CN110274981B - 一种消渴清药物生物碱类成分检测方法 - Google Patents

一种消渴清药物生物碱类成分检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种消渴清药物生物碱类成分检测方法，所述方法，包括以下步骤：A供试品溶液制备，B测定：吸取步骤A所得的供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，C和消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。

Description

一种消渴清药物生物碱类成分检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药药物的测定方法，特别涉及一种中药消渴清药物生物碱类成分检测方法。
背景技术
消渴清颗粒为一种已经上市的中成药，由知母、苍术、黄连、蒲黄及地锦草5味药制备而成，具有滋阴清热，活血化瘀功能。配合抗糖尿病化学药品用于Ⅱ型糖尿病属阴虚热盛挟血瘀证的治疗；可改善该证所见口渴欲饮、多食易饥、怕热心烦、溲赤或尿多、大便干结、或胸中闷痛、或肢体麻木、刺痛，以及盗汗等症。由于疗效确切、不良反应少且价格低廉，临床应用广泛，故对其进行质量检测以保证药物的安全性、有效性，具有重要意义。
从传统的中医药观点来看,指标成分的控制难以真正控制中药的功效,尤其是复方制剂,检测任何一种指标成分均不能反映其所体现的整体疗效。近年来,指纹图谱技术被认为是中药质量控制研究的有效手段。王露黔等.消渴清颗粒UPLC-PDA-ELSD指纹图谱的建立及5个主要成分的测定[J].中草药,2013,(24):3482-3488.公开了公开消渴清颗粒的UPLC-PDA-ELSD指纹图谱建立方法，并对新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、巴马汀和小檗碱进行定量测定。已申报的相关检测方法专利“一种消渴清制剂的指纹图谱检测(201310538954.2)为UPLC-PDA-ELSD联用技术，检测处方中的皂苷类成分及生物碱类成分指纹图谱特征，无定量指标；“一种消渴清颗粒的含量检测方法(201310538597.0)为UPLC-PDA-ELSD联用技术检测处方中的新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、巴马汀及小檗碱含量，方法缺乏表征产品的整体特征。已发表的该产品相关分析方法的论文主要为HPLC法、HPLC-ELSD法测定处方中菝葜皂苷元的含量、UPLC-PDA-ELSD法测定指纹图谱同时对5个主要成分(新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、巴马汀及小檗碱)进行的含量测定。
以往专利及相关文献中方法，虽可以检测消渴清颗粒中的部分有效成分，但如何对生产过程中的中间产物或产成品的质量进行全面控制，仍没有找到好的解决办法，此外，盐酸非洲防己碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱是消渴清药物中重要的有效成分，盐酸非洲防己碱、药根碱能起到降低血糖的作用，黄连碱能促进细胞葡萄糖转运利用从而起到降糖作用，还能改善胰岛素抵抗作用，这些成分在以往检测中并没有得到体现出来。
为此，本发明提供一种方法，其特点主要在于在同一次分析中可以实现本品中生物碱类成分同时定性及定量测定，在定量分析的过程中仅使用一种对照品即可实现2种成分的测定，较以往发表论文及申请专利的分析方法，本方法具有分析效率、降低人力物力等成本的优势。
本发明以传统中医理论体系为基础的综合控制模式,将中药指纹图谱技术与多指标成分定量分析相结合,体现了中医药整体治疗的特色,突出了指标性成分的作用，赋予指纹图谱大量的定性、定量信息共同应用于中药质量控制,对指纹图谱中的多个目标成分尤其是有效成分进行准确定量，使得中药质量控制更加准确、更能真实反映中药的质量状况、所对应的产品组成更加清晰、产品的质量和稳定性更加可靠。
发明内容：
本发明提供一种消渴清药物生物碱类成分检测方法，所述方法，包括以下步骤：
A供试品溶液制备，方法如下：取待测样品消渴清药物0.3-0.7g，加入8-12ml甲醇溶剂中，密闭，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取4-6ml，上中性氧化铝柱，用甲醇10-15ml洗脱，收集流出液与洗脱液，加水至24-26ml，摇匀，滤过，得到滤液；
B测定：吸取步骤A所得的供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
C和消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。
采用上述标准对照指纹图谱和实际生产过程中的用本发明方法检测的供试品的色谱图进行对比，符合一致者为合格产品，符合一致要求在90％以上，优选95％以上，更优选98％以上，最优选在99％以上。
优选的，本发明所述的检测方法，其中，
A供试品溶液制备，方法如下：取待测样品消渴清药物0.5g，加入10ml甲醇盐酸的混合溶液，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇盐酸混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心3分钟，取5ml，上中性氧化铝柱上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得到滤液。
更优选的，本发明所述的检测方法，其中，
A供试品溶液制备，方法如下：
取待测样品消渴清药物0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸(100:1)混合溶液，密闭，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心3分钟，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径为1cm，20ml甲醇活化)上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得续滤液。
本发明所述的检测方法，其中，高效液相色谱的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选采用柱长为15cm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm，Agilent SB-C18色谱柱)；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，按表中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm梯度洗脱程序为
Figure BDA0001596027070000021
或
Figure BDA0001596027070000022
或
Figure BDA0001596027070000023
Figure BDA0001596027070000031
本发明进一步提供本发明所述的消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱的建立方法，所述方法，步骤如下：
A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成酸巴马汀和盐酸小檗碱的混合对照品溶液。
B供试品溶液制备，方法如下：
取多批次合格消渴清药物0.3-0.7g，加入8-12ml甲醇溶剂中，密闭，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取4-6ml，上中性氧化铝柱，用甲醇10-15ml洗脱，收集流出液与洗脱液，加水至24-26ml，摇匀，滤过，得到滤液；
C测定：吸取步骤A和B所得的溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱。
优选的，本发明所述的方法，步骤如下：
A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每ml含盐酸巴马汀1.0～3.0μg和盐酸小檗碱3.5～5.5μg的混合对照品溶液。
B供试品溶液制备，方法如下：
取多批次合格消渴清药物0.5g，加入10ml甲醇盐酸的混合溶液，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇盐酸混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心3分钟，取5ml，上中性氧化铝柱上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得到滤液。
C测定：吸取步骤A和B所得的溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱。
最优选的，本发明所述的方法，步骤如下：
步骤A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每ml含盐酸巴马汀2μg和盐酸小檗碱4.5μg的混合对照品溶液。
步骤B供试品溶液制备，方法如下：
取多批次合格消渴清药物0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸(100:1)混合溶液，密闭，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟3000转)3分钟，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径为1cm，20ml甲醇活化)上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得到续滤液；
步骤C测定：吸取步骤A和B所得的溶液各20μl，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱。
以上所述的消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱的建立方法中，高效液相色谱的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选柱长为15cm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm，建议采用Agilent SB-C18色谱柱)；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，按表中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000，
梯度洗脱程序为
Figure BDA0001596027070000041
或
Figure BDA0001596027070000042
或
Figure BDA0001596027070000044
本发明还提供一种消渴清药物生物碱类成分的含量检测方法，所述方法，包括以下步骤：
A对照品溶液制备，方法如下：
取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成盐酸小檗碱对照品溶液。
B供试品溶液制备，方法如下：
取待测样品消渴清药物0.3-0.7g，加入8-12ml甲醇溶剂中，密闭，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取4-6ml，上中性氧化铝柱，用甲醇10-15ml洗脱，收集流出液与洗脱液，加水至24-26ml，摇匀，滤过，得到滤液；
C测定：吸取步骤A和B所得的溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，计算样品中盐酸小檗碱、使用相对校正因子计算盐酸巴马汀的含量，
梯度洗脱程序为
Figure BDA0001596027070000051
或
Figure BDA0001596027070000052
或
Figure BDA0001596027070000053
优选的，所述的含量检测方法，包括以下步骤：
步骤A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成盐酸小檗碱4.5μg对照品溶液。
供试品溶液制备，方法如下：
取消渴清颗粒0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸(100:1)混合溶液，密闭，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟3000转)3分钟，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径为1cm，20ml甲醇活化)上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得到续滤液；
C测定：吸取步骤A和B所得的溶液各20μl，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
计算样品中盐酸小檗碱、使用相对校正因子计算盐酸巴马汀的含量，
其中，高效液相色谱的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为15cm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm，建议采用Agilent SB-C18色谱柱)；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，按表中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm。
优选的
盐酸巴马汀色谱峰的相对保留时间为0.9714±0.0017，相对校正因子为0.9407-0.9462。相对校正因子的确定方法为，先用外标法测定样品中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀含量，其次计算出相对校正因子。
本发明所述消渴清颗粒，消渴清药物均属于现有技术，其中消渴清颗粒是用知母、苍术、黄连、蒲黄及地锦草5味中药材经过提取得到提取物，以该提取物为消渴清药物活性成分和药物可接受的载体混合制备而成的颗粒制剂，可于市场购得。
本发明所述消渴清药物包括以消渴清药物活性成分为主药，和药物可接受的载体混合制备而成任何一种药物制剂形式，如片剂，胶囊，口服液，颗粒剂等，本发明优选消渴清颗粒。
在本发明的消渴清药物活性成分中，其中的生物碱成分，主要包括：盐酸非洲防己碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱,本发明以其中的核心活性成分生物碱类成分盐酸小檗碱为标的物，对它们的含量及其配比进行了检测并制定了标准对照指纹图谱。
本发明中除另有明确外，溶质为固体的百分含量均为重量体积百分比，单位分别为g/ml％，kg/L％；溶质为液体的百分含量均为体积百分比(v/v)，单位分别为ml/ml％,L/L％。
本发明是通过筛选得到的，以下通过实验数据证明本发明的有益效果：
1.步骤1指纹图谱分析方法的建立
1.1仪器与试药
仪器：Waters HPLC-2695-2996 PDA检测器；Waters HPLC-2695-2489 TUV检测器；Waters H-CLASS TUV检测器；Waters ACQUITY UPLC TUV检测器；Empower2液相色谱工作站；十万分之一天平(赛多利斯ME-235S)；万分之一天平(赛多利斯BSA-224S)；超纯水机(Milli-Q)；色谱柱：Waters BEH(1.7μm，2.1×100mm)；
试剂：乙腈(色谱纯，康科德)；甲醇(分析纯，康科德)；甲醇(色谱纯，OMNI)；无水乙醇(分析纯，康科德)；三氟乙酸(色谱纯≥99.5％，阿拉丁)；超纯水(公司自制，MilliQ)；盐酸(优级纯，风船化学)；磷酸(分析纯，风船化学)
对照品：盐酸巴马汀对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110732-201108(86.2％)；盐酸小檗碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110713-201212(86.7％))；盐酸药根碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110733-201108(90.3％))；非洲防己碱(天津一方科技有限公司，批号：AB727C(98％))；黄连碱(天津一方科技有限公司，批号：AB691C(98％))；表小檗碱(天津一方科技有限公司，批号：AB726E(98％))；苍术、知母、黄连、地锦草、蒲黄等五味药材来自天津天士力现代中药资源有限公司。
中性氧化铝(pH＝6.5-7.5，粒度范围100-200目；天津市风船化学试剂科技有限公司，分析纯，20040115)；碱性氧化铝(pH＝9.5±0.5，粒度范围100-200目；中国医药(集团)上海化学试剂公司，分析纯，20141201)；磷酸二氢钾(分析纯，风船化学，批号：20120208)；十二烷基硫酸钠(分析纯，Sigma，批号：BCBK35692)。
样品：消渴清颗粒(天士力制药集团股份有限公司，共14批，具体批号见表-1，均经检验合格。
表-1消渴清颗粒样品信息表
Figure BDA0001596027070000061
1.2色谱系统及色谱条件优化
采用乙腈-0.1％三氟乙酸系统，通过改变有机相比例、色谱柱、柱温等方法优化色谱洗脱程序，进行了20余次不同比例的尝试及优化，最终确定了最优的梯度洗脱程序，见表-2，典型的色谱图如图-1所示。
表-2最佳洗脱程序
Figure BDA0001596027070000071
1.3供试品溶液制备方法的考察
1.3.1不同提取溶剂考察
黄连生物碱主要为季铵型生物碱，为离子型化合物，易溶于水和酸水，可溶于甲醇、乙醇、正丁醇等极性较大的有机溶剂，难溶于亲脂性有机溶剂。生物碱盐一般易溶于水，可溶于醇，但在水中的溶解度有差异。故本试验将以盐酸小檗碱为定量指标，对甲醇:盐酸(100:1)混合溶液、甲醇、乙醇三种不同提取溶剂常温条件下的提取效果进行考察。结果表明：甲醇:盐酸(100:1)混合溶液对盐酸小檗碱的提取效果最好，甲醇次之，无水乙醇最差；结合药典、文献等资料报道，其多采用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液作为提取溶剂，因此，最终选甲醇:盐酸(100:1)混合溶液作为提取溶剂，结果见图-2。
1.3.2不同固液比的考察
为探究溶质与溶剂以哪种比例混合对其成分提取较为完全，故设计0.3g：10ml、0.5g：10ml、0.7g：10ml三种不同固液比进行比较考察。结果表明：随固液比的增加，盐酸小檗碱的提取量呈先增后减的趋势，三者之间RSD％为1.8％，说明在0.3g：10ml～0.7g：10ml之间的固液比的提取效率差异性较小；0.5g：10ml的固液比提取率最高，因此，最终选用0.5g溶质：10ml溶液的固液比，结果见图-3。
1.3.3提取时间考察
为探究超声时间对样品成分提取率的影响，拟最大化的提取目标成分，故设置4种不同提取时间进行比较考察。结果表明：由图8可知，盐酸小檗碱提取效率随超声时间增加而小幅增加，4个试验条件的单位质量峰面积之间RSD％为1.8％；超声30分钟与超声40分钟提取效率之间RAD％仅0.70％，两者无明显差异。综合考虑试验操作周期，最终选择提取时间为30分钟，结果见图-4。
1.3.4不同粒度考察
为探究样品粒度对提取效果是否有影响，故设置消渴清颗粒及消渴清颗粒细分两种不同粒度的样品进行试验比较考察。结果表明：直接超声和研细后再超声对于盐酸小檗碱的提取率两者之间没有明显差异。因此，从简化操作考虑，选择颗粒直接超声提取，结果见图-5。
1.3.5供试品溶液富集纯化方法的考察
1.3.5.1固相萃取填料类型的考察
据文献知氧化铝对生物碱类成分有较好的富集纯化作用，因此本研究主要考察不同氧化铝填料(中性，碱性)对消渴清颗粒中生物碱类成分的富集纯化效果，结果表明：中性氧化铝作为固相萃取填料，可最大程度的富集处方药物中的生物碱类成分。最终确定选用中性氧化铝作为固相萃取小柱的填料，结果见图-6。
1.3.5.2固相萃取填料用量的考察
在洗脱溶剂用量相同时，中性氧化铝的用量直接影响对杂质的吸附能力，因此需要对其用量做系统全面的考察。结果表明：仅针对盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的定量而言，5ml供试品溶液上样甲醇洗脱定容至25ml量瓶，3g～6g的填料均可；针对指纹图谱而言，色谱峰差异主要体现在5-18分钟之间，3g用量时有非黄连的成分被洗脱下来，杂峰相对较多。综合成本等因素考虑，最终选用5g中性氧化铝装柱，结果见图-7。
1.3.5.3洗脱溶剂用量的考察
甲醇洗脱用量直接关系到盐酸巴马汀和盐酸小檗碱定量的准确性，同时影响定量后溶液溶剂组成，而降低有机相比例有利于消除色谱峰溶剂效应。因此实验对甲醇用量进行考察。结果表明当中性氧化铝用量为5g时，初流出液中不存在与黄连药材对应的生物碱成分，其主要存在于甲醇洗脱液中，15ml甲醇洗脱完全。同时考察各色谱峰相对较小，最方便的方式是增大进样量，但同时易发生溶剂效应使峰裂峰。综合考虑采用5ml上样收集初流液，15ml甲醇洗脱，加水定容至25ml，进样量增加为20μl。结果见图-8。
1.4分析方法建立过程小结
综上分析，最终确定消渴清指纹图谱分析方法如下：
取消渴清颗粒0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸(100:1)混合溶液，密闭，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟3000转)3分钟，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径为1cm，20ml甲醇活化)上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
其中的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为15cm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm，建议采用Agilent SB-C18色谱柱)；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
Figure BDA0001596027070000081
1.5色谱峰归属
采用已有对照品与药材对指纹图谱色谱峰进行定性研究，其中1～9峰均来自黄连，色谱峰4为盐酸非洲防己碱、5为盐酸表小檗碱、6为盐酸药根碱、7为盐酸黄连碱、8为盐酸巴马汀、S为盐酸小檗碱。消渴清颗粒生物碱类成分典型色谱图见图-9。
2.步骤2指纹图谱分析方法方法学验证如下：
2.1专属性
对照品溶液的制备：分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每ml含盐酸巴马汀2.0μg和盐酸小檗碱4.5μg的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品(批号：140702)约0.5g，按“1.4”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液。
黄连的阴性供试品溶液的制备：取缺黄连的消渴清颗粒(处方中去除黄连并按其制法制备)约0.5g，按“3.4.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液。
空白溶剂：除不称取消渴清颗粒外，其他均按“3.4.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液。
测定法：色谱条件同已确定的方法，分别取上述溶液各20μl，注入液相色谱仪分析，测定，记录色谱图，即得。由10-1，10-2可知，空白溶液与阴性样品色谱图中在盐酸巴马汀和盐酸小檗碱照品色谱峰处无对应色谱峰出现，故该方法专属性好，可对盐酸巴马汀和盐酸小檗碱进行定量测定。
2.2稳定性试验
取批号为140702的消渴清颗粒，按“1.4”项制备供试品溶液，分别于0h、2h、8h、10h、12h、16h、20h、22h、24h进样分析，以盐酸小檗碱峰为参照峰,考察共有峰的相对保留时间及相对峰面积的变化情况，结果各共有峰相对保留时间的RSD小于0.14％；相对峰面积的RSD％在0.59％～7.84％，表明供试品溶液中12个色谱峰在24h内相对稳定。结果详见表3-1～3-2。
表3-1稳定性--相对保留时间
Figure BDA0001596027070000091
表3-2稳定性--相对峰面积
Figure BDA0001596027070000092
Figure BDA0001596027070000101
2.3重复性试验
取批号为140702的消渴清颗粒，按70％，100％，130％三个浓度水平称样，分别为0.35g，0.5g，0.65g，按“4.1”项制备供试品溶液，三个浓度平行制备三份，共九份，按确定的色谱条件进样分析。以盐酸小檗碱峰为参照峰,考察共有峰的相对保留时间及相对峰面积。各共有峰相对保留时间的RSD小于0.21％；除peak10的相对峰面积为14.19％，其余各峰相对峰面积的RSD％均小于8.93％，说明本方法的重复性相对良好。结果详见表4-1～4-2。
表4-1重复性—相对保留时间
Figure BDA0001596027070000102
表4-2重复性—相对峰面积
Figure BDA0001596027070000103
2.4中间精密度试验
为考察随机变动因素对精密度的影响，设计开展中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。不同分析人员于不同日期，取批号为140702的消渴清颗粒，按70％、100％、130％三个浓度水平称样，分别为0.35g、0.5g、0.65g，精密称定，按“6.1”项制备供试品溶液，照已确定色谱条件于不同仪器(①Waters HPLC 2695-2996；②WatersHPLC 2695-2489)上分析，以盐酸小檗碱峰为参照峰,考察共有峰的相对保留时间及相对峰面积的变化情况,结果表明各共有峰相对保留时间的RSD小于0.74％；除peak10的相对峰面积为67.70％，其余各峰相对峰面积的RSD％均小于10.12％，说明本方法的精密度相对良好。结果详见下5-1～9-2。
表5-1中间精密度—相对保留时间统计表
Figure BDA0001596027070000111
表5-2中间精密度—相对峰面积统计表
Figure BDA0001596027070000112
2.5耐用性
取批号为140702的消渴清颗粒，按70％、100％、130％三个浓度水平称样，分别为0.35g、0.5g、0.65g，精密称定，按“1.4”项制备供试品溶液，照已确定色谱条件除每次改变一个变量，分别改变波长(343nm、347nm)，柱温(33℃，37℃)，色谱柱(SAGA)进行耐用性测试，试验结果证明各共有峰相对保留时间的RSD小于3.28％；除peak10的相对峰面积为26.42％，其余各峰相对峰面积的RSD％均小于14.32％，，本方法耐用性良好，结果详见下6-1～6-2。
表6-1耐用性—相对保留时间统计表
Figure BDA0001596027070000113
Figure BDA0001596027070000121
表6-2耐用性—相对峰面积统计表
Figure BDA0001596027070000122
2.6指纹图谱小结
通过对所建立的生物碱指纹图谱方法的稳定性、重复性、精密度、耐用性考察发现，peak10稳定性良好，但易受供试品处理过程的影响，造成重复性差。因此，暂不将peak10作为共用峰。
3.步骤3标准指纹图谱的建立及评价
3.1消渴清颗粒样品指纹图谱测定
选取2012年-2014年正常样品共12批，每年选取4批；加速6个月样品1批。按“1.4”项制备供试品溶液，照已确定的色谱条件测定并记录色谱图。
通过对13批消渴清颗粒样品的相对保留时间和相对校正因子统计分析可知：12个色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.10％；peak10和peak12的相对校正因子RSD分别为44.12％和31.75％，其余均小于16.29％。其中，造成peak10差异大的原因为供试品制备和产品差异造成的，因此不作为共有峰；而peak12差异大是由样品差异造成的因此在建立对照指纹图谱时将其定为共有峰。结果详见表7-1～7-2。
表7-1 13批消渴清颗粒样品的相对保留时间统计表
Figure BDA0001596027070000123
Figure BDA0001596027070000131
表7-2 13批消渴清颗粒样品的相对封面积统计表
Figure BDA0001596027070000132
3.2标准指纹图谱的建立
将上述13批消渴清颗粒测定的色谱图导入到国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统》(2.0版)软件,分析13批样品的指纹图谱并生成共有峰对照指纹图谱(图11)。生成的对照指纹图谱包含11个Mark色谱峰，采用平均数结合全谱匹配模式技术，其相似度评价结果显示(表-8)，13批样品相似度在0.980～0.999之间。消渴清颗粒中生物碱类成分对照指纹图谱见图11-1；13批消渴清颗粒的指纹图谱见图11-2。
表-8 13批消渴清颗粒样品相似度
Figure BDA0001596027070000133
二、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀外标法定量分析方法研究
该分析方法建立包括以下步骤：步骤1：盐酸小檗碱、盐酸巴马汀外标法定量分析方法的建立；步骤2：盐酸小檗碱、盐酸巴马汀外标法定量分析方法的方法学验证；步骤3：样品中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀含量测定。
1.步骤1盐酸小檗碱、盐酸巴马汀外标法定量分析方法的建立
方法建立过程同“一、生物碱类成分指纹图谱分析方法”步骤1“指纹图谱分析方法的建立”项下内容。
2.步骤2盐酸小檗碱、盐酸巴马汀外标法定量分析方法的方法学验证
2.1专属性
同“一、生物碱类成分指纹图谱分析方法，该方法包括以下步骤”，“2.1专属性项下”内容。
2.2分离度
同“一、生物碱类成分指纹图谱分析方法，该方法包括以下步骤”，“2.2分离度项下”内容
2.3稳定性
2.3.1对照品溶液的稳定性
取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的混合对照品溶液分别于0h、2h、8h、10h、12h、16h、20h、22h、24h进样分析，计算各时间点峰面积与0时峰面积的RAD及各时间点峰面积的相对平均偏差RSD。盐酸小檗碱、盐酸巴马汀对照品溶液各时间点，峰面积与0时峰面积的RAD均小于2.0％，各时间点峰面积间的相对平均偏差RSD均小于2.0％。说明盐酸巴马汀与盐酸小檗碱混合对照品溶液在室温下24h内稳定。对照品溶液稳定性结果见表-1。
表-1混合对照品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0001596027070000141
2.3.2供试品溶液的稳定性
按“3.4.2”项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、8h、10h、12h、16h、20h、22h、24h进样分析，计算盐酸小檗碱、盐酸巴马汀各时间点峰面积与0时峰面积的RAD及各时间点峰面积的相对平均偏差RSD。供试品溶液各时间点，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀峰面积与0时峰面积的均小于2.0％，各时间点峰面积间的相对平均偏差RSD小于2.0％。说明消渴清颗粒供试品溶液在室温下24h内稳定。消渴清颗粒供试品溶液稳定性结果见表-2。
表-2消渴清颗粒供试品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0001596027070000142
2.4线性与范围
对照品溶液制备过程：取盐酸巴马汀与盐酸小檗碱对照品适量，加80％甲醇制成混合对照品母液，然后再逐级稀释。混合对照品系列浓度见表7。分别精密吸取上述对照品溶液20μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见测定结果表-3、图-1。试验结果表明，盐酸巴马汀标准曲线方程为y＝90848.72x+264.33，r＝1.000，盐酸巴马汀浓度在0.336μg/ml～5.3789μg/ml浓度范围内线性良好；盐酸小檗碱标准曲线方程为y＝85956.98x–693.00，r＝1.000，盐酸小檗碱浓度在0.576μg/ml～9.2162μg/ml浓度范围内线性良好。
表-3混合对照品溶液对照品浓度与对应峰面积
Figure BDA0001596027070000151
2.5精密度
2.5.1重复性
取批号为140702的消渴清颗粒，按70％，100％，130％三个浓度水平称样，分别为0.35g，0.5g，0.65g，按“1.4”项制备供试品溶液，三个浓度平行制备三份，共九份。试验结果表明盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的RSD％均小于2.0，重复性良好，结果详见表4-1-4-2。
表4-1重复性试验--盐酸巴马汀
Figure BDA0001596027070000152
表4-2重复性试验--盐酸小檗碱
Figure BDA0001596027070000153
2.5.2中间精密度
为考察随机变动因素对精密度的影响，设计开展中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。不同分析人员于不同日期，取批号为140702的消渴清颗粒，按70％、100％、130％三个浓度水平称样，分别为0.35g、0.5g、0.65g，精密称定，按“1.4”项制备供试品溶液，照已确定色谱条件于不同仪器(①Waters HPLC 2695-2996；②WatersHPLC 2695-2489)上分析，测定，并计算含量。不同日期、不同分析人员、不同设备试验中盐酸巴马汀平均含量为146.8841μg/g，RSD为0.68％；盐酸小檗碱平均含量为451.9621μg/g，RSD为1.62％，符合要求，结果见表5-1～5-2。
表5-1盐酸巴马汀中间精密度试验结果表
Figure BDA0001596027070000161
表5-2盐酸小檗碱中间精密度试验结果表
Figure BDA0001596027070000162
2.6准确度
取批号为140702的消渴清颗粒，精密称取0.25g，共9份，置具塞50ml离心管中，向上述已知含量的样品中加入对照品混合溶液10ml使其含量达到样品的70％、100％、130％，再按“3.4.2”项制备供试品溶液，每个浓度平行制备3份。按已确定色谱条件测定，并计算回收率。盐酸巴马汀的平均回收率为102.84％，RSD为0.34％；盐酸巴马汀的平均回收率为104.10％，RSD为1.3％，说明该方法准确度良好，结果详见表6-1～6-2。
表6-1盐酸巴马汀准确度试验结果统计表
Figure BDA0001596027070000163
表6-2盐酸小檗碱准确度试验结果统计表
Figure BDA0001596027070000164
Figure BDA0001596027070000171
2.7耐用性
取批号为140702的消渴清颗粒，按70％、100％、130％三个浓度水平称样，分别为0.35g、0.5g、0.65g，精密称定，按“3.4.2”项制备供试品溶液，照已确定色谱条件除每次改变一个变量，分别改变波长(343nm、347nm)，柱温(33℃，37℃)，色谱柱(SAGA)进行耐用性测试，试验结果证明本方法耐用性良好，结果详见下表7-1～7-2。
表7-1耐用性考察试验盐酸巴马汀汇总表
Figure BDA0001596027070000172
表7-2耐用性考察试验盐酸巴马汀汇总表
Figure BDA0001596027070000173
3.步骤3样品中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀含量测定
选取2012年-2014年正常样品共12批，每年选取4批，加速6个月样品1批。按“3.4.2”项制备供试品溶液，照已确定色谱条件，测定样品中盐酸巴马汀与盐酸小檗碱含量。盐酸巴马汀含量范围为104.332～164.456mg/g，平均值为135.235mg/g；盐酸小檗碱含量范围为348.993～520.398mg/g，平均值为434.045mg/g；同时，测定结果表明盐酸巴马汀与盐酸小檗碱在加速6个月内稳定。结果见表8-1～8-2。
表8-1 13批样品中盐酸巴马汀含量测定结果
Figure BDA0001596027070000174
表8-2 13批样品中盐酸小檗碱含量测定结果
Figure BDA0001596027070000175
Figure BDA0001596027070000181
三、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀一测多评法定量分析方法研究
该分析方法建立包括以下步骤：步骤1：一测多评盐酸小檗碱、盐酸巴马汀定量分析方法的建立；步骤2：相对校正因子确立；步骤3：相对校正因子再验证
1.步骤1一测多评盐酸小檗碱、盐酸巴马汀定量分析方法的建立
方法建立过程同“一、生物碱类成分指纹图谱分析方法”步骤1“指纹图谱分析方法的建立”项下内容。
2.步骤2相对校正因子确立；
一测多评法(Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker，QAMS)利用中药有效成分内在的比例关系，只测定一个成分(对照品可得到者)，即可实现多个成分的同步测定。其原理：在一定的范围内(线性范围内)成分的量(质量或浓度)与检测器响应值成正比。在多指标质量评价时，以药材中某一典型组分(有对照品者)为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子(f)，通过相对校正因子计算其他组分的量。
2.1试验条件
同“一、生物碱类成分指纹图谱分析方法”“1.4”项下内容。
含量计算：用一测多评法计算盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量。公式如下：
Figure BDA0001596027070000182
Figure BDA0001596027070000183
2.2待测组分色谱峰的定位
根据消渴清颗粒多成分含量测定方法学验证中各个测定项下盐酸巴马汀与盐酸小檗碱的相对保留时间的均值来对待测组分色谱峰的定位。根据统计可知，本标准中盐酸巴马汀色谱峰的相对保留时间为0.9714±0.0017，结果详见表-1。
表-1相对保留时间确定表
Figure BDA0001596027070000184
2.3相对校正因子的确定
2.3.1相对校正因子计算公式的确定
可参考的相对校正因子计算方法有如下3种：
①多点法(MP)：即以多个浓度点计算所得校正因子的平均值作为相对校正因子fi/s，可配制不同浓度的混合对照品溶液分别测定，或精密吸取不同体积的同一混合对照品溶液进样分析，分别计算不同体积下的fi/s，计算公式为：
Figure BDA0001596027070000191
fi/s为相对校正因子；Cs为参照物浓度；As为参照物峰面积；Ci为待测物质浓度；Ai为待测物质浓度。
②斜率法(CC)：通过一系列浓度的混合对照品溶液，分别测定各对照品的标准曲线，在标准曲线y＝kx+b中，在a/b值大于100时，相对校正因子(fi/s)可用二者的斜率k之比直接计算，计算公式为:
Figure BDA0001596027070000192
式中fi/s为相对校正因子；ki为待测成分标准曲线斜率；ks为参照物标准曲线斜率。
③过原点的曲线斜率法(SC):通过一系列浓度的混合对照品溶液，分别测定各对照品的标准曲线，将标准曲线的截距校正为0后，用两条标准曲线斜率k的比值求得待测成分相对校正因子(fi/s)，计算公式同斜率法。
2.3.2相对校正因子的计算
①多点法相对校正因子:
取盐酸巴马汀与盐酸小檗碱对照品适量，加80％甲醇制成相应母液，然后稀释制备混合对照品母液，再逐级稀释。分别精密吸取上述对照品溶液20μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图。混合对照品系列浓度及相应峰面积、相对校正因子见表-2。其相对校正因子为0.9407。
表-2多点法相对校正因子计算表
Figure BDA0001596027070000193
②斜率法相对校正因子:
根据表-2中盐酸巴马汀与盐酸小檗碱混合对照品系列浓度及相应峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算其相对校正因子。斜率法(CC)相对校正因子为0.9462，结果详见表-3。
表-3斜率法相对校正因子计算表
Figure BDA0001596027070000201
③过原点的曲线斜率法相对校正因子：
根据表14中盐酸巴马汀与盐酸小檗碱混合对照品系列浓度及相应峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，将标准曲线的截距校正为0，并计算其相对校正因子。过原点的曲线斜率法相对校正因子为0.9441，结果详见表-4。
表-4斜率法相对校正因子计算表
Figure BDA0001596027070000202
2.4一测多评法的确定
采用上述三种相对校正因子(多点法0.9407、斜率法0.9462、过原点的曲线斜率法0.9441)对多成分含量方法学验证过程中的各项下的盐酸巴马汀进行含量计算，并与外标一点法含量测定结果进行对比分析，对比结果详见表-5。
通过对比分析结果可知，三种相对校正因子计算方法计算所得含量值与外标法均无较大差异，但相比斜率法和多点法，过原点的曲线斜率法测得含量值更接近外标法，故相对校正因子计算方法最终选择过原点的曲线斜率法，即相对校正因子为0.9441。
2.5一测多评法样品测定
采用多成分含量测定方法中13批样品测定数据，带入相对校正因子计算盐酸巴马汀的含量，结果详见表-5。盐酸巴马汀的含量在104.51μg/g～164.73μg/g之间。
表-5 13批样品一测多评法测定盐酸巴马汀含量结果
Figure BDA0001596027070000203
步骤3、一测多评法再验证；
将一测多评方法测定盐酸巴马汀含量结果与外标一点法测定结果进行对比分析，验证本研究建立的一测多评方法的可靠性、准确性。二者计算方式计算盐酸巴马汀含量间RAD％在-0.081％～-0.088％，结果见表-6～表-7说明一测多评法测定结果较外标一点法测定结果相对偏高，即为系统误差；但测定结果间并无显著差异。因此，本研究建立的一测多评方法是可靠的、准确的。
表-6三种相对校正因子与外标一点法盐酸巴马汀含量计算结果对比表
Figure BDA0001596027070000204
Figure BDA0001596027070000211
表-7三种相对校正因子与外标一点法盐酸巴马汀含量计算结果对比表
Figure BDA0001596027070000212
附图说明
图-1消渴清颗粒供试品溶液在最优色谱条件下的色谱图
图-2不同提取溶剂考察柱状图
图-3不同固液比考察结果柱状图
图-4不同提取时间考察结果柱状图
图-5不同粒度考察结果柱状图
图-6过中性氧化铝与碱性氧化铝的色谱图
图-7不同填料用量纯化后液相色谱图
图-8中性氧化铝固相萃取柱洗脱色谱图
图-9消渴清颗粒生物碱类成分典型色谱
图10-1专属性试验缺黄连阴性色谱图
图10-2专属性试验空白溶剂色谱图
图11-1消渴清颗粒中生物碱类成分指纹图谱
图11-2 13批消渴清颗粒生物碱类成分指纹图谱
图-12盐酸巴马汀与盐酸小檗碱标准曲线
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
消渴清颗粒中生物碱类成分含量检测方法，包括以下步骤：
步骤A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每ml含盐酸巴马汀2μg和盐酸小檗碱4.5μg的混合对照品溶液。
步骤B供试品溶液制备，方法如下：
取消渴清颗粒0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸(100:1)混合溶液，密闭，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟3000转)3分钟，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径为1cm，20ml甲醇活化)上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得到续滤液；
步骤C测定：吸取步骤A和B所得的溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
用外标法计算样品中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀的含量，
其中，高效液相色谱的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为15cm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm，建议采用Agilent SB-C18色谱柱)；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，按表中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm。
梯度洗脱程序为
Figure BDA0001596027070000221
实施例2
消渴清颗粒是否合乎标准对照指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
A供试品溶液制备，方法如下：
取待测样品消渴清药物0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸(100:1)混合溶液，密闭，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟3000转)3分钟，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径为1cm，20ml甲醇活化)上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得续滤液。
B测定：吸取步骤A所得的供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
高效液相色谱的色谱条件为
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为15cm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm，建议采用Agilent SB-C18色谱柱)；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，按表中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000，
梯度洗脱程序为
Figure BDA0001596027070000222
Figure BDA0001596027070000231
C和消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。
实施例3
消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱的建立方法，步骤如下：
步骤A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每ml含盐酸巴马汀2μg和盐酸小檗碱4.5μg的混合对照品溶液。
步骤B供试品溶液制备，方法如下：
取多批次合格消渴清药物0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸(100:1)混合溶液，密闭，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得到续滤液；
步骤C测定：吸取步骤A和B所得的溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱。
其中，高效液相色谱的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，按表中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm，
梯度洗脱程序为
Figure BDA0001596027070000232
或
Figure BDA0001596027070000233
或
Figure BDA0001596027070000234
Figure BDA0001596027070000241
实施例4
消渴清药物生物碱类成分的含量检测方法，包括以下步骤：
步骤A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每ml含盐酸巴马汀2μg和盐酸小檗碱4.5μg的混合对照品溶液。
步骤B供试品溶液制备，方法如下：
取消渴清颗粒0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸(100:1)混合溶液，密闭，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得到续滤液；
步骤C测定：吸取步骤A和B所得的溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
计算样品中盐酸小檗碱、使用相对校正因子计算出盐酸巴马汀的含量，
其中，高效液相色谱的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm，
梯度洗脱程序为
Figure BDA0001596027070000242
或
Figure BDA0001596027070000243
或
Figure BDA0001596027070000244
Figure BDA0001596027070000251
实施例5
消渴清颗粒生物碱类成分一测多评定量指纹图谱检测方法，
对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成盐酸小檗碱4.5μg的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：取消渴清颗粒0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸(100:1)混合溶液，密闭，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸(100:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟3000转)3分钟，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径为1cm，20ml甲醇活化)上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定：分别吸取对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪测定，得到定量指纹图谱，计算样品中盐酸小檗碱含量，使用相对校正因子计算出盐酸巴马汀的含量，其中的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为15cm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm，Agilent SB-C18色谱柱)；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm洗脱程序
Figure BDA0001596027070000252

Claims (5)

1.一种消渴清药物生物碱类成分检测方法，其特征在于，包括以下步骤
A供试品溶液制备，方法如下：取待测样品消渴清药物0.3-0.7g，加入8-12ml甲醇:盐酸为100:1的混合溶液中，密闭，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸为100:1的混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取4-6ml，上中性氧化铝柱，用甲醇10-15ml洗脱，收集流出液与洗脱液，加水至24-26ml，摇匀，滤过，得到滤液；
B测定：吸取步骤A所得的供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
C和消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品；
其中高效液相色谱的色谱条件为
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm，梯度洗脱程序为
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，
A供试品溶液制备，方法如下：
取待测样品消渴清药物0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸为100:1的混合溶液，密闭，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸为100:1的混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心3分钟，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得续滤液。
3.权利要求1所述的消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤如下：
A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品，加甲醇溶液制成酸巴马汀和盐酸小檗碱的混合对照品溶液；
B供试品溶液制备，方法如下：取多批次合格消渴清药物0.3-0.7g，加入8-12ml甲醇:盐酸为100:1的混合溶液中，密闭，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸100:1的混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取4-6ml，上中性氧化铝柱，用甲醇10-15ml洗脱，收集流出液与洗脱液，加水至24-26ml，摇匀，滤过，得到滤液；
C测定：吸取步骤A和B所得的溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱；
其中，高效液相色谱的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，按表中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为345nm，
梯度洗脱程序为
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤如下：
A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品，精密称定，加80％甲醇制成每ml含盐酸巴马汀1.0～3.0μg和盐酸小檗碱3.5～5.5μg的混合对照品溶液；
B供试品溶液制备，方法如下：
取多批次合格消渴清药物0.5g，加入10ml甲醇:盐酸为100:1的混合溶液，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸为100:1的混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心3分钟，取5ml，上中性氧化铝柱上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得到滤液；
C测定：吸取步骤A和B所得的溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤A对照品溶液制备，方法如下：
分别取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每ml含盐酸巴马汀2μg和盐酸小檗碱4.5μg的混合对照品溶液；
步骤B供试品溶液制备，方法如下：
取多批次合格消渴清药物0.5g，精密称定，置于50ml离心管中，精密加入10ml甲醇:盐酸为100:1的混合溶液，密闭，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇:盐酸为100:1的混合溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液备用；精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱上，用甲醇15ml洗脱，收集流出液与洗脱液于25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，得到续滤液；
步骤C测定：吸取步骤A和B所得的溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到色谱图，上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种消渴清药物生物碱类成分标准对照指纹图谱。
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