CN103575830A - 血浆中4种蒽醌的分析方法及其在药代动力学中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了同时测定血浆中大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的分析方法，包括步骤(1)样品的制备和步骤(2)检测，以及在药代动力学中的应用。该分析方法具有良好的专属性、精密度和准确度较高，线性范围较宽，可用于中药组合物的体内药代动力学测定。

Description

血浆中4种蒽醌的分析方法及其在药代动力学中的应用

技术领域

本发明属于现代中药应用领域，特别涉及血浆中大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的LC-MS/MS检测方法，以及在药代动力学中的应用。

背景技术

质谱是以分子量测定为基础的分析方法，近年来，其与高效液相色谱法(HPLC)或毛细管电泳法(CE)等分离机制的联用不仅提高了其抗杂质干扰的能力和节省了分析时间，而且大大提高了测定的灵敏度。软电离技术，如电喷雾离子化技术(ESI)的发展，则扩大了分子量检测的范围。此外，电喷雾离子化技术可在大气压下进行，方便与液相色谱仪连结，使液相色谱质谱联用技术(LC/MS)成为了一种高灵敏度、高选择性且快速分析的技术，其能在短时间之内，同时实现分析物的分离与结构鉴定。通过液相色谱质谱联用技术(LC/MS/MS)能更清楚地了解药物在动物活体内的药物动力学规律，从而让研究人员能够更好地掌握药物的药理作用。另外还可以省去复杂、繁琐且耗时的样本前处理工作。

糖敏灵丸是在临床验证的有效方开郁清胃颗粒基础上加减变化与剂型改革而成。糖敏灵丸由黄连、大黄、黄芩、白芍、柴胡、枳实、山楂、乌梅、半夏、天花粉共十味常用中药组成，具有开郁清胃、滋阴降火、通腑泻浊之功效。临床观察证实其对Ⅱ型糖尿病的血糖有明显的改善作用，尤其是对体型偏胖的早中期Ⅱ型糖尿病患者效果更加显著。同时，药理实验揭示糖敏灵能显著增强高热量饲料诱导的胰岛素抵抗模型糖尿病大鼠和自发性Ⅱ型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性。

大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚是糖敏灵中的4种有效成份，但是目前还没有可以同时检测血浆样本中这4种成份的方法。

发明内容

糖敏灵制剂作为药物，需要进行必要的药代动力学实验，由于上述药物活性成分在血中含量极低，需要精密仪器和精密方法进行操作，本发明经过研究，找到了适合测定这些物质的方法。

本发明提供一种液相色谱串联质谱法定量检测血浆样本中大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的方法，以及在药代动力学中的应用。

根据本发明，分析方法包括步骤(1)样品的制备和步骤(2)检测，步骤(1)样品制备采用包括以下步骤的方法：

a.向待测样品中依次加入有机溶剂、内标溶液，并混匀；

b.加入一倍以上体积提取溶剂，混匀；

c.离心，收集上清液，并蒸干；

d.步骤c的干燥物重新溶解，离心，取上清液。

分别考察了不加酸、加酸以及不同酸化条件后进行液液萃取，结果表明，酸化后大黄酚和大黄素甲醚提取率明显降低，而不加酸时各待测物提取回收率最高，因此，样品不进行酸化，直接采用乙醚液液萃取。

根据本发明实施方式之一，步骤a中所述内标为1,8-二羟基蒽醌。

对多种化合物进行筛选，其中1,8-二羟基蒽醌与大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚均属大黄素型蒽醌类化合物，质谱响应强度相当。为提高方法的重复性和准确性，选择1,8-二羟基蒽醌为内标。

根据本发明实施方式之一，步骤a中所述有机溶剂为甲醇。

根据本发明实施方式之一，步骤b中所述提取溶剂为乙醚。

分别考察了甲醇沉淀蛋白法、乙酸乙酯、氯仿和乙醚液液萃取法，结果表明甲醇沉淀蛋白法和乙醚液液萃取法提取率较高。但甲醇沉淀蛋白法中，大黄素的提取回收率略低于乙醚液液萃取法，大黄酚和内标的提取回收率略高于乙醚液液萃取法。由于大黄素在所有待测物中提取回收率最低，为保证所有待测物的准确度，选择乙醚液液萃取法。

根据本发明实施方式之一，步骤d重新溶解所用溶剂为乙腈-水。

根据本发明实施方式之一，步骤(2)采用的液相色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙腈-0.01-0.1%氨水溶液，体积比为10:90-90:10。

优选的，流动相为乙腈-0.05%氨水溶液体积比为70:30。

为获得高分离度和离子强度，对色谱条件进行了优化。乙腈为有机相时待测物响应提高，背景噪音降低。分别考察了乙腈-水、乙腈-5mM甲酸铵水溶液、乙腈-0.5mM甲酸铵水溶液和乙腈-0.05%氨水溶液等流动相系统，结果表明在水相中加入少量氨水，可以提高待测物在负离子模式下的质谱响应，同时可以改善峰形，因此选择乙腈-0.05%氨水溶液(70:30,v/v)为流动相。

根据本发明实施方式之一，步骤(2)检测所用质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为负离子选择反应监测。

各待测物在ESI源负离子模式下响应强度较高，而在正离子模式下基本无响应。

优选的，大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解电压分别为30eV，25eV，23eV，26eV。

本发明所述方法可成功用于糖敏灵制剂药代动力学的测定。

本发明所述糖敏灵丸由下列重量份的原料制成：

天花粉10~30份柴胡10~30份枳实3~15份大黄1~6份半夏1~12份黄芩3~15份黄连1~12份白芍3~15份乌梅5~20份山楂3~15份。

制备方法如下：所述的黄芩加水提取两次，每次1小时，提取液加浓盐酸调ph值至1.5～2.0，80℃保温1小时，抽滤，滤饼干燥，得黄芩提取物；所述的黄连加75%乙醇提取2次每次2小时，提取液减压回收乙醇，加入浓盐酸调ph值至1.0～2.0，抽滤，滤饼干燥，得黄连提取物；其余8味药用水回流提取2次，每次1小时，提取液减压浓缩至1∶1，加入95%乙醇至含醇量70%，滤过，滤液减压浓缩至稠膏加入黄连提取物与黄芩提取物，即得糖敏灵制剂的药物活性成分。药物活性成分与微晶纤维素按适当比例混合，按照常规方法制备成浓缩丸。

本发明所述糖敏灵制剂包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉针剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、滴剂、贴剂、滴丸。因为药物活性成分相同，所以本发明提供的方法可以用于多种不同制剂的糖敏灵药代动力学的检测。

本申请相对现有技术而言所具有的优点和效果：

1、可以一次性检测多种药物活性成分的数据。

2、可用于多种药物活性成分的药代动力学测定。

3、检测结果准确，灵敏度高。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1.空白血浆样品中1,8-二羟基蒽醌(IS)的SRM色谱图。

图2.空白血浆中加入1,8-二羟基蒽醌(IS)对照品溶液后的SRM色谱图。

图3.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中1,8-二羟基蒽醌(IS)的SRM色谱图。

图4.空白血浆样品中大黄酚的SRM色谱图。

图5.空白血浆中加入大黄酚对照品溶液后的SRM色谱图。

图6.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中大黄酚的SRM色谱图。

图7.空白血浆样品中大黄素和芦荟大黄素的SRM色谱图。

图8.空白血浆中加入大黄素和芦荟大黄素对照品溶液后的SRM色谱图。

图9.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中大黄素和芦荟大黄素的SRM色谱图。

图10.空白血浆样品中大黄素甲醚的SRM色谱图。

图11.空白血浆中加入大黄素甲醚对照品溶液后的SRM色谱图。

图12.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中大黄素甲醚的SRM色谱图。

图13.大鼠灌胃给予糖敏灵后，大黄素的药-时曲线。

图14.大鼠灌胃给予糖敏灵后，芦荟大黄素的药-时曲线。

图15.大鼠灌胃给予糖敏灵后，大黄酚的药-时曲线。

图16.大鼠灌胃给予糖敏灵后，大黄素甲醚的药-时曲线。

图17.大黄素[M–H]^-离子的产物离子质谱图。

图18.芦荟大黄素[M–H]^-离子的产物离子质谱图。

图19.大黄酚[M–H]^-离子的产物离子质谱图。

图20.大黄素甲醚[M–H]^-离子的产物离子质谱图。

图21.1,8-二羟基蒽醌(IS)[M-H]^-离子的产物离子质谱图。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

本发明是经过筛选获得的，筛选方法如下：

试验例1血浆样品中4种蒽醌分析方法的建立

LC-MS/MS条件

色谱柱：Hypersil Gold-C₁₈(150×2.1mm,5μm，Thermo)

预柱：Security Guard-C₁₈(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)

流动相：乙腈-0.05%氨水溶液(70:30)

柱温：25℃

流速：250μL·min^-1

离子源：电喷雾离子化源(ESI)

电离模式：负离子模式

MS/MS：选择反应监测(SRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z239→211(内标，1,8-二羟基蒽醌)，m/z253→225(大黄酚)，m/z269→225(大黄素)，m/z269→240(芦荟大黄素)，m/z283→240(大黄素甲醚)。

质谱参数：喷雾电压：3500V；离子源电压：10eV；毛细管温度：350℃；鞘气：N₂(35psi)；

辅助气：N₂(10psi)；碰撞气体压力：Ar1.0mTorr(1Torr=133.3Pa)；1,8-二羟基蒽醌、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，30eV，25eV，23eV，26eV；扫描时间：0.5s。

溶液的制备

(1)标准系列溶液的配制取大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚适量，精密称定，分别置于10mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，获得浓度分别为0.154mg·mL^-1，0.152mg·mL^-1，0.212mg·mL^-1，0.122mg·mL^-1的对照品溶液。分别精密量取大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品溶液5.0，4.0，2.5，5.0mL，置于同一100mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为7.70μg·mL^-1，6.08μg·mL^-1，5.30μg·mL^-1，6.10μg·mL^-1的混合对照品储备液。

分别精密量取适量混合对照品储备液，甲醇稀释制成混合对照品溶液，其中大黄素浓度为3.850，11.55，38.50，96.2，192.5，385.0，770.0ng·mL^-1，芦荟大黄素浓度为3.040，9.12，30.40，76.00，152.0，304.0，608.0ng·mL^-1，大黄酚浓度为2.650，7.950，26.50，66.25，132.5，265.0，530.0ng·mL^-1，大黄素甲醚浓度为3.050，9.15，30.50，76.25，152.5，305.0，610.0ng·mL^-1

(2)内标溶液的配制取1,8-二羟基蒽醌对照品适量，精密称定，置于10mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，获得浓度为0.502mg·mL^-1的储备液。精密量取储备液0.05mL，置于100mL量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，获得浓度为251.0ng·mL^-1的内标溶液。

各储备液及标准系列溶液置4℃冰箱保存备用。

血浆样品预处理

取肝素抗凝血浆200μL，置2mL塑料EP管中，依次加入内标溶液50μL(1,8-二羟基蒽醌溶液，251.0ng·mL^-1)和甲醇100μL。涡旋混合10s，加入无水乙醚1.2mL，涡旋混合5min，8000r·min^-1离心5min，分取上层乙醚溶液于45℃下氮气吹干，残渣用100μL乙腈–水(7:3)溶解，12000r·min^-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。

分析方法的确证

(1)方法的专属性大鼠空白血浆200μL，除用100μL流动相代替内标溶液外，其余按“血浆样品预处理”项下方法操作，获得空白样品的色谱图(图1、4、7和10)；将一定浓度的大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的混合对照品溶液和内标溶液(结构见下图)加入空白血浆中，依法操作，获得相应的色谱图(图2、5、8和11)，取大鼠灌胃糖敏灵后的血浆样品，同法操作，得色谱图(图3、6、9和12)。其中1,8-二羟基蒽醌(IS)、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的保留时间分别为2.0，2.3，2.5，2.8，4.1，8.3min；结果表明，血浆中内源性物质不干扰测定。

大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和1,8-二羟基蒽醌的结构

(2)标准曲线和线性范围取大鼠空白血浆200μL，加入系列混合标准溶液100μL，配制成相当于大黄素血浆质量浓度为1.925，5.775，19.25，48.13，96.2，192.5，385.0ng·mL^-1的模拟血浆样品，芦荟大黄素血浆质量浓度为1.520，4.560，15.20，38.00，76.00，152.0，304.0ng·mL^-1的模拟血浆样品，大黄酚血浆质量浓度为1.325，3.975，13.25，33.13，66.25，132.5，265.0ng·mL^-1的模拟血浆样品，大黄素甲醚血浆质量浓度为1.525，4.575，15.25，38.12，76.25，152.5，305.0ng·mL^-1的模拟血浆样品，除不加100μL流动相外，其它按“血浆样品预处理”项下操作，每一浓度进行双样本分析，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W=1/x²)最小二乘法进行回归分析。典型大鼠血浆样品标准曲线为大黄素：y=3.243×10^-3x3.729×10^-3，r=0.9951；芦荟大黄素：y=1.720×10^-3x-1.932×10^-3,r=0.9958；大黄酚：y=2.353×10^-3x-1.804×10^-4，r=0.9951；大黄素甲醚：y=9.76×10^-4x-1.037×10^-3，r=0.9950。大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚定量下限(LLOQ)分别为1.925ng·mL^-1，1.520ng·mL^-1，1.325ng·mL^-1，1.525ng·mL^-1。

(3)精密度和准确度取大鼠空白血浆200μL，按照“标准曲线的绘制”项下方法，分别配制低、中、高三个浓度的质量控制(QC)样品。每一浓度进行6样本分析，连续测定3天，随行标准曲线。根据当日标准曲线计算QC样品的浓度，结果进行方差分析，求得方法的精密度RSD和准确度RE，两个被测组分的日间RSD≤11%，日内RSD≤12%，RE在-6.6%~4.6%之间，结果见表1。

(5)提取回收率取空白血浆200μL，照“标准曲线的绘制”项下方法分别制备低、中、高三个浓度的样品各3样本，照“血浆样品的预处理”项下的方法操作，记录被测物的峰面积，与空白血浆经同法处理后的残渣加入标准溶液制成相同浓度的峰面积比较，测得各待测组分的提取回收率均大于52%。结果见表2。

(6)基质效应采用不同来源的空白血浆进行6样本分析，取大鼠空白血浆200μL，按“血浆样品预处理”项下操作，向获得的上清液中加入100μL标准溶液(含大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚分别为96.3，76.00，66.26，76.25ng·mL^-1)和50μL内标溶液(251.0ng·mL^-1)，45℃下氮气吹干，残渣加入100μL流动相复溶，12000r·min^-1离心5min，取上清液20μL进样分析，峰面积为B；同时取相应浓度的标准溶液20μL进样分析，峰面积为C。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值(B/C)计算基质效应，结果见表3。

(7)样品稳定性本文考察了未处理的血浆样品室温放置4h的稳定性，血浆样品经历3次冷冻-解冻循环的稳定性，处理后的血浆样品室温放置24h内的稳定性。每一项稳定性考察时，按“标准曲线和线性范围”项下配制低、中、高三个浓度的QC样品，每一浓度进行3样本分析，照“血浆样品的预处理”项下操作，测得样品浓度，计算相对误差(RE%)，结果见表4。结果表明处理后的血浆样品室温放置24h内稳定，未处理的血浆样品室温放置4h稳定，血浆样品经历3次冻-融循环后稳定。

讨论

建立了同时测定大鼠血浆中4种蒽醌的LC-MS/MS方法，该方法简单、快捷、专属性高，大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚LLOQ分别为1.925ng·mL^-1，1.520ng·mL^-1，1.325ng·mL^-1，1.525ng·mL^-1。

内标的选择

对番泻苷A、番泻苷B和1,8-二羟基蒽醌进行筛选，其中1,8-二羟基蒽醌与大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚均属大黄素型蒽醌类化合物，质谱响应强度相当。为提高方法的重复性和准确性，选择1,8-二羟基蒽醌为内标。

血浆样品预处理方法的建立

固相萃取法(SPE)适于处理极性较大的成分，而大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚极性较小，因此排除SPE法。分别考察了甲醇沉淀蛋白法、乙酸乙酯、氯仿和乙醚液液萃取法，结果表明甲醇沉淀蛋白法和乙醚液液萃取法提取率较高。但甲醇沉淀蛋白法中，大黄素的提取回收率略低于乙醚液液萃取法，大黄酚和内标的提取回收率略高于乙醚液液萃取法。由于大黄素在所有待测物中提取回收率最低，为保证所有待测物的准确度，选择乙醚液液萃取法。又分别考察了不加酸、加酸以及不同酸化条件后进行液液萃取，结果表明，酸化后大黄酚和大黄素甲醚提取率明显降低，而不加酸时各待测物提取回收率最高，因此，样品不进行酸化，直接采用乙醚液液萃取。色谱和质谱条件的优化

各待测物在ESI源负离子模式下响应强度较高，而在正离子模式下基本无响应。选择一定浓度的大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和1,8-二羟基蒽醌(IS)对照品溶液分别于负离子模式下进行一级全扫描分析，结果发现大黄素的准分子离子为m/z269[M–H]^-，芦荟大黄素的准分子离子为m/z269[M–H]^-，大黄酚的准分子离子为m/z253[M–H]^-，大黄素甲醚的准分子离子为m/z283[M–H]^-，1,8-二羟基蒽醌的准分子离子为m/z239[M–H]^-。

在负离子模式下，分别对大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和1,8-二羟基蒽醌(IS)的准分子离子m/z269，m/z269，m/z253，m/z283，m/z239进行产物离子扫描(如图17-21所示)。其中，大黄素的主要碎片离子m/z225是其准分子离子m/z269丢失一分子CO和一个·OH而形成的，芦荟大黄素的主要碎片离子m/z240是其准分子离子m/z269丢失一个·CHO而形成的，大黄酚的主要碎片离子m/z225是其准分子离子m/z253丢失一分子CO而形成的，大黄素甲醚的主要碎片离子m/z240是其准分子离子m/z283丢失一个·CH₃和一分子CO而形成的，1,8-二羟基蒽醌(IS)的主要碎片离子m/z211是其准分子离子m/z239丢失一分子CO而形成的。图17-21表明，m/z225(大黄素)，m/z240(芦荟大黄素)，m/z225(大黄酚)，m/z240(大黄素甲醚)，m/z211(IS)响应最强，且比较稳定，因此作为SRM的定量碎片离子。

对碰撞诱导裂解(CID)电压和碰撞气体能量等质谱参数进行了优化，确定大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，1,8-二羟基蒽醌的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为25eV，23eV，30eV，26eV，28eV。

为获得高分离度和离子强度，对色谱条件进行了优化。乙腈为有机相时待测物响应提高，背景噪音降低。分别考察了乙腈-水、乙腈-5mM甲酸铵水溶液、乙腈-0.5mM甲酸铵水溶液和乙腈-0.05%氨水溶液等流动相系统，结果表明在水相中加入少量氨水，可以提高待测物在负离子模式下的质谱响应，同时可以改善峰形，因此选择乙腈-0.05%氨水溶液(70:30,v/v)为流动相。

试验例2灌胃给药大鼠糖敏灵后4种蒽醌的药动学

血浆样品的采集

取雄性Wistar大鼠9只，实验前禁食12h，自由饮水。按8mL·kg^-1(相当于大黄素1.03mg·kg^-1，芦荟大黄素0.860mg·kg^-1，大黄酚0.860mg·kg^-1，大黄素甲醚0.327mg·kg^-1)剂量灌胃给予糖敏灵丸生理盐水混悬液后，于0min和给药后0.1，0.2，0.3，0.7，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0，30.0h眼眶采血0.5mL，置预先肝素化试管中，离心(4000rpm)10min，分取血浆，置–20℃冰箱中保存待测。

药动学测定结果

Wistar大鼠灌胃给予糖敏灵(17.2g·kg^-1)后，大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均药物浓度-时间曲线见表5和图13-16。采用TOPFIT软件，选用非隔室模型对血药浓度–时间数据进行处理，主要药动学参数见表6。

大鼠灌胃糖敏灵后的药动学特点

采用本方法研究了灌胃给药大鼠糖敏灵后4种蒽醌的药动力学行为。大鼠灌胃给予糖敏灵后，24h时大黄素、芦荟大黄素和大黄素甲醚的部分血浆样品浓度低于定量下限(LLOQ)，4种蒽醌药动学过程均符合二室开放模型；4个化合物结构相近，其药时曲线趋势一致。给药后，4种蒽醌在大鼠体内迅速被吸收，0.67h内即达峰值。大黄素的给药剂量高于大黄酚，芦荟大黄素的剂量与大黄酚相当，然而大黄素和芦荟大黄素C_max和AUC_{0- t}的都明显低于大黄酚。文献^[156]中灌胃给予大黄提取物后，芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的T1/2分别为3.2±0.7，5.7±0.7，5.6±1.7h，灌胃给予泻心汤后，大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的T_1/2分别为0.5±0.2，4.9±2.9，7.7±2.6，6.8±2.7h。本研究中4个蒽醌的T_1/2均大于20h，比文献报道T_1/2明显延长，表明可能由于糖敏灵中其他成分的影响，药物消除减慢；对于大黄素、大黄酚和大黄素甲醚而言，随着化合物极性的减弱，T_1/2延长，即消除速率降低，表明极性相对较弱的化合物组织亲和力相对较强，不易被机体消除，若单日内多次给药能显著提高其血药浓度，药效作用相对持久。

表1方法精密度与准确度

表2.待测物和内标的提取回收率(n=6)

表3.大鼠血浆中待测物和内标的基质效应(n=6)

表4.大鼠血浆中样品稳定性(n=3)

表5.大鼠灌胃给药糖敏灵后，大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均药时曲线(ng·mL^-1,n=9)

表6.大鼠灌胃给药糖敏灵后，大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的药动学参数(n=9)

实施例1：

LC-MS/MS条件

色谱柱：Hypersil Gold-C₁₈(150×2.1mm,5μm，Thermo)

预柱：Security Guard-C₁₈(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)

流动相：乙腈-0.05%氨水溶液(70:30)

柱温：25℃

流速：250μL·min^-1

离子源：电喷雾离子化源(ESI)

电离模式：负离子模式

MS/MS：选择反应监测(SRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z239→211(内标，1,8-二羟基蒽醌)，m/z253→225(大黄酚)，m/z269→225(大黄素)，m/z269→240(芦荟大黄素)，m/z283→240(大黄素甲醚)。

质谱参数：喷雾电压：3500V；离子源电压：10eV；毛细管温度：350℃；鞘气：N₂(35psi)；辅助气：N₂(10psi)；碰撞气体压力：Ar1.0mTorr(1Torr=133.3Pa)；1,8-二羟基蒽醌、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，30eV，25eV，23eV，26eV；扫描时间：0.5s。

溶液的制备

(1)标准系列溶液的配制取大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚适量，精密称定，分别置于10mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，获得浓度分别为0.154mg·mL^-1，0.152mg·mL^-1，0.212mg·mL^-1，0.122mg·mL^-1的对照品溶液。分别精密量取大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品溶液5.0，4.0，2.5，5.0mL，置于同一100mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为7.70μg·mL^-1，6.08μg·mL^-1，5.30μg·mL^-1，6.10μg·mL^-1的混合对照品储备液。

分别精密量取适量混合对照品储备液，甲醇稀释制成混合对照品溶液，其中大黄素浓度为3.850，11.55，38.50，96.2，192.5，385.0，770.0ng·mL^-1，芦荟大黄素浓度为3.040，9.12，30.40，76.00，152.0，304.0，608.0ng·mL^-1，大黄酚浓度为2.650，7.950，26.50，66.25，132.5，265.0，530.0ng·mL^-1，大黄素甲醚浓度为3.050，9.15，30.50，76.25，152.5，305.0，610.0ng·mL^-1

(2)内标溶液的配制取1,8-二羟基蒽醌对照品适量，精密称定，置于10mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，获得浓度为0.502mg·mL^-1的储备液。精密量取储备液0.05mL，置于100mL量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，获得浓度为251.0ng·mL^-1的内标溶液。

各储备液及标准系列溶液置4℃冰箱保存备用。

血浆样品预处理

取肝素抗凝血浆200μL，置2mL塑料EP管中，依次加入内标溶液50μL(1,8-二羟基蒽醌溶液，251.0ng·mL^-1)和甲醇100μL。涡旋混合10s，加入无水乙醚1.2mL，涡旋混合5min，8000r·min^-1离心5min，分取上层乙醚溶液于45℃下氮气吹干，残渣用100μL乙腈–水(7:3)溶解，12000r·min^-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。

实施例2

LC-MS/MS条件

色谱柱：Hypersil Gold-C₁₈(150×2.1mm,5μm，Thermo)

预柱：Security Guard-C₁₈(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)

流动相：乙腈-0.05%氨水溶液(70:30)

柱温：25℃

流速：250μL·min^-1

离子源：电喷雾离子化源(ESI)

电离模式：负离子模式

MS/MS：选择反应监测(SRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z239→211(内标，1,8-二羟基蒽醌)，m/z253→225(大黄酚)，m/z269→225(大黄素)，m/z269→240(芦荟大黄素)，m/z283→240(大黄素甲醚)。

质谱参数：喷雾电压：3000V；离子源电压：10eV；毛细管温度：350℃；鞘气：N₂(35psi)；辅助气：N₂(20psi)；碰撞气体压力：Ar1.0mTorr(1Torr=133.3Pa)；1,8-二羟基蒽醌、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，30eV，25eV，23eV，26eV；扫描时间：0.5s。

溶液的制备

(1)标准系列溶液的配制同实施例1。

(2)内标溶液的配制同实施例1。

血浆样品预处理

取肝素抗凝血浆200μL，置2mL塑料EP管中，依次加入内标溶液50μL(1,8-二羟基蒽醌溶液，251.0ng·mL^-1)和甲醇100μL。涡旋混合10s，加入无水乙醚1.2mL，涡旋混合5min，8000r·min^-1离心5min，分取上层乙醚溶液于45℃下氮气吹干，残渣用100μL乙腈–水(1∶1)溶解，12000r·min^-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。

实施例3

LC-MS/MS条件

色谱柱：Hypersil Gold-C₁₈(100×2.1mm,5μm，Thermo)

预柱：Security Guard-C₁₈(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)

流动相：乙腈-0.05%氨水溶液(70:30)

柱温：25℃

流速：300μL·min^-1

离子源：电喷雾离子化源(ESI)

电离模式：负离子模式

MS/MS：选择反应监测(SRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z239→211(内标，1,8-二羟基蒽醌)，m/z253→225(大黄酚)，m/z269→225(大黄素)，m/z269→240(芦荟大黄素)，m/z283→240(大黄素甲醚)。

质谱参数：喷雾电压：2500V；离子源电压：10eV；毛细管温度：350℃；鞘气：N₂(45psi)；辅助气：N₂(15psi)；碰撞气体压力：Ar1.0mTorr(1Torr=133.3Pa)；1,8-二羟基蒽醌、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，30eV，25eV，23eV，26eV；扫描时间：0.5s。

溶液的制备

(1)标准系列溶液的配制同实施例1。

(2)内标溶液的配制同实施例1。

血浆样品预处理

取肝素抗凝血浆200μL，置2mL塑料EP管中，依次加入内标溶液50μL(1,8-二羟基蒽醌溶液，251.0ng·mL^-1)和甲醇100μL。涡旋混合10s，加入无水乙醚1.2mL，涡旋混合5min，8000r·min^-1离心5min，分取上层乙醚溶液真空浓缩干燥，残渣用100μL乙腈-水(7:3)溶解，12000r·min^-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。

实施例4

LC-MS/MS条件

色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈（150×2.1mm,5μm，Agilent）

预柱：Security Guard-C₁₈(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)

流动相：乙腈-0.05%氨水溶液(70:30)

柱温：25℃

流速：250μL·min^-1

离子源：电喷雾离子化源(ESI)

电离模式：负离子模式

MS/MS：选择反应监测(SRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z239→211(内标，1,8-二羟基蒽醌)，m/z253→225(大黄酚)，m/z269→225(大黄素)，m/z269→240(芦荟大黄素)，m/z283→240(大黄素甲醚)。

质谱参数：喷雾电压：3500V；离子源电压：10eV；毛细管温度：350℃；鞘气：N₂(35psi)；辅助气：N₂(10psi)；碰撞气体压力：Ar1.0mTorr(1Torr=133.3Pa)；1,8-二羟基蒽醌、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，30eV，25eV，23eV，26eV；扫描时间：0.5s。

溶液的制备

(1)标准系列溶液的配制同实施例1。

(2)内标溶液的配制同实施例1。

血浆样品预处理

取肝素抗凝血浆200μL，置2mL塑料EP管中，依次加入内标溶液50μL(1,8-二羟基蒽醌溶液，251.0ng·mL^-1)和甲醇100μL。涡旋混合10s，加入无水乙醚1.2mL，涡旋混合5min，8000r·min^-1离心5min，分取上层乙醚溶液于45℃下氮气吹干，残渣用100μL乙腈–水(7:3)溶解，12000r·min^-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。

实施例5

LC-MS/MS条件

色谱柱：Hypersil Gold-C₁₈(150×2.1mm,5μm，Thermo)

预柱：Security Guard-C₁₈(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)

流动相：乙腈-0.05%氨水溶液(70:30)

柱温：25℃

流速：250μL·min^-1

离子源：电喷雾离子化源(ESI)

电离模式：负离子模式

MS/MS：选择反应监测(SRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z239→211(内标，1,8-二羟基蒽醌)，m/z253→225(大黄酚)，m/z269→225(大黄素)，m/z269→240(芦荟大黄素)，m/z283→240(大黄素甲醚)。

质谱参数：喷雾电压：3500V；离子源电压：10eV；毛细管温度：350℃；鞘气：N₂(35psi)；辅助气：N₂(10psi)；碰撞气体压力：Ar1.0mTorr(1Torr=133.3Pa)；1,8-二羟基蒽醌、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，30eV，25eV，23eV，26eV；扫描时间：0.5s。

溶液的制备

(1)标准系列溶液的配制同实施例1。

(2)内标溶液的配制同实施例1。

血浆样品预处理

取肝素抗凝血浆200μL，置2mL塑料EP管中，依次加入内标溶液50μL(1,8-二羟基蒽醌溶液，251.0ng·mL^-1)和甲醇800μL，涡旋混合2min，8000r·min^-1离心5min，分取上层溶液于45℃下氮气吹干，残渣用100μL乙腈–水(7:3)溶解，12000r·min^-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。

Claims (10)

1.一种液相色谱串联质谱法定量检测血浆样本中大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的方法，包括步骤(1)样品的制备和步骤(2)检测，其特征在于步骤(1)样品制备采用包括以下步骤的方法：

a.向待测样品中依次加入有机溶剂、内标溶液，并混匀；

b.加入一倍以上体积提取溶剂，混匀；

c.离心，收集上清液，并蒸干；

d.步骤c的干燥物重新溶解，离心，取上清液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述内标为1，8-二羟基蒽醌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述有机溶剂为甲醇。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中所述提取溶剂为乙醚。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d重新溶解所用溶剂为乙腈-水。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于液相色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙腈-0.01-0.1％氨水溶液，体积比为10∶90-90∶10。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述流动相为乙腈-0.05％氨水溶液体积比为70∶30

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为负离子选择反应监测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解电压分别为30eV，25eV，23eV，26eV。

10.如权利要求1至9任意一项在测定糖敏灵制剂药代动力学中的应用。

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