CN104614450B - 一种消渴清制剂的指纹图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种消渴清制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1）待测样品色谱图的制备：取消渴清制剂样品，加入提取溶剂一定比例的甲醇或乙醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；2）待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：将待测样品的色谱图积分信号导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。
Description
技术领域：
本发明涉及一种药物的有效成分测定方法，特别涉及一种消渴清制剂的指纹图谱检测方法。
背景技术：
消渴清颗粒为一种已经上市的治疗糖尿病的中成药，其配方组成如下：知母、苍术、黄连、蒲黄、地锦草、以及适量辅料，其制备方法包括以下步骤：
(a)取知母、苍术、黄连、蒲黄、地锦草备用；
(b)苍术用水蒸气蒸馏法提取挥发油5小时，将苍术挥发油用β-环糊精包合，苍术油与β-环糊精按1∶6投料，在50℃干燥，制得β-环糊精包合物备用，提取液滤过，得滤液1；
(c)知母、黄连、蒲黄、地锦草以及苍术水提后的残渣加8倍量水煎煮两次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1小时，合并两次煎液，过滤得滤液2，合并滤液1与2，浓缩滤液成比重为1.10～1.15的清膏，干燥得干浸膏；
(d)：上述干浸膏及挥发油包合物，充分混合，即得药物活性物质，进一步和药物可接受的辅料混合制成颗粒等制剂形式。
消渴清颗粒中，各味药起着不同的功效，其中，苍术辛苦温，入脾胃二经，气味芳香，善行而不守，既可燥湿健脾，又能行气开郁，故朱丹溪谓其：“苍术为足阳明经药，气味辛烈，强胃健脾发谷之气”，“能解诸郁”。知母甘寒，入肺、胃、肾经，具有滋阴降火，清热润燥之功，《本草纲目》认为，“知母下则润胃燥而滋阴，上则清肺金而泻火。”，《本经》谓“主消渴热中，除邪气。”，二药皆为君，二药相互配伍，共行滋肾阴，健脾运，化郁之功；黄连气味苦寒，具有清热燥湿，泻火解毒，以之为臣，辅知母以护肾阴，助苍术以化湿浊；生蒲黄性凉味甘辛，入心、肝二经，凉血化瘀，血行津布而燥热可解，瘀去气行，而阴津自生，且能改善糖尿病合并心脑血管病变，以之为佐；地锦草乃民间天然降糖妙品，味微苦辛而性平，清热解毒，活血通脉不仅善降血糖，且对糖尿病并发痈疽疮疖也有良效，以之为使，诸药合用，则共奏滋阴清火，健脾活血之功，诸症可缓解而愈之。以上诸药，按照中医方剂学的基础理论，巧妙配伍，严密组合，共奏滋阴降火、清热化湿、活血化瘀之功，从而达到向愈的目的。
消渴清颗粒（XiaoKeQing granules，XKQ）是由知母、苍术、黄连、蒲黄及地锦草5味药组成。中国专利：200310107286，200410048002.4公开了有关的配方和制备。
由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难以确保中药产品质量稳定性，中药指纹图谱建立的可以全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。
目前，消渴清颗粒质量标准中不曾对制剂进行过指纹图谱研究，单纯的以制剂中几种成分的含量来表征制剂质量是不全面的，而指纹图谱能充分表征中药制剂的整体性和复杂性，因此我们实验室对消渴清颗粒的有效成分进行了提取，分别以芒果苷和知母皂苷BII为参照峰，确定了23个紫外检测共有指纹峰和10个蒸发光检测共有指纹峰。
本发明将将超高效液相技术应用于消渴清颗粒研究出了一种消渴清颗粒的测定方法，所述方法一定条件下测定消渴清颗粒，以获得其指纹图谱，通过获得的图谱和标准指纹图谱的比较，确定消渴清颗粒的质量是否符合标准，
发明内容：
本发明提供一种消渴清制剂的超高效液相标准对照指纹图谱，其获得方法如下：
1）供试品溶液制备：
取消渴清制剂，加入提取溶剂一定比例的甲醇或乙醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，既得；
2）获得色谱图：
供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
3）生成对照指纹图谱
选择合格的多批消渴清制剂色谱图导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
色谱条件如下：
色谱柱：选择UPLC C18或T3柱；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A（醋酸盐缓冲溶液（含0.3-0.5%乙酸及0.05-0.1%三乙胺））–溶剂B（乙腈）
溶剂A（0.1%甲酸水溶液）–溶剂B（乙腈）；
溶剂A（0.1%醋酸水溶液）–溶剂B（乙腈）梯度洗脱。
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：
①0～4min，5%–10%B，4～10min，10%–15%B，10～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
②0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
③0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～23min，80%–5%B；
④0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-20%B，10～13min，20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～22min，80%–5%B；
柱温：25-35℃
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL。
紫外检测波长：240-340nm。
其中所述供试品溶液制备，方法如下：
取消渴清制剂1-7g,用50-80%乙醇或25-80%甲醇超声提取，超声时间为20-40min；所述提取溶剂为75%的乙醇，或50-75%的甲醇。
优选的，所述供试品溶液制备，方法如下：
取消渴清制剂6g，精密称定，置25ml量瓶中，加75%甲醇适量，功率500w超声30min，放置至室温，加75%甲醇定容至刻度，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，既得。
根据需要可以加入有效成分的标准对照品以作为参照物峰。所述加入有效成分的标准对照品以作为参照物峰，有效成分的标准对照品选自：新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、巴马汀及小檗碱。优选芒果苷、知母皂苷BII。
优选所述参照物峰是芒果苷峰和知母皂苷BII峰，
本发明还提供一种消渴清制剂的超高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤
1）待测样品色谱图的制备：
取消渴清制剂样品，加入提取溶剂甲醇或乙醇适量，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
2）待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
将待测样品的色谱图积分信号导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
色谱条件如下：
色谱柱：选择UPLC C18或T3柱；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A（醋酸盐缓冲溶液（含0.3-0.5%乙酸及0.05-0.1%三乙胺））–溶剂B（乙腈）
溶剂A（0.1%甲酸水溶液）–溶剂B（乙腈）；
溶剂A（0.1%醋酸水溶液）–溶剂B（乙腈）梯度洗脱。；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：
①0～4min，5%–10%B，4～10min，10%–15%B，10～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
②0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
③0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～23min，80%–5%B；
④0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-20%B，10～13min，20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～22min，80%–5%B；
柱温：25-35℃
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL。
紫外检测波长：240-340nm。
待测样品色谱图的制备中待测品溶液的制备优选：取渴清制剂1-7g,用50-80%乙醇或25-80%甲醇超声提取，优选75%的乙醇，或50-75%的甲醇，超声时间为20-40min；
所述加入有效成分的标准对照品以作为参照物峰，有效成分的标准对照品选自：新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、巴马汀及小檗碱。
优选取新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、巴马汀和小檗碱对照品适量，精密称定，加75%甲醇溶解，得到质量浓度分别为0.244、0.784、0.772、0.070和0.224μg·μL-1的对照品储备液。
更优选待测样品的供试液配制方法如下：
取消渴清制剂6g，精密称定，置25ml量瓶中，加75%甲醇适量，功率500w超声30min，放置至室温，加75%甲醇定容至刻度，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，既得。
优选色谱条件如下：
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS C18；
流动相：溶剂A为醋酸盐缓冲溶液其中含0.5%乙酸及0.1%三乙胺–溶剂B为乙腈，
梯度洗脱条件为：
0～4min，5%–10%B，4～8min，10%–15%B，8～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；梯度洗脱过程只说明了溶剂B的含量，其余部分为溶剂A。
柱温：30℃；
流速：0.2mL·min-1；
进样量：3μL；
检测波长：258nm；
ELSD空气流速：2.5L·min-1；
漂移管温度：105℃；
增益值：1。
其中所述的消渴清制剂为消渴清颗粒。
与本发明相关的相关术语解释
UPLC-PDA-ELSD：超高效液相多波长可见紫外和蒸发光检测法。
消渴清制剂，包括消渴清颗粒，消渴清片剂，消渴清胶囊剂，消渴清滴丸剂，消渴清栓剂，消渴清口服液剂，消渴清注射剂。可以根据已知专利中的方法制备。新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、巴马汀和小檗碱均为已知药物成分，可以从市场上购买得到。
本发明的方法是经过实验筛选获得的，筛选结果如下：
仪器与试药
ACQUITY UPLC，蒸发光散射检测器（ELSD）（Alltech ELSD2000），KQ-500DE型数控超声波清洗器，分析天平（XS105型电子分析天平，Mettler Toledo），MilliporeSimplicity超纯水系统。
试药与试剂
乙腈、甲醇（色谱级，Merck）；冰乙酸（色谱级，天津康科德有限公司）；三乙胺（色谱纯，天津市元立化工有限公司）；无水乙醇（分析纯，利安隆博华天津医药化学有限公司）；芒果苷（批号111607-200402,质量分数＞98%）、知母皂苷BII（批号222839-201102,质量分数＞98%）及小檗碱（批号110713-201212,质量分数＞86.8%）对照品购自中国食品药品检定研究院；新芒果苷（批号pcm-aa-004-020,质量分数＞98%）及巴马汀（批号pcm-ht-001,质量分数＞97%）对照品购自天津马克生物技术有限公司。
知母、苍术、黄连、蒲黄和地锦草均由天津天士力现代中药资源有限公司提供，为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎；菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thumb.)DC.的干燥根茎；毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch.的干燥根茎；香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifolia L.的干燥花粉；大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.的干燥全草。28批消渴清颗粒（编号S1～S28，批号分别为130301，121101，120703，120702，120701，120601，120501，120201，111103，111102，111101，110802，110801，100502，100501，090601，090502，090501，090402，090401，090302，090301，080503，080502，080501，110803zs，110802zs，110801zs）由天津天士力制药集团股份有限公司提供。
6.1色谱条件
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS C18(2.1×100mm，1.8μm)；流动相：溶剂A（醋酸盐缓冲溶液（含0.5%乙酸及0.1%三乙胺））–溶剂B（乙腈），梯度洗脱（0～4min，5%–10%B，4～8min，10%–15%B，8～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B)；柱温：30℃；流速：0.2mL·min-1；进样量：3μL；检测波长：258nm；ELSD空气流速：2.5L·min-1；漂移管温度：105℃，增益值：1。
6.2指纹图谱：
6.2.1供试品溶液的制备
精密称取消渴清颗粒约6.0g，精密称定，置25ml量瓶中，加75%甲醇适量，超声（功率500w）30min，放置至室温，加75%甲醇定容至刻度，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，既得。
6.2.2对照品储备液的制备
取新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、巴马汀和小檗碱对照品适量，精密称定，加75%甲醇溶解，得到质量浓度分别为0.244、0.784、0.772、0.070和0.224μg·μL-1的对照品储备液。
6.2.3阴性对照溶液的制备
按消渴清颗粒处方与制备工艺，分别制备缺知母、黄连、苍术、蒲黄和地锦草的阴性对照缺味制剂，按“6.2.1”项下方法操作，制备阴性对照溶液。
6.3方法学考察
6.3.1系统适应性试验
取供试品（批号130301）溶液、对照品溶液（0.50mL对照品储备液加75%甲醇定容至2mL）及阴性对照溶液，按照“6.1”项中色谱方法检测，记录色谱图，并确定共有峰，见系统适应性图。
比较紫外及蒸发光检测谱图确定供试品紫外色谱图中3号峰为新芒果苷、6号峰为芒果苷、19号峰为巴马汀、20号峰为小檗碱；
ELSD色谱图中6*号峰为知母皂苷BII。因6号峰和6*其响应值较大，与相邻峰分离较好，因此分别选作UV及ELSD检测下的参照物峰，并以此计算其他共有峰的相对保留时间及相对峰面积，此系统条件6号峰理论塔板数≥120000。系统适应性图见图1-14，指纹图谱共有峰保留时间见表1及表2。
表1 PDA指纹图谱共有峰编号与保留时间（T/min）
表2 ELSD指纹图谱共有峰编号与保留时间（T/min）
6.3.2精密度试验
取供试品溶液（批号130301），连续进样5次，分别对共有峰相对保留时间和相对峰面积进行考察。供试品中共有峰相对保留时间的RSD＜0.1%，PDA和ELSD相对峰面积的RSD＜3%，表明仪器精密度良好。
6.3.3重现性实验
取样品（批号为130301）5份，按“6.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“6.1”项下方法进行检测，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。供试品中共有峰的相对保留时间的RSD＜0.1%，PDA和ELSD相对峰面积的RSD＜3%，表明重复性良好。
6.3.4稳定性试验
取供试品溶液（批号为130301），分别于0，2，4，8，12，24h进样分析，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果表明，供试品中共有峰相对保留时间的RSD＜0.1%，PDA和ELSD相对峰面积的RSD＜3%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
6.4标准指纹图谱的建立
取11批有效期内的样品，按“6.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“6.1”项下方法进行检测,分别以芒果苷（6号）和知母皂苷BII（6*号）为参照物峰，按峰出线率100%计，确定PDA及ELSD检测条件共有峰个数分别为23和10个。将积分信号导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，以S1为参照谱图，按平均值法计算得相似度结果，并生成对照指纹图谱(RFP)，色谱图见图15，RFP中共有峰面积见表3及表4，RFP的生成结果见表5及表6。以PDA和ELSD任意一个图与标准图谱比较相似度小于90%为不合格产品，对28批样品进行质量评价，将28批样品的积分信号导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，以之前生成的RFP为依据，考察各批次与RFP的相似度，相似度的大小反应产品质量的好坏。
表3 PDA对照指纹图谱峰面积（A/AU）
表4 ELSD对照指纹图谱峰面积（A/mAU）
表5 PDA对照指纹图谱生成结果表（A/AU）
表6 ELSD对照指纹图谱生成结果表（A/mAU）
表7.28批样品指纹图谱PDA相似度结果
表8.28批样品指纹图谱ELSD相似度结果
附图说明
图1.消渴清颗粒样品色谱图
图2.消渴清颗粒对照品
图3.阴性对照缺味药材-知母
图4.阴性对照缺味药材-苍术
图5.阴性对照缺味药材黄连
图6.阴性对照缺味药材-蒲黄
图7.阴性对照缺味药材-地锦草
图8.消渴清样品图
图9.对照品色谱图
图10.阴性对照缺味药材-知母
图11.阴性对照缺味药材-苍术
图12.阴性对照缺味药材-黄连
图13.阴性对照缺味药材-蒲黄
图14.阴性对照缺味药材-地锦草
图15消渴清颗粒UPLC–PDA（A）和ELSD（B）对照指纹图谱（RFP）
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
消渴清颗粒超高效液相标准对照指纹图谱，其获得方法如下：
1）供试品溶液制备：
取消渴清颗粒6g，置25ml量瓶中，加75%甲醇适量，功率500w超声30min，放置至室温，加75%甲醇定容至刻度，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
2）获得色谱图：
供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，其中，参照物峰是芒果苷峰和知母皂苷BII峰；
3）生成对照指纹图谱
选择合格的多批消渴清制剂色谱图导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
色谱条件为：
色谱柱：C18
流动相：溶剂A为醋酸盐缓冲溶液其中含0.5%乙酸及0.1%三乙胺–溶剂B为乙腈，
梯度洗脱条件为：
0～4min，5%–10%B，4～8min，10%–15%B，8～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；梯度洗脱过程只说明了溶剂B的含量，其余部分为溶剂A；
柱温：30℃；
流速：0.2mL·min-1；
进样量：3μL；
检测波长：258nm；
ELSD空气流速：2.5L·min-1；
漂移管温度：105℃；
增益值：1。
实施例2
消渴清制剂超高效液相标准对照指纹图谱，其获得方法如下：
1）供试品溶液制备：
取消渴清制剂，加入提取溶剂一定比例的甲醇或乙醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，既得；
2）获得色谱图：
供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
3）生成对照指纹图谱
选择合格的多批消渴清制剂色谱图导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
色谱条件如下：
色谱柱：选择UPLC C18或T3柱；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A（醋酸盐缓冲溶液（含0.3-0.5%乙酸及0.05-0.1%三乙胺））–溶剂B（乙腈）
溶剂A（0.1%甲酸水溶液）–溶剂B（乙腈）；
溶剂A（0.1%醋酸水溶液）–溶剂B（乙腈）梯度洗脱；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱，选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：
①0～4min，5%–10%B，4～10min，10%–15%B，10～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
②0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
③0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～23min，80%–5%B；
④0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-20%B，10～13min，20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～22min，80%–5%B；
柱温：25-35℃；
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL；
紫外检测波长：240-340nm，
根据需要可以加入有效成分的标准对照品芒果苷峰或和母皂苷BII峰以作为参照物峰。
实施例3
消渴清制剂超高效液相标准对照指纹图谱，其获得方法如下：
1）供试品溶液制备：
取消渴清制剂1-7g,用50-80%乙醇或25-80%甲醇超声提取，优选75%的乙醇，或50-75%的甲醇，超声时间为20-40min；
2）获得色谱图：
供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
3）生成对照指纹图谱
选择合格的多批消渴清制剂色谱图导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
色谱条件如下：
色谱柱：选择UPLC C18或T3柱；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A（醋酸盐缓冲溶液（含0.3-0.5%乙酸及0.05-0.1%三乙胺））–溶剂B（乙腈）
溶剂A（0.1%甲酸水溶液）–溶剂B（乙腈）；
溶剂A（0.1%醋酸水溶液）–溶剂B（乙腈）梯度洗脱；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱，选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：
①0～4min，5%–10%B，4～10min，10%–15%B，10～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
②0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
③0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～23min，80%–5%B；
④0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-20%B，10～13min，20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～22min，80%–5%B；
柱温：25-35℃；
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL；
紫外检测波长：240-340nm，
根据需要可以加入有效成分的标准对照品芒果苷峰和知母皂苷BII以作为参照物峰。
实施例4
消渴清制剂超高效液相标准对照指纹图谱，其获得方法如下：
1）供试品溶液制备：
取消渴清制剂1g,用50%乙醇或25%甲醇超声提取，超声时间为40min；
2）获得色谱图：
供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
3）生成对照指纹图谱
选择合格的多批消渴清制剂色谱图导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
色谱条件如下：
色谱柱：选择UPLC C18柱；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A（醋酸盐缓冲溶液（含0.3-0.5%乙酸及0.05-0.1%三乙胺））–溶剂B（乙腈）
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱，选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：
①0～4min，5%–10%B，4～10min，10%–15%B，10～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
柱温：35℃；
流速：0.25ml/min
ELSD空气流速：3.0L·min-1；
漂移管温度：110℃；
进样量为4μL；
紫外检测波长：340nm，
根据需要可以加入有效成分的标准对照品芒果苷峰以作为参照物峰。
实施例5
消渴清制剂超高效液相标准对照指纹图谱，其获得方法如下：
1）供试品溶液制备：
取消渴清制剂7g,用80%乙醇或80%甲醇超声提取，超声时间为20min；
2）获得色谱图：
供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
3）生成对照指纹图谱
选择合格的多批消渴清制剂色谱图导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
色谱条件如下：
色谱柱：选择T3柱；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A（0.1%甲酸水溶液）–溶剂B（乙腈）；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱，选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：
0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
柱温：25℃；
流速：0.15ml/min
ELSD空气流速：2.0L·min-1；
漂移管温度：100℃；
进样量为2μL；
紫外检测波长：240nm，
根据需要可以加入有效成分的标准对照品芒果苷峰和知母皂苷BII作为参照物峰。
实施例6
一种消渴清制剂的检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液制备：
取消渴清制剂7g,用80%乙醇超声提取，超声时间为40min。
将上述供试品溶液注色谱仪，得到色谱图，将待测样品色谱图和实施例1中获得的标准对照指纹图谱相似度计算，得出待测样品的相似度。
其中，所述UPLC-PDA-ELSD色谱仪，其色谱条件如下：
色谱柱：选自：T3柱；
流动相：选自：溶剂A（0.1%甲酸水溶液）–溶剂B（乙腈）；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自
②0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
柱温：35℃
流速：0.25ml/min
ELSD空气流速：3.0L·min-1；
漂移管温度：110℃；
进样量为4μL，
检测波长：340nm。
实施例7
一种消渴清制剂的检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液制备：
取消渴清制剂3.5g,用25%甲醇超声提取，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，既得，
将上述供试品溶液注色谱仪，得到色谱图，将待测样品色谱图和实施例1中获得的标准对照指纹图谱相似度计算，得出待测样品的相似度。
其中，所述UPLC-PDA-ELSD色谱仪，其色谱条件如下：
色谱柱：选自：UPLC C18柱；
流动相：选自：溶剂A（0.1%醋酸水溶液）–溶剂B（乙腈），
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自
0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～23min，80%–5%B；
柱温：25-35℃
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL，
检测波长：240-340nm。
实施例8
一种消渴清制剂的检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液制备：
取消渴清制剂5g,用80%甲醇超声提取，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，既得，
将上述供试品溶液注色谱仪，得到色谱图，将待测样品色谱图和实施例1中获得的标准对照指纹图谱相似度计算，得出待测样品的相似度。
其中，所述UPLC-PDA-ELSD色谱仪，其色谱条件如下：
色谱柱：选自：T3柱；
流动相：选自：溶剂A（醋酸盐缓冲溶液（含0.3-0.5%乙酸及0.05-0.1%三乙胺））–溶剂B（乙腈）；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自
0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-20%B，10～13min，20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～22min，80%–5%B；
柱温：25-35℃
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL，
检测波长：240-340nm。
实施例9
一种消渴清制剂的检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液制备：
取消渴清制剂3g,用75%乙醇超声提取，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，既得，
将上述供试品溶液注色谱仪，得到色谱图，将待测样品色谱图和实施例1中获得的标准对照指纹图谱相似度计算，得出待测样品的相似度。
其中，所述UPLC-PDA-ELSD色谱仪，其色谱条件如下：
色谱柱：选自：UPLC C18或T3柱；
流动相：选自：溶剂A（醋酸盐缓冲溶液（含0.3-0.5%乙酸及0.05-0.1%三乙胺））–溶剂B（乙腈）；采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自以下四个不同的洗脱方案：
0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–20%B，13～14min，20%–25%B，14～18min，25–30%B，20～23min，80%–5%B；
柱温：25-35℃
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL，
检测波长：240-340nm。
实施例10
一种消渴清制剂的检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液制备：
取消渴清制剂3g,用75%甲醇超声提取，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，既得，
将上述供试品溶液注色谱仪，得到色谱图，将待测样品色谱图和实施例1中获得的标准对照指纹图谱相似度计算，得出待测样品的相似度。
其中，所述UPLC-PDA-ELSD色谱仪，其色谱条件如下：
色谱柱：选自：UPLC C18或T3柱；
流动相：选自：溶剂A（0.1%甲酸水溶液）–溶剂B（乙腈）；采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自以下四个不同的洗脱方案：
0～4min，5%B，4～5min，5%–10%B，5～8min，10%B，8～10min，10-15%B，10～11min，15-12%B，11～13min，12%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
柱温：25-35℃
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL，
检测波长：240-340nm。
实施例11
一种消渴清制剂的检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液制备：
取消渴清制剂3g,用50%甲醇醇超声提取，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，既得，
将上述供试品溶液注色谱仪，得到色谱图，将待测样品色谱图和实施例1中获得的标准对照指纹图谱相似度计算，得出待测样品的相似度。
其中，所述UPLC-PDA-ELSD色谱仪，其色谱条件如下：
色谱柱：选自：UPLC C18或T3柱；
流动相：选自：溶剂A（0.1%醋酸水溶液）–溶剂B（乙腈），
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：
0～4min，5%–10%B，4～10min，10%–15%B，10～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B；
柱温：25-35℃
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL，
检测波长：240-340nm。
实施例12
一种消渴清颗粒的检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液制备：
取消渴清颗粒约6.0g，置25ml量瓶中，加75%甲醇适量，超声（功率500w）30min，放置至室温，加75%甲醇定容至刻度，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，既得将上述供试品溶液注色谱仪，得到色谱图，将待测样品色谱图和实施例1中获得的标准对照指纹图谱相似度计算，得出待测样品的相似度。
其中，所述UPLC-PDA-ELSD色谱仪，其色谱条件如下：
色谱柱：选自：UPLC C18柱；
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS C18、；
流动相：溶剂A（醋酸盐缓冲溶液（含0.5%乙酸及0.1%三乙胺））–溶剂B（乙腈）；
梯度洗脱（0～4min，5%–10%B，4～8min，10%–15%B，8～13min，15%–22%B，13～15min，22%–30%B，15～18min，30%B，18～20min，30%–80%B，20～23min，80%–5%B)；
紫外检测波长：258nm；
ELSD空气流速：2.5L·min-1；
漂移管温度：105℃；
增益值：1。
Claims (11)
1.一种消渴清制剂的超高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)待测样品色谱图的制备：
取消渴清制剂样品，加入提取溶剂一定比例的甲醇或乙醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
将待测样品的色谱图积分信号导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
其中色谱条件如下：
色谱柱：选择UPLC C18或T3柱；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A醋酸盐缓冲溶液含0.3-0.5％乙酸及0.05-0.1％三乙胺–溶剂B乙腈；
溶剂A 0.1％甲酸水溶液–溶剂B乙腈；
溶剂A 0.1％醋酸水溶液–溶剂B乙腈梯度洗脱；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：
①0～4min，5％–10％B，4～10min，10％–15％B，10～13min，15％–22％B，13～15min，22％–30％B，15～18min，30％B，18～20min，30％–80％B，20～23min，80％–5％B；
②0～4min，5％B，4～5min，5％–10％B，5～8min，10％B，8～10min，10-15％B，10～11min，15-12％B，11～13min，12％–22％B，13～15min，22％–30％B，15～18min，30％B，18～20min，30％–80％B，20～23min，80％–5％B；
③0～4min，5％B，4～5min，5％–10％B，5～8min，10％B，8～10min，10-15％B，10～11min，15-12％B，11～13min，12％–20％B，13～14min，20％–25％B，14～18min，25–30％B，20～23min，80％–5％B；
④0～4min，5％B，4～5min，5％–10％B，5～8min，10％B，8～10min，10-20％B，10～13min，20％B，13～14min，20％–25％B，14～18min，25–30％B，20～22min，80％–5％B；
柱温：25-35℃；
流速：0.15-0.25ml/min；
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL；
紫外检测波长：240-340nm。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述标准对照指纹图谱，其获得方法如下：
1)供试品溶液制备：
取消渴清制剂，加入提取溶剂一定比例的甲醇或乙醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，既得；
2)获得色谱图：
供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
3)生成对照指纹图谱
选择合格的多批消渴清制剂色谱图导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
色谱条件如下：
色谱柱：选择UPLC C18或T3柱；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A醋酸盐缓冲溶液含0.3-0.5％乙酸及0.05-0.1％三乙胺–溶剂B乙腈；
溶剂A 0.1％甲酸水溶液–溶剂B乙腈；
溶剂A 0.1％醋酸水溶液–溶剂B乙腈，梯度洗脱；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱，选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：
①0～4min，5％–10％B，4～10min，10％–15％B，10～13min，15％–22％B，13～15min，22％–30％B，15～18min，30％B，18～20min，30％–80％B，20～23min，80％–5％B；
②0～4min，5％B，4～5min，5％–10％B，5～8min，10％B，8～10min，10-15％B，10～11min，15-12％B，11～13min，12％–22％B，13～15min，22％–30％B，15～18min，30％B，18～20min，30％–80％B，20～23min，80％–5％B；
③0～4min，5％B，4～5min，5％–10％B，5～8min，10％B，8～10min，10-15％B，10～11min，15-12％B，11～13min，12％–20％B，13～14min，20％–25％B，14～18min，25–30％B，20～23min，80％–5％B；
④0～4min，5％B，4～5min，5％–10％B，5～8min，10％B，8～10min，10-20％B，10～13min，20％B，13～14min，20％–25％B，14～18min，25–30％B，20～22min，80％–5％B；
柱温：25-35℃；
流速：0.15-0.25ml/min
ELSD空气流速：2.0-3.0L·min-1；
漂移管温度：100-110℃；
进样量为2-4μL；
紫外检测波长：240-340nm；
根据需要加入有效成分的标准对照品以作为参照物峰。
3.根据权利要求2的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液制备，方法如下：取消渴清制剂1-7g,用50-80％乙醇或25-80％甲醇超声提取，超声时间为20-40min。
4.根据权利要求2的检测方法，其特征在于，所述标准对照指纹图谱的获得方法：
取消渴清制剂6g，置25ml量瓶中，加75％甲醇适量，功率500w超声30min，放置至室温，加75％甲醇定容至刻度，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
色谱条件为：
色谱柱：C18
流动相：溶剂A为醋酸盐缓冲溶液其中含0.5％乙酸及0.1％三乙胺–溶剂B为乙腈，
梯度洗脱条件为：
0～4min，5％–10％B，4～8min，10％–15％B，8～13min，15％–22％B，13～15min，22％–30％B，15～18min，30％B，18～20min，30％–80％B，20～23min，80％–5％B；梯度洗脱过程只说明了溶剂B的含量，其余部分为溶剂A；
柱温：30℃；
流速：0.2mL·min-1；
进样量：3μL；
检测波长：258nm；
ELSD空气流速：2.5L·min-1；
漂移管温度：105℃；
增益值：1。
5.根据权利要求2的检测方法，其特征在于，其中所述待测样品色谱图的制备，待测样品的供试液配制方法如下：
取消渴清制剂1-7g,用50-80％乙醇或25-80％甲醇超声提取，超声时间为20-40min；所述加入有效成分的标准对照品以作为参照物峰，有效成分的标准对照品选自：新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、巴马汀及小檗碱。
6.根据权利要求5的检测方法，其特征在于，其中所述待测样品色谱图的制备，待测样品的供试液配制方法如下：
取消渴清制剂6g，精密称定，置25ml量瓶中，加75％甲醇适量，功率500w超声30min，放置至室温，加75％甲醇定容至刻度，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，其中所述标准对照品，需要配制成对照品溶液，配制方法如下：
取新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、巴马汀和小檗碱对照品适量，精密称定，加75％甲醇溶解，得到质量浓度分别为0.244、0.784、0.772、0.070和0.224μg·μL-1的对照品溶液。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件如下：
色谱柱：C18；
流动相：溶剂A为醋酸盐缓冲溶液其中含0.5％乙酸及0.1％三乙胺–溶剂B为乙腈，
梯度洗脱条件为：
0～4min，5％–10％B，4～8min，10％–15％B，8～13min，15％–22％B，13～15min，22％–30％B，15～18min，30％B，18～20min，30％–80％B，20～23min，80％–5％B；梯度洗脱过程只说明了溶剂B的含量，其余部分为溶剂A。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件如下：
柱温：30℃；
流速：0.2mL·min-1；
进样量：3μL；
检测波长：258nm；
ELSD空气流速：2.5L·min-1；
漂移管温度：105℃；
增益值：1。
10.如权利要求1的检测方法，其特征在于，所述的消渴清制剂为消渴清颗粒。
11.根据权利要求3或5所述的检测方法，其特征在于，用75％的乙醇或50-75％的甲醇超声提取。
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| CN201310539854.2A CN104614450B (zh) | 2013-11-01 | 2013-11-01 | 一种消渴清制剂的指纹图谱检测方法 |
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| HPLC- UV- ELSD 同时测定知母黄柏药对提取物中盐酸小檗碱、 黄柏碱、 知母皂苷 BⅡ;叶雪兰 等;《中国实验方剂学杂志》;20110430;第17卷(第8期);122-124 * |
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| Simultaneous determination of active xanthone glycosides,timosaponins and alkaloids in rat plasma after oral administration of Zi-Shen Pill extract for the pharmacokinetic study by liquid chromatography–tandem mass spectrometry;Fei Cai 等;《Journal of Chromatography B》;20100524;第878卷;1845–1854 * |
| UPLC同时测定黄柏知母药对中盐酸小檗碱、新芒果苷、芒果苷的含量;徐福平 等;《中国药学杂志》;20101231;第45卷(第24期);文章第1-2节 * |
| 用HPLC -ELSD法同时测定不同产地知母饮片中芒果苷、新芒果苷和知母皂苷 BⅡ的含量;韩建 等;《药学服务与研究》;20110228;第11卷(第 1期);39-41 * |
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