醇(江苏汉邦科技)；HPLC级甲酸(ROE SCIENTIFIC INC，F8124-0500)；去离子水(18MΩCM-1)；
天龙通络胶囊样品：10个不同批次的天龙通络胶囊(批号：111001，111002，111003，130201，130202，130203，130401，150101，160101，160102)，牡丹江友搏药业有限责任公司生产。
实施例1基于LC-MS技术同时测定天龙通络胶囊中多种成分含量方法的建立
1、对天龙通络胶囊进行提取
采用超声提取法为天龙通络胶囊的样品提取方式，以HPLC-MS测定的化合物的数量和主要化合物的含量为考察指标，通过对天龙通络胶囊样品进行了提取溶剂类型(甲醇、乙醇、水、50％甲醇-水和50％乙醇-水)、提取溶剂的组成(10％、30％、50％、70％和90％的乙醇-水)、料液比(1∶5、1∶20、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560)、提取温度(20℃、30℃、40℃、50℃)、提取时间(30min，60min，90min，120min)等的考察。天龙通络胶囊提取条件最终优选为50％乙醇-水超声提取30min，提取温度20℃，料液比1∶320；具体操作：精密称量天龙通络胶囊样品0.1g，加入32mL50％乙醇-水，带瓶称重后20℃下100Hz超声提取30min，过滤后获得提取液，提取液用50％乙醇补足失重，混匀后，13000rpm离心10min，取上清，即得。
前期研究中，已采用HPLC-QTOF MS(Aglient 6545飞行时间四级杆串联质谱检测器，含ESI离子源)对天龙通络胶囊样品溶液中的主要成分进行了定性研究，共分离了79个化合物，包括酚酸，胆酸，有机酸，氨基酸，小肽，嘌呤，嘧啶，内酯和糖类化合物，其总离子流图(TIC图)如图1所示，图中红色标记的31个化合物为准确鉴定的化合物(通过与标准品的色谱、质谱信息比对准确定性)，见图2所示。该31个化合物包含了天龙通络胶囊中含量较高的化合物(后续本发明中对该31个化合物进行了准确定量)，包括18个酚酸类物质，7个胆酸类物质，2个有机酸类物质，3个氨基酸类物质和1个糖类物质。
2、将天龙通络胶囊样品溶液进行HPLC-MS检测分析
色谱条件：Aglient 1290高效液相色谱系统，色谱柱为Extend C-18 column(250mm×4.6mm，5μm)，柱温25℃，流速为1.0mL/min，进样体积为5μL，流动相A为0.1％甲酸-水(v/v)、流动相B相为乙腈，梯度洗脱条件：0～5min，B为5％；5～13min，B为5％→7％；13～20min，B为7％→10％；20～30min，B为10％→22％；30～35min，B为22％→23％；35～41min，B为23％→24％；41～46min，B为24％→27％；46～59min，B为27％→60％；59～62min，B为60％→80％；62～70min，B为80％→100％；70～75min，B为100％。
质谱分析条件：Aglient 6460三重四级杆串联质谱检测器，Chem Station工作站(Agilent Technologies)；雾化压力35psig；毛细管电压，3500V；干燥气体流速：10L/min；干燥气体温度：350℃。定量采用多重反应监测(MRM)模式，监测化合物从母离子到某一特定子离子的裂解过程。
优化后的MRM条件见表1所示。
内标化合物应该具有：与被测成分性质比较接近，不与待测成分发生化学反应，峰位置与被测成分接近但不相互干扰，且为待测物中不含有，稳定性较好等特点。本实验考察了华蟾酥毒基，酸枣仁皂苷A，甘草次酸，二氢杨梅素，鸢尾苷和岩白菜素作为内标化合物。最终确定了化合物性质稳定且出峰位置合适的的甘草次酸和岩白菜素作为内标化合物。内标化合物的终浓度均为83.33μg/mL。
对天龙通络胶囊中的31个主要成分进行定量分析：以甘草次酸为内标，定量7个胆酸类化合物(牛磺胆酸，甘氨胆酸，胆酸，熊去氧胆酸，鹅去氧胆酸，甘氨脱氧胆酸和去氧胆酸)；以岩白菜素为内标，定量其余24个化合物(水苏糖，牛磺酸，苹果酸，琥珀酸，天麻素，L-苯丙氨酸，丹参素，原儿茶酸，L-色氨酸，3，4-二羟基苯甲醛，4-羟基苯甲酸，巴利森苷E，绿原酸，香草酸，咖啡酸，4-羟基苯甲醛，巴利森苷B，阿魏酸，异绿原酸A，异绿原酸C，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A)。
3、方法学考察
(1)标准曲线、定量限及检测限
分别精密吸取适量化合物的标准品母液于1mL容量瓶中，并加入适量的内标(岩白菜素，终浓度均为83.33μg/mL；甘草次酸，终浓度均为83.33μg/mL)，加入甲醇定容到刻度线，稀释成一系列浓度梯度的混合标准品溶液(n＝9)，每个浓度的标准品进样5μL分析，以待测化合物与内标化合物的峰面积比(Pa)对浓度进行线性回归，得到各成分的标准曲线。
用甲醇进一步稀释混合标准品溶液，用信噪比法进行测定，取峰高为噪音3倍(S/N＝3)时的浓度为检测限(LOD)、峰高为噪音10倍(S/N＝10)时的浓度为定量限(LOQ)。所得结果如表2所示，表明标准曲线的线性相关系数良好，定量限及检测限符合检测要求。
表2天龙通络胶囊中31个化合物的标准曲线、线性范围、检测限和定量限
ay：Peak area ratios of the analytes/IS；x：Concentration of standards(μg/ml).
bLimits of detection(S/N＝3).
cLimits of quantification(S/N＝10).
(2)精密度、重复性和稳定性
取混合标准品溶液浓度梯度中的高、中、低三个浓度，于一天内每个浓度进样3次，记录测定成分的峰面积与内标化合物峰面积的比值(Pa)，并计算RSD，计算保留时间(RT)的RSD，以考察日内精密度；在连续3天中，高、中、低三个浓度每个浓度进样1针，录测定成分的峰面积与内标化合物峰面积的比值(Pa)，并计算RSD，计算保留时间(RT)的RSD，以考察日间精密度。
平行制备6份天龙通络胶囊供试品溶液，并各进样5uL分析，记录测定成分的峰面积与内标化合物峰面积的比值(Pa)，并计算RSD，考察重复性。
制备1份天龙通络胶囊供试品溶液，保存于4℃冰箱，分别放置0h、2h、4h、6h、8h、12h，24h进样测定，记录测定成分的峰面积与内标化合物峰面积的比值(Pa)，并计算RSD，考察样品稳定性。
精密度、重复性和稳定性考察的所得结果如表3所示，表明其均符合检测要求。
(3)准确性
准确性采用加样回收实验来考察，精密称取同一批天龙通络胶囊提取物0.1g，平行9份，分别加入31个标准品适量，样品加入50％乙醇-水32mL，超声提取30min，室温下冷却，提取液用50％乙醇-水补足失重，13,000rpm离心10min，进样5uL测定，记录测定成分的峰面积与内标化合物峰面积的比值(Pa)，带入标准曲线计算含量，并计算RSD，计算按下面公式(A)计算加样回收率。
准确性考察结果结果如表3所示，结果表明其符合检测要求。
表3天龙通络胶囊中31个化合物的精密度，重复性，稳定性和准确性
实施例2天龙通络胶囊样品中31种成分含量的同时测定
根据实施例1建立的方法，对10批天龙通络胶囊进行含量测定。制备10个批次的天龙通络胶囊的供试品溶液，制备方法为：精密称量0.1g样品，加入32mL50％乙醇，带瓶称重后20℃下100Hz超声提取30min，过滤后获得提取液，提取液用50％乙醇补足失重，混匀后，13000rpm离心10min，取上清，加适量内标(岩白菜素，终浓度为83.33μg/mL；甘草次酸，终浓度为83.33μg/mL)作为供试品溶液，进样5μL检测，记录测定成分的峰面积与内标化合物峰面积的比值(Pa)，代入标准曲线计算含量(μg/mL)，结果如表4所示(可将31个化合物的浓度代入公式：CA×32/0.1/100，折算天龙通络胶囊中该化合物的含量(mg/g))。
表4 10批天龙通络胶囊样品中31个化合物的含量(μg/mL)
综上所述，本发明基于LC-MS技术同时测定天龙通络胶囊中多种成分含量的方法其精密度、重复性、准确性良好；本发明的技术方案具有可行性和先进性。利用本发明的测定方法，可以进一步提升天龙通络胶囊的质量控制水平。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，建立LC-MS(MRM)分离和同时含量测定方法，测定天龙通络胶囊中31种主要成分，该质量控制技术包括如下步骤：
(1)对天龙通络胶囊进行提取；
(2)将天龙通络胶囊样品溶液进行高效液相色谱(HPLC)分离；
(3)质谱(MS)并结合多反应监测(MRM)进行检测分析和31种成分的含量测定，其中31种成分及MS-MRM参数如下：
2.根据权利要求1所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，步骤(1)对天龙通络胶囊提取可以采用中药制剂样品溶液的常规提取方式：包括但不限于加热提取、超声提取、索氏提取等，优选超声提取；提取溶剂类型包括但不限于甲醇、乙醇、水、不同比例的甲醇-水和不同比例的乙醇-水等；料液比、提取温度、提取时间等可根据具体待测样品进行考察优化。
3.根据权利要求1所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，步骤(2)将天龙通络胶囊样品溶液进行高效液相色谱(HPLC)分离，样品溶液可采用高速离心或滤膜过滤等方式进行样品进样前处理。
4.根据权利要求1所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，步骤(2)将天龙通络胶囊样品溶液进行高效液相色谱(HPLC)分离，色谱柱采用C18为固定相；流动相包含且不限于甲醇、乙腈，不同浓度的含酸、或含碱、或含缓冲盐等水溶液；柱温、流速、进样体积、流动相组成及梯度洗脱条件根据所用的色谱柱可适当调整。
5.根据权利要求1所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)所述的进行质谱(MS)并结合多反应监测(MRM)进行检测分析，其优化的质谱条件为：雾化压力35psig；毛细管电压，3500V；干燥气体流速：10L/min；干燥气体温度：350℃；定量采用多重反应监测(MRM)模式，监测化合物从母离子到某一特定子离子的裂解过程。
6.根据权利要求1所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)所述的多种成分的含量测定，选用合适的内标物作为内标，以进行多成分含量的同时、准确测定。
7.根据权利要求2所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，天龙通络胶囊的提取条件优选为50％乙醇-水超声提取30min，提取温度20℃，料液比1∶320。
8.根据权利要求4所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，液相(HPLC)条件，优选为流动相A为0.1％甲酸-水(v/v)，流动相B相为乙腈，柱温25℃，流速为1.0mL/min，进样体积为5μL，梯度洗脱条件：0～5min，B为5％；5～13min，B为5％→7％；13～20min，B为7％→10％；20～30min，B为10％→22％；30～35min，B为22％→23％；35～41min，B为23％→24％；41～46min，B为24％→27％；46～59min，B为27％→60％；59～62min，B为60％→80％；62～70min，B为80％→100％；70～75min，B为100％。
9.根据权利要求6所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，所述的内标化合物更进一步优化，选择化合物性质稳定且出峰位置合适的的甘草次酸和岩白菜素作为内标化合物，以满足制剂中不同类型成分的准确定量；优选内标化合物的终浓度均为83.33μg/mL。
10.根据权利要求6所述的一种基于液质联用(LC-MS)技术同时测定中药制剂中多种成分含量的测定方法，其特征在于，以甘草次酸为内标，定量7个胆酸类化合物(牛磺胆酸，甘氨胆酸，胆酸，熊去氧胆酸，鹅去氧胆酸，甘氨脱氧胆酸和去氧胆酸)；以岩白菜素为内标，定量其余24个化合物(水苏糖，牛磺酸，苹果酸，琥珀酸，天麻素，L-苯丙氨酸，丹参素，原儿茶酸，L-色氨酸，3，4-二羟基苯甲醛，4-羟基苯甲酸，巴利森苷E，绿原酸，香草酸，咖啡酸，4-羟基苯甲醛，巴利森苷B，阿魏酸，异绿原酸A，异绿原酸C，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A)。
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| 陈素慧 等: "UPLC-MS/MS法同时测定银黄制剂中26种成分含量", 《广东药科大学学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115144522A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-10-04 | 江阴天江药业有限公司 | 一种全面控制壁虎配方颗粒质量的控制方法 |
| CN115144522B (zh) * | 2022-06-02 | 2023-09-22 | 江阴天江药业有限公司 | 一种全面控制壁虎配方颗粒质量的控制方法 |
| CN115494181A (zh) * | 2022-10-17 | 2022-12-20 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种同时鉴别通络化痰胶囊中五种原料药的检测方法 |
| CN115494181B (zh) * | 2022-10-17 | 2024-05-17 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种同时鉴别通络化痰胶囊中五种原料药的检测方法 |
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| CN109856267B (zh) | 2022-02-18 |
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