CN107402260A - 一种药物组合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种药物组合物的检测方法，具体涉及对包含黄芪、女贞子和大黄的药物组合物利用液相色谱法进行定性和定量检测。所用液相色谱测定条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的磷酸溶液，采用梯度洗脱。该方法具有准确、快速、可重复性好等优点，能够同时对药物组合物中的多成分进行同时检测，可全面反映黄芪、大黄和女贞子药材的投放情况。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种药物组合物的检测方法。
背景技术
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜夹黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。主产于内蒙古、山西、黑龙江等地。味甘，性微温，归肺、脾经。具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌功效，用于气虚乏力，中气下陷，痈疽难溃，久溃不敛等。《神农本草经》：“主治痈疽，久败疮，排脓止痛……补虚”。《本草汇言》：“补肺健脾，实卫敛汗，驱风运毒之药也”。现代药理学研究表明，黄芪具有：促进机体代谢、抗疲劳、抗缺氧、抗衰老、保肝、降糖降脂等作用。黄芪含有皂苷类(如黄芪甲苷)、黄酮类(如毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素)、多糖类(如AG-1)等化合物。其中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪特征性化合物，现已作为2015版药典质量控制的含量测定指标。女贞子，为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait的干燥成熟果实，原生于中国长江流域及南方各地。始见于《神农本草经》，列为上品，上品乃指无毒，久服可以轻身、延年益寿而无害。女贞子味甘、苦、性凉；归肝、肾经；具有滋补肝肾，明目乌发功效；用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明，内热消渴，骨蒸潮热等。《本草经疏》：“女贞子，气味俱阴，正入肾除热补精之要品，肾得补，则五脏自安，精神自足，百病去而身肥健矣”。《本草纲目》：“强阴，健腰膝，明目”。现代药理学研究表明：女贞子具有：保肝、抗氧化防衰老、免疫调节、降糖降脂、强心、抗癌等作用。女贞子含有三萜类(如齐墩果酸、熊果酸)、环烯醚萜类(如特女贞苷、女贞苷)、黄酮类(如槲皮素、芹菜素)、苯乙醇苷类(如红景天苷、毛蕊花苷)等化合物。其中，其中特女贞苷是女贞子特征性化合物，现已作为2015版药典质量控制的含量测定指标。大黄为寥科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根和根茎。《中国药典》记载该品具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄的功效。用于实热积滞便秘，血热吐衄，目赤咽肿，痈肿疔疮，肠痈腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，跌打损伤，湿热痢疾，黄疸尿赤，淋证，水肿；外治烧烫伤等功效。文献记载其泻下作用主要与蒽醌类物质有关，《中国药典》也以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚为指标成分，通过液相色谱法同时控制其游离蒽醌和总蒽醌。所以有必要将蒽醌成分作为指标成分，纳入含大黄药物的质量控制标准中。另药理研究发现，蒽酮类成分(番泻B等)较蒽醌类具有更强的泻下功效，因此有必要将其与蒽醌类成分一起加以控制。渴络欣胶囊是由黄芪、女贞子、水蛭、大黄、太子参、枸杞子经现代制剂工艺制备而成的复方制剂，主治为益气养阴、活血化瘀。用于糖尿病肾病属气阴两虚兼夹血瘀证，症见咽干口燥，倦怠乏力，多食易饥，气短懒言，五心烦热，肢体疼痛，尿混或浑浊；同时研究发现，其可以治疗由新生血管引起的疾病，譬如肿瘤、眼部新生血管性疾病。
在中药鉴定及中药质量控制方面，色谱法由于方法简便、快速，并且可以同时反映化学组成及含量情况，已经成为应用范围最广，最主要的方法之一。常用的色谱法有以下几种：高效液相色谱法(HPLC)，薄层色谱法(TLC)，气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等。其中，HPLC由于分离效率高、分析速度快、灵敏、检测手段多样性，不受样品挥发度及热稳定性的限制等特点，已经越来越多地被应用于中药的质量控制当中，尤其是复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。目前，现行的标准仅对黄芪药材中的指标性成分黄芪甲苷进行了含量控制，即以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(32:68)为流动相，以蒸发光散射为检测器，对黄芪甲苷的含量进行定性及定量分析。虽然对于高效液相色谱法单独定性或定量检测一种或两种药物的活性成分有一定的报道，如CN201410373774.9以乙腈为流动相A，0.2％甲酸溶液为流动相B，对黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量进行了测定；CN201210167274.0以0.1％(体积比)的甲酸水溶液为流动相1，0.1％(体积比)的甲酸乙腈溶液为流动相2，进行梯度洗脱，同时测定了毛蕊异黄酮葡萄糖苷、大黄素、大黄酸3种成分；CN201510310257.1以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相，采用液相色谱法来检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷A和/或番泻苷；陈兴田等[陈兴田，HPLC法测定导赤丸中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量，中国医药指南，2011，27(9)：179-180]采用流动相A：100％乙腈-0.1％磷酸B，以梯度浓度洗脱，测定了大黄蜇虫丸中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚5中成分的含量；王哲等[王哲，HPLC测定不同来源大黄中蒽醌和二蒽酮类成分，中草药，2011，42，6，1114-1118]以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相，建立同时测定大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和番泻苷A、番泻苷B的HPLC法，并对不同来源的大黄样品进行测定；盘红梅等[盘红梅，HPLC梯度洗脱法同时测定固肾生发丸中6中成分含量，世界科学技术-中医药现代化，2015，17，1，124-127]人建立了一种反相高效液相色谱法，以甲醇-乙腈(2:1)为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，进行梯度洗脱，同时测定了大黄素、大黄素甲醚、特女贞苷等6中成分。然而，这些报道的检测物质较为单一，均未涉及黄芪、女贞子和大黄活性成分的同时检测。如申请人通过对比试验发现，盘红梅等报道的方法只能检出毛蕊异黄酮葡萄糖苷和特女贞苷，且毛蕊异黄酮葡萄糖苷有包峰现象，特女贞苷与后一色谱法分离度差；专利CN201510310257.1的方法在30min只检测出3个色谱峰，且峰1与峰2包裹在一起。
如何能够快速、简便、准确可靠检测药材中多种成分，用以更好的定性、定量的控制中药的质量变得尤为重要。
发明内容
为了更好地控制包含黄芪、女贞子和大黄的药物组合物的质量，本发明通过大量的实验研究，获得了一种准确可靠、快速、稳定的药物组合物质量控制方法。
本发明提供一种药物组合物的检测方法，该方法采用高效液相色谱法进行，其中所述液相色谱测定条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的磷酸溶液，采用梯度洗脱。
上述检测方法中梯度洗脱的程序优选如下程序：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 12 | 88 |
| 25 | 17 | 83 |
| 35 | 17 | 83 |
| 45 | 35 | 65 |
| 55 | 66 | 34 |
| 65 | 90 | 10 |
| 66 | 12 | 88 |
| 75 | 12 | 88 |
本发明提供的药物组合物的检测方法，其药物组合物为含有黄芪和/或女贞子的药物组合物。优选地，本发明的药物组合物包含黄芪、女贞子和大黄。更优选地，本发明的药物组合物由黄芪、女贞子、水蛭、大黄、太子参和枸杞子制备而成。具体地，本发明的药物组合物为渴络欣胶囊。
本发明提供的药物组合物的检测方法，所述液相色谱条件中，柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm。
本发明提供的检测方法，当供试品由黄芪、女贞子、水蛭、大黄、太子参和枸杞子制备而成，供试品的制备方法为取药物组合物适量，用甲醇溶解，超声提取，离心后取上清液即得；超声提取时间优选为1h。
当供试品仅为女贞子药材，供试品的制备方法为取供试品粉末(过三号筛)适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇溶解，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
当供试品仅为黄芪药材，供试品的制备方法为取本品粉末(过四号筛)适量，精密称定，置圆底烧中，精密加入甲醇溶解，称定重量，加热回流，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液适量，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
本发明提供的检测方法，进一步包含以下步骤：
1)对照品溶液的制备
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和番泻B对照品适量，加甲醇溶解；
2)供试品溶液的制备
取由黄芪、女贞子、水蛭、大黄、太子参和枸杞子制成的药物组合物适量，用甲醇溶解，超声，离心，取上清液；
3)含量测定
取对照品溶液、供试品溶液各10μl注入液相色谱，进行含量测定；
其中色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，柱温为30℃，流速为0.1ml/min，检测波长为254nm，梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 12 | 88 |
| 25 | 17 | 83 |
| 35 | 17 | 83 |
| 45 | 35 | 65 |
| 55 | 66 | 34 |
| 65 | 90 | 10 |
| 66 | 12 | 88 |
| 75 | 12 | 88 |
上述步骤1)的对照品溶液中，各成分浓度分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷5.00μg/ml，番泻苷B 25.00μg/ml，特女贞苷20.00μg/ml，芦荟大黄素2.40μg/ml，大黄酸4.50μg/ml，大黄素6.00μg/ml，大黄酚11.50μg/ml，大黄素甲醚10.00μg/ml。
上述步骤2)中制备供试品溶液时，取由黄芪、女贞子、水蛭、大黄、太子参和枸杞子制成的药物组合物1g，精密称定，置50ml容量瓶中，加甲醇适量，超声处理1h，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，离心5min，取上清液即得。
本发明所提供的药物组合物的质量控制方法与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明能够实现药物组合物中8种成分的同时检测，应用于大生产，可以全面反映黄芪、大黄、女贞子的药材投放情况，更好地监控药物质量。
2、本发明的色谱峰分离度好，基线波动不大，能准确检测各成分含量。
3、本发明的检测方法准确、快速、可重复性好。
附图说明
图1为实施例1中对照品(a)和供试品(b)的HPLC色谱图，
其中，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰2为番泻苷B，峰3为特女贞苷，峰4为芦荟大黄素，峰5为大黄酸，峰6为大黄素，峰7为大黄酚，峰8为大黄素甲醚；
图2为对比例1中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰2为特女贞苷；
图3为对比例2中供试品的HPLC色谱图；
图4为对比例3中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰2为特女贞苷；
图5为对比例4中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰2为特女贞苷；
图6为对比例5中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰2为特女贞苷；
图7为对比例6中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰2为特女贞苷；
图8为对比例7中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷；
图9为对比例8中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷；
图10为对比例9中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为大黄酸；
图11为对比例10中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为大黄酸；
图12为对比例11中供试品的HPLC色谱图，其中，峰1为大黄酸；
图13为实施例2中对照品(a)和供试品(b)的HPLC色谱图，其中，峰1为特女贞苷；
图14为实施例3中对照品(a)和供试品(b)的HPLC色谱图，其中，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷。
具体实施方式
本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明，并不能用于限制本发明的保护范围。
实施例1
1、样品
对照品：毛蕊异黄酮葡萄糖苷(来源：中国食品药品检定研究院批次：111920-201304)，番泻苷B(来源：成都曼斯特批次：MUST_14060715)，特女贞苷(来源：中国食品药品检定研究院批次：111926-201404)，芦荟大黄素(来源：中国药品生物制品检定所批次：110795-201007)，大黄酸(来源：中国药品生物制品检定所批次：110757-200206)，大黄素(来源：中国食品药品检定研究院批次：110758-200110)，大黄酚(来源：中国食品药品检定研究院批次：110796-201118)，大黄素甲醚(中国药品生物制品检定所批次：110758-201013)
供试品：渴络欣胶囊(来源：成都康弘制药有限公司批次：131002)。
2、仪器与试剂：高效液相色谱仪(岛津LC-2010C)，电子天平(赛多利斯BP221D)，色谱柱(Agilent eclipse plus C18)，乙腈(来源：Honeywell批次：MCXA1H)，磷酸(来源：天津科密欧批次：2014031701)，色谱甲醇(来源：Honeywell批次：Q1AG2H)，分析甲醇(来源：成都科龙批次：2015072701)，纯净水(超纯水仪制水)，超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司SG5200HPT)；
3、检测方法
对照品溶液制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、番泻苷B、特女贞苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l ml含毛蕊异黄酮葡萄糖苷5.00μg/ml，番泻苷B 25.00μg/ml，特女贞苷20.00μg/ml，芦荟大黄素2.40μg/ml，大黄酸4.50μg/ml，大黄素6.00μg/ml，大黄酚11.50μg/ml，大黄素甲醚10.00μg/ml。
供试品溶液制备：取渴络欣胶囊内含物约l g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，
超声处理1小时，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，离心5min(转速为10000rpm)，取上清液即得。
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 12 | 88 |
| 25 | 17 | 83 |
| 35 | 17 | 83 |
| 45 | 35 | 65 |
| 55 | 66 | 34 |
| 65 | 90 | 10 |
| 66 | 12 | 88 |
| 75 | 12 | 88 |
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图1所示。从图1可以看出，供试品中各目标峰均能得到有效分离，分离度较好。其中，峰1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷(22.3min)与后峰分离度1.6，峰2-番泻苷B(27.0min)分离度4.2，峰3-特女贞苷(35.1min)分离度12.7，峰4-芦荟大黄素(54.3min)分离度3.7，峰5-大黄酸(55.0min)分离度1.5，峰6-大黄素(59.0min)分离度18.4，峰7-大黄酚(63.2min)分离度17.0，峰8-大黄素甲醚(64.9min)分离度6.8。
对比例1
按照文献(盘红梅等，HPLC梯度洗脱法同时测定固肾生发丸中6中成分含量，世界科学技术-中医药现代化，2015，17，1，124-127)的检测条件进行检测。
1、样品
同实施例1；
2、仪器与试剂
高效液相色谱仪(AGILENT 1200)，其它同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键和硅胶为填料(SHIMADZU VP-ODS250×4.6mm)；以甲醇-乙腈(2:1)为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，检测波长为254、320、290、224nm，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为(0-15min，28％A；15-38min，28-42％A；38-46min，42％A；46-60min，42-28％A)；流速：0.9ml/min。
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图2所示。只检出峰1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷(17.0min)和峰2-特女贞苷(27.9min)，但毛蕊异黄酮葡萄糖苷有包峰现象，且特女贞苷与后一色谱峰分离度为1.36。
对比例2
按照专利CN201510310257.1的检测条件进行检测。
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：以Agilent eclipse plus c18为检验用色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，柱温30℃，检测波长340nm，流速0.2ml/min，进样量2μl，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：0～5min：8→12(A)，5～10min：12→13(A)，10～15min：13→15(A)，15～20min：15→17(A)，20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)。
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图3所示。30min只检出3个色谱峰，且峰1与峰2包裹在一起。
对比例3
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 20 | 80 |
| 20 | 40 | 60 |
| 40 | 80 | 20 |
| 60 | 80 | 20 |
| 61 | 20 | 80 |
| 70 | 20 | 80 |
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图4所示。峰1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷(7.96min)包峰，峰2-特女贞苷(9.14min)分离度0.81。
对比例4
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
检测样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 15 | 85 |
| 30 | 80 | 20 |
| 60 | 80 | 20 |
| 61 | 15 | 85 |
| 70 | 15 | 85 |
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图5所示。峰1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷(9.41min)和峰2-特女贞苷(10.40min)包峰。
对比例5
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 15 | 85 |
| 40 | 80 | 20 |
| 60 | 80 | 20 |
| 61 | 15 | 85 |
| 70 | 15 | 85 |
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图6所示。峰1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷(10.01min)包峰，峰2-特女贞苷(10.93min)分离度0.69。
对比例6
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 12 | 88 |
| 30 | 18 | 82 |
| 50 | 80 | 20 |
| 65 | 80 | 20 |
| 66 | 12 | 88 |
| 75 | 12 | 88 |
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图7所示。峰1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷(23.40min)与后峰分离度1.75，峰2-特女贞苷(34.86min)基线较差。
对比例7
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图8所示。峰1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷(15.45min)与后一峰分离度1.30。
对比例8
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 12 | 88 |
| 25 | 20 | 80 |
| 40 | 40 | 60 |
| 50 | 90 | 10 |
| 65 | 90 | 10 |
| 66 | 88 | 88 |
| 75 | 88 | 88 |
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图9所示。峰1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷(20.29min)与后峰分离度1.48。
对比例9
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 12 | 88 |
| 25 | 17 | 83 |
| 40 | 40 | 60 |
| 50 | 90 | 10 |
| 65 | 90 | 10 |
| 66 | 88 | 88 |
| 75 | 88 | 88 |
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图10所示。峰1-大黄酸(47.22min)分离度1.30。
对比例10
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图11所示。峰1-大黄酸(47.50min)分离度1.19。
对比例11
1、样品
同实施例1
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
样品溶液的制备同实施例1；
液相色谱检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 12 | 88 |
| 25 | 17 | 83 |
| 40 | 35 | 65 |
| 50 | 80 | 20 |
| 65 | 80 | 20 |
| 66 | 88 | 88 |
| 75 | 88 | 88 |
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图12所示。峰1-芦荟大黄素(48.14min)与后峰分离度1.43。
综上，采用对比例1-11的色谱检测条件得到的色谱峰由于出现包峰现象及分离度差等原因，均不符合检测要求。
实施例2
1、样品
对照品：特女贞苷(来源：中国食品药品检定研究院批次：111926-201404)
供试品：女贞子(来源：成都康弘制药有限公司批次：1408001)。
2、仪器与试剂：
无水乙醇(来源：成都市科龙批次：2016011101)，其它同实施例1；
3、检测方法
对照品溶液制备：取特女贞苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l ml含特女贞苷240μg/ml的溶液，摇匀，即得。
供试品溶液制备：取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
液相色谱检测条件：同实施例1；
4、结果
按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图13所示。从图13可以看出，供试品中峰1-特女贞苷(34.1min)与后一峰分离度为2.4，分离良好。
实施例3
1、样品
对照品：毛蕊异黄酮葡萄糖苷(来源：中国食品药品检定研究院批次：111920-201304)
供试品：黄芪药材(来源：成都康弘制药有限公司批次：1501001)。
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
对照品溶液制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含毛蕊异黄酮葡萄糖苷50μg/ml的对照溶液，摇匀，即得。
供试品溶液制备：取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置圆底烧中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。液相色谱检测条件：同实施例1；
4、结果
照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图14所示。从图14可以看出，供试品中峰1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷(21.8min)分离度位5.0，分离情况良好。
实施例4
对本发明所提供的药物组合物检测方法进行重复性验证。方法验证中相对标准偏差(RSD)表示分析测试结果的精密度，其计算公式为：RSD％＝标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)，该值通常用来表示分析测试结果的精密度，其中标准偏差(SD):
1、样品
同实施例1；
2、仪器与试剂
同实施例1；
3、检测方法
对照品溶液制备同实施例1；
供试品溶液制备：取渴络欣胶囊内含物适量，混匀，分别取1g至50ml量瓶中，共6份，精密称定分别为1008.02、1015.07、1007.43、994.35、1008.61、1013.44mg，加甲醇适量，超声处理1h，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，离心5min(转速为每分钟10000rpm)，取上清液即得。液相色谱检测条件同实施例1；
4、结果
表1
按上述色谱条件进样测定，记录色谱图，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和番泻B含量的RSD分别为0.4％、0.7％、0.7％、1.4％、0.8％、0.7％、0.3％和1.7％，均小于2.0％，表明该方法重复性良好。
Claims (8)
1.一种药物组合物的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法进行，其中所述液相色谱测定条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的磷酸溶液，采用梯度洗脱；所述药物组合物为含有黄芪和/或女贞子的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述梯度洗脱条件为：
3.根据权利要求1-2中任一项所述的检测方法，其特征在于药物组合物为含有黄芪、女贞子和大黄的药物组合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于药物组合物由黄芪、女贞子、水蛭、大黄、太子参和枸杞子制备而成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于药物组合物为渴络欣胶囊。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述液相色谱条件中，柱温为30℃；检测波长为254nm。
7.根据权利要求4-5中任一项所述的检测方法，其特征在于供试品的制备方法为取药物组合物适量，用甲醇溶解，超声提取，离心后取上清液即得；超声提取时间优选为1h。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于包含以下步骤：
1)对照品溶液的制备
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和番泻B对照品适量，加甲醇溶解；
2)供试品溶液的制备
取由黄芪、女贞子、水蛭、大黄、太子参和枸杞子制成的药物组合物适量，用甲醇溶解，超声，离心，取上清液；
3)含量测定
取对照品溶液、供试品溶液各10μl注入液相色谱，进行含量测定；
色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，柱温为30℃，流速为0.1ml/min，检测波长为254nm，梯度洗脱程序为：
。
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