CN103235050A

CN103235050A - 三七总皂苷注射剂的质量控制方法

Info

Publication number: CN103235050A
Application number: CN2013101273054A
Authority: CN
Inventors: 方同华
Original assignee: HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2033-04-12
Also published as: CN103235050B

Abstract

本发明涉及一种三七总皂苷注射剂的质量控制方法，该方法包含色谱条件、检测方法，色谱条件为：使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.005%-0.02%乙酸水与0.005%-0.02%乙酸乙腈、0.005%-0.02%磷酸水与0.005%-0.02%磷酸乙腈，流速为0.95-1.0ml/min；检测波长为203nm；柱温为26-28℃；进样量为20μl。与现有方法比，本发明提供的质量控制方法设定了一个梯度洗脱条件能同时检测三七总皂苷注射剂中的十二种皂苷成分，且分离效果好，通过此方法的测定能有效的计算出十二种皂苷的含量，节省实验时间及费用。

Description

三七总皂苷注射剂的质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种三七总皂苷制剂的检测方法，具体涉及三七总皂苷注射剂的质量控制方法。

背景技术

三七的活性成分中，皂苷是三七主要有效活性成分，也是研究的较为系统的化学物质。现已从三七的不同部位分离得到54种单体皂苷成分，如三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd，其次还含有20(s)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1等，这些单体皂苷成分大多数为达玛烷型的20(s)-原人参二醇型和20-(s)原人参三醇型。三七的地下部分既有20(s)-原人参二醇型皂苷，也含20(s)原人参三醇型皂苷。

三七总皂苷制剂，如注射用血塞通、注射用血栓通、三七总皂苷注射液等，广泛用于治疗冠心病、心绞痛、心脑血栓，提高机体适应能力等，其主要成分为达玛烷型四环三萜皂苷。近年来，三七总皂苷制剂在医院的应用越来越广泛，占心血管药物的市场份额也连年增长。所以提高产品的质量及安全性，减少不良反应已经成为首要问题，也因此，必须提高药品的质量标准，以保证百姓的用药安全。

目前，三七总皂苷制剂的含量测定方法有很多，有光谱法和色谱法，其中HPLC由于对相似结构的化合物分离度高，定量分析精度高，但大多数方法就只能同时检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd这五种主要皂苷成分，或者是检测其中的一种成分。

夏泉等公开了一种HPLC检测三七总皂苷注射液的方法(夏泉等，三七总皂苷注射液HPLC指纹图谱的比较分析，《中成药》，2004年5月第26卷，第5期，345-348)，其色谱分析条件为：ZORBAX EclipseXDB-C18色谱柱，(Analystical 4.6cm*2.5cm)；乙腈-水二元梯度洗脱，0-6min，乙腈20％→30％；6-14min，乙腈30％→40％；14-25min，乙腈40％→30％；25-30min，乙腈30％→20％；流速为1.0ml/min，检测波长为203nm；进样量为20μl，柱温为40℃。

广州中医药大学的硕士论文，题目为“三七总皂苷HPLC方法研究及其应用”，公开了如下信息：1)色谱柱的选择，分离三七皂苷或人参皂苷的HPLC色谱柱，常见的填充剂有氨基硅烷键合硅胶和十八烷基硅烷键合硅胶，偶见辛烷基键合硅胶，十八烷基硅烷键合硅胶柱由于寿命长、分离效能稳定，因而应用更为广泛，作为注定质量标准的应用，选择十八烷基硅烷键合硅胶柱是更适宜的；2)流动相的选择，分离三七皂苷的RP-HPLC C18流动相条件，优于需要分离的皂苷成分多、极性分布较大，均需要进行梯度洗脱，流动相的种类有机相均采用乙腈，水相有醋酸铵溶液、醋酸铵-氨水溶液，磷酸溶液或水等，参考三七系列注射液现行国家标准及美国草药典西洋参的梯度条件，在满足分离需要的条件；3)检测方法的选择：三七皂苷的HPLC的常见检测方法为，紫外检测，蒸发光散射检测。其中紫外检测法简便、成熟、稳定，线性范围广，蒸发光散射检测器近年来新兴的通用型质量检测器，灵敏度高、不受溶剂影响，但线性范围窄，一起尚在继续完善之中，测定的重现性尚不能与紫外检测器相比，三七皂苷仅有紫外末端吸收、响应灵敏度不高、需要梯度洗脱而存在基线漂移等情况，因而相当一部分研究选用了蒸发光散射检测，但是，优于三七系列注射剂中的三七皂苷纯度高、浓度高，供试品不仅不需要纯化、浓缩处理，反倒需要进行适当的稀释才能进行测定，而且优于浓度高响应值高，梯度洗脱的基线漂移也不明显，因此，三七系列注射剂的质量标准选用HPLC紫外检测法是简便可行、更适合于作为法定质量标准的。

中国医学科学院药用植物研究所的发明名称为“一种含有微量三七总皂苷的样品的检测方法”(申请号：200410004783.7)，采用液相色谱-质谱联测定法测定酸水解三七总皂苷产物，其液相色谱条件为：液相色谱仪：Agilent1100 series，色谱柱：C18，5μm，2.1mm×5.0cm；流动相：乙腈∶甲醇∶1-5％的醋酸(磷酸)水溶液(20-40)∶(35-55)∶(20-30)，流速为0.2ml/min，进样量为20μl；质谱条件：离子源为Turbo Ionspray，喷射电压为4000V，扫描方式为多反应检测(MRM)，正离子检测，用于检测的离子为人参三醇的二级离子m/z477.4→423.4。

三七总皂苷注射剂中皂苷类成分较多，而且性质大多相似，检测过程中有些成分峰不能分离出来或者分离出来的成分峰分离效果不好，流动相的选择及洗脱程序的设定都直接影响各成分峰的分离程度及峰型，现有的大多数方法只是同时检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd这五种主要皂苷成分，或者是检测其中的一种成分。为了保证百姓的用药安全，必须提高药品的质量标准，应该对除了上述五种主成分以外的皂苷也进行检测。

因而，有必要发明一种三七总皂苷注射剂的质量监控方法，能够一次进样同时测定三七总皂苷注射剂中除三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd五种主成分以外其它皂苷的检测方法，来控制产品的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种三七总皂苷注射剂的质量控制方法。

本发明提供的一种三七总皂苷注射剂的质量控制方法，该方法包含色谱条件、检测方法，其中色谱条件为：使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.005％-0.02％乙酸水与0.005％-0.02％乙酸乙腈、0.005％-0.02％磷酸水与0.005％-0.02％磷酸乙腈，流速为0.95-1.0ml/min；检测波长为203nm；柱温为26-28℃；进样量为20μl。

上述方法中：

所述梯度洗脱是按照下表进行的：

具体的，本发明提供的质量控制方法中的色谱条件为：使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为203nm，流动相：为0.005％-0.02％乙酸水与0.005％-0.02％乙酸乙腈组合、0.005％-0.02％磷酸水与0.005％-0.02％磷酸乙腈的组合，线性梯度洗脱程序见下表：

按照梯度洗脱表运行90min；流速：0.95-1.0ml/min；检测波长：203nm；柱温：26-28℃；进样量：20μl。

更进一步具体的，本发明提供的质量控制方法包括以下步骤：

1)对照品的制备：分别取20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷XVII、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5对照品适量，精密称定，加70％甲醇-水溶液溶解，制成每1ml约含20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷XVII、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5对照品分别为0.55mg、0.40mg、0.55mg、0.090mg、0.25mg、0.070mg、0.40mg、0.10mg、0.20mg、0.75mg、0.035mg、0.15 mg的混合对照品储备液，精密量取混合对照品储备液适量，加浓度为50％甲醇-水的溶液稀释，制成浓度为含对照品储备液25％的溶液，即得对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：取相当于三七总皂苷约50mg的三七总皂苷注射剂于5.0ml量瓶中，精密称定或量取，加入50％甲醇-水溶液至近刻度，超声溶解5min，冷却至室温，加50％甲醇-水溶液定容至5.0ml，混匀，即得供试品溶液；

3)使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为203nm，流动相：0.005％-0.02％乙酸水与0.005％-0.02％乙酸乙腈组合或0.005％-0.02％磷酸水与0.005％-0.02％磷酸乙腈的组合，线性梯度洗脱程序见下表：

按照梯度洗脱表运行90min；流速：0.95ml/min-1.0ml/min；检测波长：203nm；柱温：26-28℃；进样量：20μl。

上述方法中：

所述三七总皂苷注射剂为三七总皂苷冻干粉针、三七总皂苷注射液，优选为注射用血塞通、注射用血栓通、血塞通注射液或血栓通注射液。

所述流动相优选为0.005％-0.02％乙酸水和0.005％-0.02％乙酸乙腈，进一步优选为0.01％乙酸水和0.01％乙酸乙腈；

所述0.005％-0.02％乙酸(磷酸)水是指每1000ml水中含有0.05-0.2ml乙酸(磷酸)；

所述0.005％-0.02％乙酸(磷酸)乙腈是指每1000ml乙腈中含有0.05～0.2ml乙酸(磷酸)；

所述70％甲醇-水溶液是指70ml的甲醇与30ml的水配制而成；

所述50％甲醇-水溶液是指50ml的甲醇与50ml的水配制而成；

所述步骤2)供试品溶液的制备中，注射液的量取是根据三七总皂苷的含量为基础进行的，如注射液的规格是5ml：50mg，那么量取5ml的注射液即符合“取相当于三七总皂苷约50 mg的三七总皂苷注射剂”的标准。

本发明提供的三七总皂苷注射剂的质量控制方法具有以下优点：

1、色谱条件：

1)流动相的选择：

现有的三七皂苷类的检测方法常采用高效液相法乙腈-水二元梯度洗脱，由于三七总皂苷注射剂中的皂苷类成分性质大多相似，检测过程中有些成分峰不能分离出来或者分离出来的成分峰分离效果不好，流动相的选择及洗脱程序的设定都直接影响各成分峰的分离程度及峰型，现公开的梯度洗脱程序都只能分离少量的几种皂苷。

本发明提供的梯度洗脱程序通过洗脱时间及流动相的比例变化能够有效的分离三七总皂苷注射剂中的十二种皂苷，乙酸(磷酸)的加入也起到了解决成分峰的前沿和拖尾的现象，改善了峰型，从而使各成分峰之间能够很有效的分离。

发明人分别考察了0.005％乙酸(磷酸)乙腈-0.005％乙酸(磷酸)水、0.01％乙酸(磷酸)乙腈-0.01％乙酸(磷酸)水、0.02％乙酸(磷酸)乙腈-0.02％乙酸(磷酸)水流动相体系下分析的同一批次注射用血塞通(冻干)样品。流动相中添加乙酸(磷酸)浓度变化对所获取的注射用血塞通(冻干)色谱图各分析物峰分离度无明显影响。

表明，本发明所建的质量控制方法在流动相中添加剂乙酸浓度为0.005％-0.02％浓度范围内分离效果良好。

2)流速波动对分析物分离度的影响：

通过考察0.95ml/min、1.0ml/min、1.05ml/min流速条件下分析的同一批次注射用血塞通(冻干)样品。在0.95-1.0ml/min流速范围内流速波动对所获取的注射用血塞通(冻干)色谱图的各分析物峰分离度无明显影响。但流速增加至1.05ml/min时，20(S)-三七皂苷R2与其相邻的峰分离度不佳。

表明本发明提供的质量监控方法在0.95-1.0ml/min流速范围内各成分峰的分离效果良好。

3)柱温波动对分析物分离度的影响

考察了26、28℃和30℃柱温条件下分析的同一批次注射用血塞通(冻干)样品。在26-28℃温度范围内所获取的注射用血塞通(冻干)色谱图各分析物峰分离度无明显影响。但温度增加至30℃时，20(S)-三七皂苷R2与其相邻的峰分离度稍差。

表明本发明提供的质量监控方法在26-28℃温度范围内耐用性良好。

2、与现有方法比，本发明提供的质量控制方法的优势在于：通过高效液相色谱法设定一个梯度洗脱条件能同时检测三七总皂苷注射剂中的十二种皂苷成分，而且分离效果好，通过此方法的测定能有效的计算出十二种皂苷的含量，节省实验时间及费用。

附图说明

图1：流动相中添加剂乙酸浓度变化对分析物分离度的影响；

图2：流速波动对分析物分离度的影响；

图3：柱温波动对分析物分离度的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所述对照品可通过市售购买获得，下列厂家的列举只是为了说明对照品的可得性，而不应该构成对本发明的限制，其中：

20(S)-人参皂苷Rg2(HPLC纯度：99.06％)、20(S)-人参皂苷Rh1(HPLC纯度：98.80％)、20(R)-人参皂苷Rh1(HPLC纯度：98.77％)、人参皂苷Rb2(HPLC纯度：99.03％)、人参皂苷F1(HPLC纯度：99.62％)、七叶胆苷XVII(HPLC纯度：98.83％)、人参皂苷F2(HPLC纯度：95.10％)，上述对照品可通过市售购买，购于上海融禾医药科技发展有限公司；

20(S)-三七皂苷R2(HPLC纯度：98.26％)、人参皂苷Rk3(HPLC纯度：99.73％)、人参皂苷Rh4(HPLC纯度：100％)、人参皂苷Rk1(HPLC纯度：98.91％)、人参皂苷Rg5(HPLC纯度：98.45％)，上述对照品购于黑龙江珍宝岛药业股份有限公司。

如无特殊说明，本发明的mm、ml、min、nm、μl、mg、μg、纯度％属于本领域公知的单位，分别为毫米、毫升、分钟、纳米、微升、毫克、微克、重量百分含量等的简写。

实施例1：对三七总皂苷注射剂的检测

1、仪器与试药

1.1仪器：Agilent 1100型高效液相色谱仪，配脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器(Agilent公司)；Mill-Q超纯水器(Millipore公司)；Mettler XS105型电子天平(Mettler公司)；mini spin离心机(eppendorf公司)。

1.2试剂：乙腈、甲醇为色谱纯(Merck公司)，乙酸为色谱纯(ROCScientific公司)其余试剂均为分析纯，水为Milli-Q超纯水。

1.3对照品：

20(S)-人参皂苷Rg2(HPLC纯度：99.06％)、20(S)-人参皂苷Rh1(HPLC纯度：98.80％)、20(R)-人参皂苷Rh1(HPLC纯度：98.77％)、人参皂苷Rb2(HPLC纯度：99.03％)、人参皂苷F1(HPLC纯度：99.62％)、七叶胆苷XVII(HPLC纯度：98.83％)、人参皂苷F2(HPLC纯度：95.10％)；

20(S)-三七皂苷R2(HPLC纯度：98.26％)、人参皂苷Rk3(HPLC纯度：99.73％)、人参皂苷Rh4(HPLC纯度：100％)、人参皂苷Rk1(HPLC纯度：98.91％)、人参皂苷Rg5(HPLC纯度：98.45％)。

1.4样品：

注射用血塞通(冻干)、注射用血栓通(冻干)、血塞通注射液、血栓通注射液。

2、色谱条件与洗脱程序

2.1色谱条件：Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)，配phenomenex在线过滤柱；流动相：0.01％乙酸水(A)和0.01％乙酸乙腈(B)，线性梯度洗脱程序：0 min 19％B，30 min 21％B，35 min28％B，41 min 32％B，52 min 32％B，70 min 53％B，80 min 90％B，运行90 min；流速：1.0 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：28℃；进样量：20μl。

3、供试品溶液的制备

取相当于含三七总皂苷约50mg的三七总皂苷注射剂(注射用血塞通(冻干)、注射用血栓通(冻干)直接使用，而血塞通注射液和血栓通注射液则根据三七总皂苷的含量量取)于5.0 ml量瓶中，精密称定或量取，加入50％甲醇-水溶液(v/v)至近刻度，超声溶解5 min，冷却至室温，加50％甲醇-水溶液定容至5.0 ml，混匀，即得供试品溶液。

4、对照品溶液的制备

分别取20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷XVII、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5对照品适量，精密称定，加70％甲醇-水溶液(v/v)溶解，制成每1ml约含20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷X VII、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5对照品分别为0.55mg、0.40mg、0.55mg、0.090mg、0.25mg、0.070mg、0.40mg、0.10mg、0.20mg、0.75mg、0.035mg、0.15 mg的混合对照品储备液，精密量取混合对照品储备液适量，加浓度为50％甲醇-水的溶液稀释，制成浓度为含对照品储备液25％的溶液，即得对照品溶液。

5、线性关系考察

分别取20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷X VII、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5对照品适量，精密称定，加70％甲醇-水溶液(v/v)溶解，制成每1ml含20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷X VII、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5对照品分别为556μg、408μg、560μg、90.5μg、269μg、69.7μg、377μg、96.4μg、199μg、748μg、33.4μg、137μg的混合对照品储备液，精密量取混合对照品储备液适量，加浓度为50％的甲醇-水溶液稀释，分别制成1/1、1/2、1/3、1/4、1/8和1/16对照品储备液的对照品溶液，然后分别进样分析一系列浓度的对照品溶液，以各成分的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到12种成分的线性回归方程和相关系数。结果见表1。

表1：12种皂苷类成分的标准曲线回归方程

表1结果显示，线性关系良好(R＞0.999)。

6、方法专属性试验

取注射用血塞通(冻干)供试品溶液，按含量测定色谱条件进样分析，联用二极管阵列检测器(波长扫描范围：190-400 nm)。分析各分析物的峰纯度，结果各分析物峰纯度均在纯度角阈值之内，本发明提供的质量控制方法专属性良好。

7、仪器精密度试验

取注射用血塞通(冻干)供试品溶液，按含量测定色谱条件连续进样6次，结果见表2、表3。

表2：精密度试验(通过保留时间计算)

表3：精密度试验(通过峰面积计算)

表2、3结果表明：各对照品保留时间RSD均小于0.1％，峰面积RSD均小于1.0％。仪器精密度良好。

8、方法重复性试验

取同一批次样品，按供试品溶液制备方法分别制备6份样品溶液，按含量测定方法分别测定，按标准曲线法计算20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷X VII、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5含量，结果见表4。

表4：6份样品中三七总皂苷各成分的含量(n＝6)

表4结果表明：注射用血塞通(冻干)中12种皂苷类成分含量RSD小于1.4％。

结果表明：本发明提供的质量控制方法具良好重复性。

9、稳定性试验

吸取同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、1 8和24 h进样分析，结果见表5。

表5：样品稳定性试验

表5结果显示：各峰峰面积RSD均小于1.5％。

结果表明：供试品溶液在室温24 h内样品稳定性较好。

10、准确度试验

取9份已知含量的注射用血塞通(冻干)各25mg，于5.0ml量瓶中，精密称定，分别加入相当于制剂含量80％、100％、120％量的对照品溶液，按供试品制备方法制成低、中、高各3份的加样回收率供试品溶液，按含量测定方法进样分析，标准曲线法计算20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷X VII、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5的含量，并计算各自的加样回收率，结果见表6。

表6：加样回收率试验

表6结果表明，各回收率的RSD均小于1.5％，本发明提供的质量控制方法的准确度良好。

11、定量限与检测限

取混合对照品溶液，用50％甲醇-水溶液(v/v)依次稀释制成一系列由高到低的梯度浓度溶液，测定信噪比为10(S/N＝10)时的进样浓度为定量限，测定信噪比为3(S/N＝3)时的进样浓度为检测限。结果20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷X VII、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5的定量限分别为8.69μg/ml、6.38μg/ml、8.75μg/ml、2.38μg/ml、8.42μg/ml、4.36μg/ml、5.88μg/ml、6.03μg/ml、3.12μg/ml、11.7μg/ml、2.09μg/ml、8.55μg/ml；检测限分别为4.34μg/ml、3.19μg/ml、4.38μg/ml、1.41μg/ml、4.21μg/ml、2.18μg/ml、2.94μg/ml、3.01μg/ml、1.56μg/ml、5.84μg/ml、1.04μg/ml、4.28μg/ml。

12、样品测定

取注射用血塞通(冻干)(样品1、样品2、样品3)、注射用血栓通(冻干)(样品4)、血塞通注射液(样品5)、血栓通注射液(样品6)，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样分析，以标准曲线法计算注射液中12种皂苷类成分的含量，结果见表7。

表7：高效液相色谱法测定样品中12种皂苷类成分含量

表7结果表明，用本发明提供的质量控制方法检测三七总皂苷注射剂，各成分峰的分离效果好，该检测方法准确度高、专属性强、耐受性好，具备分析方法的可控性、可操作性及可重复性。

实施例2：对三七总皂苷注射剂的检测

取注射用血塞通(冻干)、注射用血栓通(冻干)、血塞通注射液、血栓通注射液，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样分析，计算注射剂中12种皂苷类成分的含量，其中检测方法如下：

1、色谱条件与洗脱程序：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6mm i.d.，5μm)，配phenomenex在线过滤柱；流动相：0.005％乙酸水(A)和0.005％乙酸乙腈(B)，线性梯度洗脱程序：0 min 19％B，30 min21％B，35 min 28％B，41 min 32％B，52 min 32％B，70 min 53％B，80 min 90％B，运行90 min；流速：0.95 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：26℃；进样量：20 μl。

2、供试品溶液的制备：参照实施例1。

3、对照品溶液的制备：参照实施例1。

4、检测结果：见表8

表8：高效液相色谱法测定样品中12种皂苷类成分含量

表8结果显示：通过改变乙酸的浓度、流速及柱温的方法测定注射用血塞通(冻干)、注射用血栓通(冻干)、血塞通注射液、血栓通注射液的含量与实施例1的数据无明显差别。

结果表明：本发明提供的检测方法可以用作三七总皂苷注射剂的质量监控。

实施例3：对三七总皂苷注射剂的检测

取注射用血塞通(冻干)、注射用血栓通(冻干)、血塞通注射液、血栓通注射液，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样分析，计算注射剂中12种皂苷类成分的含量其中检测方法为：

1、色谱条件与洗脱程序：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6mm i.d.，5μm)，配phenomenex在线过滤柱；流动相：0.02％乙酸水(A)和0.02％乙酸乙腈(B)，线性梯度洗脱程序：0 min 19％B，30 min21％B，35 min 28％B，41 min 32％B，52 min 32％B，70 min 53％B，80 min 90％B，运行90 min；流速：1.0 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：28℃；进样量：20 μl。

2、供试品溶液的制备：参照实施例1。

3、对照品溶液的制备：参照实施例1。

4、检测结果：见表9

表9：高效液相色谱法测定样品中12种皂苷类成分含量

表9结果表明：通过改变乙酸的浓度、流速及柱温的方法测定注射用血塞通(冻干)、注射用血栓通(冻干)、血塞通注射液、血栓通注射液的含量与实施例1的数据无明显差别，本发明提供的检测方法可以用作三七总皂苷注射剂的质量控制。

实施例4：对三七总皂苷注射剂的检测

取注射用血塞通(冻干)按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按不同色谱条件进样分析，考察其分离效果，检测方法如下：

1、色谱条件与洗脱程序：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6mm i.d.，5μm)，配phenomenex在线过滤柱；流动相：①0.005％乙酸水(A)和0.005％乙酸乙腈(B)②0.01％乙酸水(A)和0.01％乙酸乙腈(B)③0.02％乙酸水(A)和0.02％乙酸乙腈(B)；线性梯度洗脱程序：0 min19％B，30 min 21％B，35 min 28％B，41 min 32％B，52 min 32％B，70 min 53％B，80 min 90％B，运行90 min；流速：1.0 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：28℃；进样量：20μl。

2、供试品溶液的制备：参照实施例1。

3、对照品溶液的制备：参照实施例1。

4、检测结果：见图1。

图1结果显示：流动相中添加剂乙酸浓度变化对所获取的注射用血塞通(冻干)色谱图各分析物峰分离度无明显影响。

结果表明：本发明提供的质量控制方法在流动相中添加剂乙酸浓度为0.005％-0.02％浓度范围内耐用性良好。而且由图1可以看出，乙酸浓度为0.01％时，各峰的分离度及峰形更优。

实施例5：对三七总皂苷注射剂的检测

取注射用血塞通(冻干)按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样分析，计算注射剂中12种皂苷类成分的含量，检测方法如下：

1、色谱条件与洗脱程序：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6mm i.d.，5μm)，配phenomenex在线过滤柱；流动相：①0.005％磷酸水(A)和0.005％磷酸乙腈(B)②0.01％磷酸水(A)和0.01％磷酸乙腈(B)③0.02％磷酸水(A)和0.02％磷酸乙腈(B)；线性梯度洗脱程序：0 min19％B，30 min 21％B，35 min 28％B，41 min 32％B，52 min 32％B，70 min 53％B， 80 min 90％B，运行90 min；流速：1.0 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：28℃；进样量：20 μl。

2、供试品溶液的制备：参照实施例1。

3、对照品溶液的制备：参照实施例1

4、检测结果：见表10。

表10：高效液相色谱法测定样品中12种皂苷类成分含量

表10结果显示：将流动相中的添加剂乙酸换成磷酸后按原测定方法测定注射用血塞通(冻干)的含量与用实施例4中使用乙酸的数据无明显差别，而且各成分峰的分离效果良好。但是流动相添加乙酸时，各成分峰的峰型更好。

结果表明：可以选用磷酸作为该色谱条件流动相的添加剂，但是选用乙酸作为该色谱条件流动相的添加剂效果更优。

实施例6：对三七总皂苷注射剂的检测

1、色谱条件与洗脱程序：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6mm i.d.，5μm)，配phenomenex在线过滤柱；流动相：0.01％乙酸水(A)和0.01％乙酸乙腈(B)；线性梯度洗脱程序：0 min 19％B，30 min21％B，35 min 28％B，41 min 32％B，52 min 32％B，70 min 53％B，80 min 90％B，运行90 min；流速：①0.95 ml/min②1.0 ml/min③1.05ml/min；检测波长：203 nm；柱温：28℃；进样量：20μl。

2、供试品溶液的制备：参照实施例1。

3、对照品溶液的制备：参照实施例1。

4、检测结果：见图2。

图2结果结果显示：在0.95-1.0ml/min流速范围内流速波动对所获取的注射用血塞通(冻干)色谱图的各分析物峰分离度无明显影响。但流速增加至1.05 ml/min时，20(S)-三七皂苷R2与其相邻的峰分离度不佳。

结果表明：本发明提供的质量控制方法在0.95-1.0 ml/min流速范围内耐用性良好。0.95-1.0 ml/min流速范围内各成分峰的分离度及峰型基本一致，但流速为1.0 ml/min出峰时间更快，更节约实验时间，所以更优。

实施例7：对三七总皂苷注射剂的检测

1、色谱条件与洗脱程序：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6mm i.d.，5μm)，配phenomenex在线过滤柱；流动相：0.01％乙酸水(A)和0.01％乙酸乙腈(B)；线性梯度洗脱程序：0 min 19％B，30 min21％B，35 min 28％B，41 min 32％B，52 min 32％B，70 min 53％B，80 min 90％B，运行90 min；流速：1.0 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：①26℃②28℃③30℃；进样量：20 μl。

2、供试品溶液的制备：参照实施例1。

3、对照品溶液的制备：参照实施例1。

4、检测结果：见图3

图3结果显示：在26-28℃温度范围内所获取的注射用血塞通(冻干)色谱图各分析物峰分离度无明显影响。但温度增加至30℃时，20(S)-三七皂苷R2与其相邻的峰分离度稍差。

结果表明：本发明提供的质量控制方法在26-28℃温度范围内耐用性良好。柱温为28℃时，各成分峰的峰型更好。

实验总结：汇总实验例1-7可知，本发明提供的质量控制方法中色谱条件为0.005％-0.02％乙酸水与0.005％-0.02％乙酸乙腈、0.005％-0.02％磷酸水与0.005％-0.02％磷酸乙腈设定了一个梯度洗脱条件能同时检测三七总皂苷注射剂中的十二种皂苷成分，且分离效果好，通过此方法的测定能有效的计算出十二种皂苷的含量，节省实验时间及费用；该方法适用于所有三七总皂苷注射剂的含量测定；其中流动相为0.005％-0.02％乙酸水与0.005％-0.02％乙酸乙腈、0.005％-0.02％磷酸水与0.005％-0.02％磷酸乙腈，优选为0.005％-0.02％乙酸水与0.005％-0.02％乙酸乙腈，当流动相为0.01％乙酸水和0.01％乙酸乙腈，更能使各成分峰之间很有效的分离。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种三七总皂苷注射剂的质量控制方法，该方法包含色谱条件、检测方法，其特征在于，色谱条件为：使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.005%-0.02%乙酸水与0.005%-0.02%乙酸乙腈、0.005%-0.02%磷酸水与0.005%-0.02%磷酸乙腈，流速为0.95-1.0ml/min；检测波长为203nm；柱温为26-28℃；进样量为20μl。

2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述梯度洗脱是按照下表进行的：

3.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述色谱条件为：使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为203nm，流动相：为0.005%-0.02%乙酸水与0.005%-0.02%乙酸乙腈组合、0.005%-0.02%磷酸水与0.005%-0.02%磷酸乙腈的组合，线性梯度洗脱程序见下表：

4.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法包括以下步骤：

1）对照品的制备：分别取20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷ⅩⅦ、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5对照品适量，精密称定，加70%甲醇-水溶液溶解，制成每1ml约含20(S)-三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷F1、七叶胆苷ⅩⅦ、人参皂苷F2、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5对照品分别为0.55mg、0.40mg、0.55mg、0.090mg、0.25mg、0.070mg、0.40mg、0.10mg、0.20mg、0.75mg、0.035mg、0.15mg的混合对照品储备液，精密量取混合对照品储备液适量，加浓度为50%甲醇-水的溶液稀释，制成浓度为含对照品储备液25%的溶液，即得对照品溶液；

2）供试品溶液的制备：取相当于三七总皂苷约50mg的三七总皂苷注射剂于5.0ml量瓶中，精密称定或量取，加入50%甲醇-水溶液至近刻度，超声溶解5min，冷却至室温，加50%甲醇-水溶液定容至5.0ml，混匀，即得供试品溶液；

3）使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为203nm，流动相：0.005%-0.02%乙酸水与0.005%-0.02%乙酸乙腈组合或0.005%-0.02%磷酸水与0.005%-0.02%磷酸乙腈的组合，线性梯度洗脱程序见下表：

5.根据权利要求1-4任一项所述的质量控制方法，其特征在于，所述三七总皂苷注射剂为三七总皂苷冻干粉针或三七总皂苷注射液。

6.根据权利要求5所述的质量控制方法，其特征在于，所述三七总皂苷注射剂为注射用血塞通、注射用血栓通、血塞通注射液或血栓通注射液。

7.根据权利要求1-4任一项所述的质量控制方法，其特征在于，所述流动相为0.005%-0.02%乙酸水和0.005%-0.02%乙酸乙腈。

8.根据权利要求7所述的质量控制方法，其特征在于，所述流动相为0.01%乙酸水和0.01%乙酸乙腈。

9.根据权利要求1-4任一项所述的质量控制方法，其特征在于，所述0.005%-0.02%乙酸水是指每1000ml水中含有0.05-0.2ml乙酸。

10.根据权利要求1-4任一项所述的质量控制方法，其特征在于，所述步骤2）供试品溶液的制备中，注射液的量取是根据三七总皂苷的含量为基础进行的，如注射液的规格是5ml：50mg，那么量取5ml的注射液即符合“取相当于三七总皂苷约50mg的三七总皂苷注射剂”的标准。