CN111323518B - 一种乌锦颗粒的uplc-pda联合qams的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽药检测技术领域，具体涉及一种乌锦颗粒的UPLC‑PDA联合QAMS的检测方法。该检测方法，采用超高效液相色谱‑二极管阵列检测法，使用光谱图进行鉴别，使用色谱图进行含量定量检测。并且建立了一测多评法，使用和厚朴酚为内参物，建立和厚朴酚与盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚间的相对校正因子，用所得相对校正因子进行含量计算，实现一测多评。该方法能够对四中物质进行快速定性和定量，方法精确度和重现性高，减少了对照品的购买和投入，节约了资金。

Description

一种乌锦颗粒的UPLC-PDA联合QAMS的检测方法
技术领域
本发明属于兽药检测技术领域，具体涉及一种乌锦颗粒的UPLC-PDA联合QAMS的检测方法。
背景技术
中华人民共和国农业部公告2019年第164号，颁布了乌锦颗粒获得了新兽药证书，并颁布其检测质量标准。乌锦颗粒【功能】涩肠止泻，清热燥湿。【主治】羔羊痢疾。
标准具体如下：
【鉴别】(1)取本品5g，研细，加甲醇30ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取地锦草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取供试品溶液4μl，对照药材溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(5:5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液显色。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(2)取本品5g，研细，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.25g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取供试品溶液5μl，对照药材溶液3μl，对照品溶液1μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3:3.5:1:1.5:0.5:1)为展开剂，置用浓氨试液预饱和20分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(3)取本品10g，研细，加水30ml使溶解，用石油醚(30-60℃)振摇提取2次，每次30ml。合并石油醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取供试品溶液5μl、对照品溶液2μl，分别点于同一以硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-浓氨溶液(5:2:4:0.5)为展开剂，预饱和10分钟，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】应符合颗粒剂项下有关的各项规定(附录0106)。
【含量测定】黄连按照高效液相色谱法(附录0512)测定。
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(47：53)(1000ml水中含磷酸二氢钾3.4g与十二烷基磺酸钠1.7g)为流动相；检测波长为347nm。理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含80μg的溶液，滤过，即得。
供试品溶液的制备取本品研细粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品含黄连按盐酸小檗碱(C20H17NO4·HCl)计，每1g不得少于1.60mg。
厚朴按照高效液相色谱法(附录0512)测定。
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(78:22)为流动相；检测波长为294nm。理论塔板数按厚朴酚峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备取厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含厚朴酚40μg、和厚朴酚24μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品研细粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品含厚朴以厚朴酚(C18H18O2)与和厚朴酚(C18H18O2)的总量计，每1g不得少于1.70mg。
采用该方法鉴别结果稳定、明显、重现性好，但是薄层鉴别所用的试剂繁多，采用了对人体和环境危害大、污染大的环己烷、异丙醇、石油醚、乙酸乙酯等物质，而且，斑点容易受相对湿度、温度等各种外界因素的干扰。对主成分进行定性和定量测定时，需要配制两次不同的流动相，采用不同的色谱条件，来进行检测，费时费力，一个样品的检测，至少需要两三天左右的时间。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种快速定性定量乌锦颗粒的检测方法。
本发明是通过下述的技术方案来实现的：
一种乌锦颗粒的UPLC-PDA联合QAMS的检测方法，乌锦颗粒采用超高效液相色谱-二极管阵列检测法，使用光谱图进行鉴别，使用色谱图进行含量定量检测。
优选的，上述的方法中，使用色谱图进行含量定量检测的具体步骤如下：
(1)分别称取盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚对照品，并分别用有机溶剂稀释并定容，获得盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚的储备液；
(2)分别取上述的4种储备液，加入有机溶液定容，作为标准工作液；取不同体积的样品，进样，等度洗脱，PDA检测器分析，通过超高效液相色谱仪进行定性定量检测；取峰面积和对照品的量制作标准曲线；
(3)采用保留时间和光谱图进行定性鉴别，进行定量测定；
(4)取样品，加乙腈与磷酸水溶液置于离心管中，震荡，室温离心，取上清，滤膜过滤，取样品进样，测试；
(5)使用超高效液相色谱仪器，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，CSHTMC18为色谱柱，2.1*100mm，粒径1.7um；以乙腈－0.1％磷酸溶液－十二烷基硫酸钠(50：50：0.1)为流动相，进样量2μL，检测波长为255nm，流速0.25ml/min，柱温35℃，进样室温度10℃。理论塔板数均大于8000，同时对四种成分进行定量测定；
(6)建立了一测多评法(QAMS)，使用和厚朴酚为内参物，建立和厚朴酚与盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚间的相对校正因子，用所得相对校正因子进行含量计算(计算值)，实现一测多评；
所述步骤(6)盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚的相对校正因子计算方法为：
分别按公式fk/m＝0.955×Wk/Wm×(Am/Ak)、fk/m＝0.979×Wk/Wm×(Am/Ak)、fk/m＝0.998×Wk/Wm×(Am/Ak)计算盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚的相对校正因子，其中0.955、0.979、0.998分别为盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚的校正系数；盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚和内参物和厚朴酚间的相对校正因子分别为3.876、4.419、1.187；
所述步骤(1)中，有机溶剂为甲醇。
所述步骤(2)分别取上述的4种储备液2mL，加入甲醇定容至10mL，作为标准工作液；取0.1μL、0.2μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、5μL，进样，流速0.25mL/min，等度洗脱，超高效液相色谱仪，PDA检测器分析190～400nm，定性定量检测；取峰面积和对照品的量做标准曲线。
所述步骤(3)采用保留时间和光谱图进行定性鉴别，在255nm下进行定量测定。
所述步骤(4)取乌锦颗粒样品10g研磨成均匀一致的细粉，精确取样品0.2g，加入5mL乙腈和5mL质量浓度为0.1％磷酸水溶液至15mL离心管，在200rpm/min下震荡10min，10000rpm/min室温离心5min，取上清，0.22um滤膜过滤，取样品2μL进样，测试。
测定乌锦颗粒中4种主要成分盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚的含量，并与外标法测定结果进行比较，完全证明了QAMS的可行性。
本发明的有益效果在于，采用本发明的方法对乌锦颗粒中的成分进行检测，通过光谱图、色谱图、保留时间、峰面积等参数、结合一测多评法，能对4种主要成分盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚进行快速定性和定量，方法灵敏度、精确度和重现性高。
附图说明
图1为盐酸巴马汀标准曲线图；
图2为盐酸小檗碱标准曲线图；
图3为和厚朴酚标准曲线图；
图4为厚朴酚标准曲线图；
图5为由上而下依次为盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚药物光谱图；
图6为255nm乌锦颗粒色谱图；
图7为265nm乌锦颗粒色谱图；
图8为275nm乌锦颗粒色谱图；
图9为292nm乌锦颗粒色谱图；
图10为229nm乌锦颗粒色谱图；
图11为348nm乌锦颗粒色谱图。
图12为255nm混合对照品色谱图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
一种乌锦颗粒的检测方法，包括以下的步骤：
(1)分别称取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、和厚朴酚、厚朴酚对照品，并分别用甲醇稀释并定容，获得四种药物的储备液；
具体的：
盐酸小檗碱对照品，含量86.7％，中国食品药品检定研究院提供，精密称取30.09mg，用甲醇稀释并定容至100mL；
盐酸巴马汀对照品，含量86.2％，中国食品药品检定研究院提供，精密称取10.38mg，用甲醇稀释并定容至100mL；
和厚朴酚对照品，含量98.4％，中国药品生物制品检定所提供，精密称取12.52mg，用甲醇稀释并定容至100mL；
厚朴酚对照品，含量98.8％，中国药品生物制品检定所提供，精密称取15.81mg，用甲醇稀释并定容至100mL；
分别获得盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚的储备液；
各取上述4种储备液2mL，加甲醇定容至10mL，作为标准工作液。取0.1μL、0.2μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL，进样，流速0.25mL/min，等度洗脱，waters超高效液相色谱仪，PDA检测器分析190-400nm，定性定量检测。
使用超高效液相色谱仪器，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，CSHTMC18为色谱柱，2.1*100mm，粒径1.7um；以乙腈－0.1％磷酸溶液－十二烷基硫酸钠(50：50：0.1)为流动相，检测波长为255nm，流速0.25ml/min，柱温35度，进样室温度10度。理论塔板数均大于8000，分离度和准确度满足要求。单波长能同时对四种成分进行定量测定。
表1盐酸巴马汀标准曲线
Figure BDA0002447338540000051
Figure BDA0002447338540000061
表2盐酸小檗碱标准曲线
进样体积μL 盐酸小檗碱进样量ng 峰面积
0.2 10.44 159953
0.5 26.09 398865
1 52.18 799601
2 104.36 1590817
3 156.53 2425364
表3和厚朴酚的标准曲线
进样体积μL 和厚朴酚进样量ng 峰面积
0.2 4.92 17520
0.5 12.3 43025
1 24.62 85631
2 49.24 169879
3 73.86 256782
5 123.1 421963
表4厚朴酚标准曲线
进样体积μL 厚朴酚进样量ng 峰面积
0.2 6.32 26347
0.5 15.81 65231
1 31.62 130567
2 63.2 259002
3 94.86 392145
5 158.1 642695
(2)分别取上述的4种储备液2mL，加入甲醇定容至10mL，作为标准工作液；取0.1μL、0.2μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、5μL，进样，流速0.35mL/min，等度洗脱，waters超高效液相色谱仪，PDA检测器分析190～400nm，定性定量检测；取峰面积和对照品的量做标准曲线；
(3)采用保留时间和光谱图进行定性鉴别，在255nm下进行定量测定；
如附图4所示，四种药物的光谱图，本发明人使用保留时间和光谱图进行定性鉴别。盐酸巴马汀的最大吸收波长226.2nm、275nm、348.7nm；盐酸小檗碱的最大吸收波长229.2nm、266nm、348.6nm；和厚朴酚的最大吸收波长208.5nm、255.5nm、292.9nm，厚朴酚的最大吸收波长200.1nm、289.8nm，由于盐酸小檗碱的含量较高，229nm、265nm、348nm、275nm处，峰面积容易超载形成肩峰，292nm和厚朴酚的响应值偏低，通过样品不同波长峰面积相应值的比较，同时为了兼顾4种药物的峰形，选择了和厚朴酚的最大吸收波长255nm作为定量波长，进行定量测定。
表5不同波长下的主成分峰面积响应值表
波长 盐酸巴马汀 盐酸小檗碱 和厚朴酚 厚朴酚
229nm 610035 2770625 880924 1075522
255nm 490517 2054028 613635 259494
265nm 639714 27722698 479097 106008
275nm 635800 2339528 296467 215623
292nm 286398 985924 390302 374740
348nm 670967 2523085 181404 0
保留时间(min) 3.45 3.61 6.15 9.22
色谱柱耐受性检查：保持0.25mL/min流速不变，改变柱温33℃、35℃、38℃、40℃，保留时间上下浮动在0.35min以内；保持35℃柱温不变，流速0.24min、0.25min、0.26min保留时间上下浮动在0.35min以内；分离度均满足要求，而且样品检测含量均不受影响。
(4)样品的处理和检测
取样品10g研磨成均匀一致的细粉，精确取样品0.2g，加入5mL乙腈和5mL质量浓度为0.1％磷酸水溶液至15mL离心管，在200rpm/min下震荡10min，10000rpm/min室温离心5min，取上清，0.22um滤膜过滤，取样品2μL进样，测试。
样品来源为兽药企业的生产的乌锦颗粒，由以下重量份数的原料及方法制备而成：取乌梅180g地锦草200g黄连120g厚朴120g苍术160茯苓120g山楂100g，以上七味，厚朴用70％乙醇回流提取2次，每次1小时，合并乙醇液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.02～1.04(60～70℃)，得厚朴提取液，备用。其余黄连等六味，加水煎煮3次，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.10-1.20(60～70℃)，得水煎浓缩液。水煎浓缩液与厚朴提取液合并，继续浓缩至相对密度为1.30～1.35(60～70℃)的稠膏，加可溶性淀粉和蔗糖适量，制粒，干燥，制成1000g，即得。
表6采用外标法检测不同样品中不同成分含量
Figure BDA0002447338540000081
(5)一测多评方法的建立
建立了一测多评法(QAMS)，使用和厚朴酚为内参物，建立和厚朴酚与盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚间的相对校正因子，用所得相对校正因子进行含量计算(计算值)，实现一测多评。
和厚朴酚的保留时间为T，相对保留时间的计算：盐酸巴马汀0.561T、盐酸小檗碱0.587T、厚朴酚1.499T。
表7相对保留时间表
药物名称 内参物保留时间 各药物保留时间 相对保留时间
盐酸巴马汀 6.15 3.45 0.561
盐酸小檗碱 6.15 3.61 0.587
和厚朴酚 6.15 6.15 1
厚朴酚 6.15 9.22 1.499
以和厚朴酚为内参物，分别按公式fk/m＝＝0.955×Wk/Wm×(Am/Ak)、fk/m＝0.979×Wk/Wm×(Am/Ak)、fk/m＝0.998×Wk/Wm×(Am/Ak)计算盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚的相对校正因子，其中0.955、0.979、0.998分别为盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚的校正系数，校正系数通过拟合得到。式中Ak和Wk分别为内参物的峰面积和浓度，Am和Wm分别为其他组分m的峰面积和浓度。盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚和内参物和厚朴酚间的相对校正因子分别为3.876、4.419、1.187。
相对校正因子的计算：
表8采用一测多评法计算不同样品中不同成分含量
Figure BDA0002447338540000091
同时对比采用外标法测定4个成分的含量(实测值)表6，比较计算值与实测值的差异，均小于1％。结果5份乌锦颗粒中4种成分含量的计算值与实测值无显著差异。结论QAMS可用于乌锦颗粒中4种不同成分的含量测定。
本发明的方法前处理简单，需要的有机溶剂品种和量比薄层色谱少很多，毒性小，保护环境和实验者；并且本发明的方法色谱柱耐受性好，流速微小改变、柱温微小改变保留时间变化极小，分离度均大于1.5满足要求，保留时间和峰面积变化极少,峰面积RSD<3％，重现性精密度良好。对照品的标准曲线相关系数均大于0.999，相关性极好，并且能同时对4种主成分盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚的进行定性定量测定；同时建立了一测多评，只需要用一支和厚朴酚的对照品，减少了盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚对照品的使用及资金投入，能同时计算4种药物的含量；而且样品前处理简单方便，使用1种流动相1种色谱条件，采用超高效液相色谱仪，比普通液相色谱仪使用的流动相减少90％以上，产生废液减少90％以上，符合绿色减排的原则。本发明的方法检测时间快，仅需12分钟左右，每运行一针比普通液相色谱仪节约30分钟左右，经济方便快捷，提高了检测效率。

Claims (4)

1.一种乌锦颗粒的UPLC-PDA联合QAMS的检测方法，其特征在于，乌锦颗粒采用超高效液相色谱-二极管阵列检测法，使用光谱图进行鉴别，使用色谱图进行含量定量检测；
使用色谱图进行含量定量检测的具体步骤如下：
(1)分别称取盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚对照品，并分别用有机溶剂稀释并定容，获得盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚的储备液；
(2)分别取上述的4种储备液，加入有机溶液定容，作为标准工作液；取不同体积的样品，进样，等度洗脱，PDA检测器分析，通过超高效液相色谱仪进行定性定量检测；取峰面积和对照品的量制作标准曲线；
(3)采用保留时间和光谱图进行定性鉴别，进行定量测定；
(4)取样品，加乙腈与磷酸水溶液置于离心管中，震荡，室温离心，取上清，滤膜过滤，取样品进样，测试；
(5)使用超高效液相色谱仪器，同时对四种成分盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、和厚朴酚、厚朴酚进行定量测定；
(6)建立了一测多评法QAMS，使用和厚朴酚为内参物，建立和厚朴酚与盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚间的相对校正因子，用所得相对校正因子进行含量计算，实现一测多评；
所述步骤(6)盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚的相对校正因子计算方法为：
分别按公式fk/m＝0.955×Wk/Wm×(Am/Ak)、fk/m＝0.979×Wk/Wm×(Am/Ak)、fk/m＝0.998×Wk/Wm×(Am/Ak)计算盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚的相对校正因子，其中0.955、0.979、0.998分别为盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚的校正系数；盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、厚朴酚和内参物和厚朴酚间的相对校正因子分别为3.876、4.419、1.187；式中Ak和Wk分别为内参物的峰面积和浓度，Am和Wm分别为其他组分m的峰面积和浓度；
所述步骤(4)取乌锦颗粒样品10g研磨成均匀一致的细粉，精确取样品0.2g，加入5mL乙腈和5mL质量浓度为0.1％磷酸水溶液至15mL离心管，在200rpm/min下震荡10min，10000rpm/min室温离心5min，取上清，0.22um滤膜过滤，取样品2μL进样，测试；
所述步骤(5)用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，CSHTMC18为色谱柱，2.1*100mm，粒径1.7um；以乙腈－0.1％磷酸溶液－十二烷基硫酸钠，体积比为50：50：0.1为流动相，进样量2μL，检测波长为255nm，流速0.25ml/min，柱温35℃，进样室温度10℃；理论塔板数均大于8000，同时对四种成分进行定量测定。
2.根据权利要求1所述的乌锦颗粒的UPLC-PDA联合QAMS的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，有机溶剂为甲醇。
3.根据权利要求1所述的乌锦颗粒的UPLC-PDA联合QAMS的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)分别取上述的4种储备液2mL，加入甲醇定容至10mL，作为标准工作液；取0.1μL、0.2μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、5μL，进样，流速0.25mL/min，等度洗脱，超高效液相色谱仪，PDA检测器分析190～400nm，定性定量检测；取峰面积和对照品的量做标准曲线。
4.根据权利要求1所述的乌锦颗粒的UPLC-PDA联合QAMS的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)采用保留时间和光谱图进行定性鉴别，在255nm下进行定量测定。
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