CN109142588B - 一种莲芝消炎胶囊hplc特征图谱及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：取莲芝消炎胶囊研细，加入甲醇超声提取，摇匀，滤过，取续滤液；(2)对照品溶液制备：取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品，加入甲醇溶解；(3)阴性样品溶液制备：分别取穿心莲干浸膏、山芝麻干浸膏研细，加入甲醇超声提取，摇匀，滤过，取续滤液；(4)高效液相色谱检测，构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱。本发明还公开了根据上述方法构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱在莲芝消炎胶囊检测中的应用。本发明首次构建了莲芝消炎胶囊的HPLC特征图谱，其所包含的特征峰全面，定位准确，可有效鉴别莲芝消炎胶囊的真伪，为评价其质量的优劣提供了快速标准检测方法。

Description

一种莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱及其构建方法和应用。

背景技术

莲芝消炎胶囊由穿心莲、山芝麻两味药材制成的复方制剂，具有清热解毒，凉血消炎之功效，主要用于治疗支气管炎、扁桃体炎、咽喉炎、肺炎等。

穿心莲又名一见喜，为爵床科植物穿心莲的干燥地上部分。原产印度，我国华东、中南等地区均有栽培，性苦，寒，归心、肺、大肠、膀胱经，具有清热解毒、凉血、消肿止痛等功效。临床主要用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，素蛇咬伤等证。穿心莲的主要成分有二萜内酯与黄酮类化合物，主要为穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯等。现代药理研究表明，穿心莲内酯及其衍生物具有抗炎抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、治疗心脑血管疾病、保肝利胆等作用。

山芝麻为梧桐科植物山芝麻的根，是华南地区常用草药，因其果实形似芝麻的果实而得名。本品自清代即为广东凉茶(原王老吉凉茶)的主要药料，也是部分中药制剂的原料。其味苦、性寒，归肺、大肠经，可解表清热，解毒消肿，用于感冒发热、痄腮、乳娥、麻疹、咳嗽、泄泻痢疾、痈肿。据文献报道，山芝麻中含山芝麻酸及其甲酯、山芝麻宁酸及其甲酯、白桦脂酸、β-谷甾醇、齐墩果酸等三萜化合物和山芝麻内醇及山芝麻醌等香豆素类化合物。现有的药理学与植物化学的研究表明，其主要的有效部位为三萜类成分，具有明显的生物作用和药理活性。

众所周知，中成药的药效不是来自任何单一的活性成分，而是多种有效部位群共同作用的结果。目前，现有莲芝消炎胶囊质量标准中仅对山芝麻、穿心莲进行了薄层色谱鉴别及穿心莲总内酯含量进行控制，而对穿心莲的薄层鉴别中仅以脱水穿心莲内酯作为对照，对穿心莲总内酯含量测定仅采用滴定法。但这两项无法全面的表征莲芝消炎胶囊的质量，存在很大风险。

目前莲芝消炎胶囊质量相关研究文献中，尚无整体性有效控制其质量的检测方法，仅仅依靠薄层色谱法对莲芝消炎胶囊的部分药味进行薄层色谱检测，或对莲芝消炎胶囊中单味药材的某一种或多种成分采用高效液相色谱-紫外检测器法进行含量测定，片面的反映莲芝消炎胶囊的质量有严重的缺陷。例如，李楚源等(穿心莲药材或其制剂的检测方法，专利号CN201180074042)建立了一种穿心莲药材或其制剂的检测方法，包括采用高效液相色谱法建立穿心莲药材或其制剂的色谱图，以穿心莲内酯为内标，运用新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯苷元各自与所述穿心莲内酯的相对校正因子计算得出新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯苷元中一种以上成分的含量；林彤等(中成药.2010，32(12)：2096-2100)采用薄层色谱法分别对莲芝消炎胶囊中的山芝麻、穿心莲进行鉴别、采用HPLC法测定其中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量，但仅测定了莲芝消炎胶囊中穿心莲所含的2种成分的含量；刘佳等(中国药品标准.2016，17(3)：171-174)采用薄层色谱法对山芝麻中的β-谷甾醇进行了定性鉴别、采用高效液相色谱法测定了山芝麻中的齐墩果酸含量，但仅测定了莲芝消炎胶囊中山芝麻所含的1种成分的含量；苏丹等(时珍国医国药.2016，27(5)：1038-1040)建立了HPLC同时测定山芝麻药材的6个主要三萜类成分(山芝麻宁酸甲酯、山芝麻酸甲酯、山芝麻宁酸、山芝麻酸、白桦酯酸、齐墩果酸)含量的方法，但也仅测定了莲芝消炎胶囊中山芝麻所含的几种成分的含量。因此只能片面的反映莲芝消炎胶囊的质量，不但不能全面有效地衡量莲芝消炎胶囊质量的优劣，而且不能准确快速的判断莲芝消炎胶囊的真伪。

显然，检验效率高同时定性准确的检测方法，以满足中成药复杂的化学成分的质量可控的检测是非常必要的。已有特征图谱技术是一种可以应用于中药成分的综合的检测手段，是通过对共有特征峰的检测以达到对待检测样品的多种成分进行检测的目的。因此只有构建莲芝消炎胶囊的HPLC特征图谱才能较为全面的、准确快速的反映莲芝消炎胶囊中复杂的化学成分及其质量的优劣，比较全面的表征莲芝消炎胶囊成分，更加严格的控制莲芝消炎胶囊的质量。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的构建方法，根据所述方法构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱所包含的特征峰全面，定位准确，可有效鉴别该中成药的真伪，更加严格的控制莲芝消炎胶囊的质量。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：取莲芝消炎胶囊研细，向细粉中加入甲醇超声提取，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；

(2)对照品溶液制备：分别取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品，加入甲醇溶解，得到对照品溶液；

(3)阴性样品溶液制备：分别取穿心莲干浸膏、山芝麻干浸膏研细，向细粉中加入甲醇超声提取，摇匀，滤过，取续滤液，得到穿心莲阴性样品溶液和山芝麻阴性样品溶液；

(4)高效液相色谱检测，构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱。

优选地，所述步骤(1)中莲芝消炎胶囊细粉与甲醇的质量体积比为(0.1～2.0)g：(10～50)ml。

更优选地，所述步骤(1)中莲芝消炎胶囊细粉与甲醇的质量体积比为0.5g：20ml。

优选地，所述步骤(2)获得的对照品溶液中，穿心莲内酯浓度为0.1～4.0mg/ml，脱水穿心莲内酯浓度为0.1～4.0mg/ml。

更优选地，所述步骤(2)获得的对照品溶液中，穿心莲内酯浓度为0.44mg/ml，脱水穿心莲内酯浓度为0.53mg/ml。

优选地，所述步骤(3)中穿心莲干浸膏细粉与甲醇的质量体积比为(0.04～1.0)g：(10～50)ml；所述山芝麻干浸膏细粉与甲醇的质量体积比为(0.04～1.0)g：(10～50)ml。

更优选地，所述步骤(3)中穿心莲干浸膏细粉与甲醇的质量体积比为0.2g：20ml；所述山芝麻干浸膏细粉与甲醇的质量体积比为0.2g：20ml。

优选地，所述步骤(4)中色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.01％～0.2％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(3％～7％→18％～22％)，流动相中B(93％～97％→78％～82％)；5～15min，流动相中A(18％～22％→28％～32％)，流动相中B(78％～82％→68％～72％)；15～25min，流动相中A(28％～32％→33％～35％)，流动相中B(68％～72％→65％～67％)；25～30min，流动相中A(33％～35％→36％～38％)，流动相中B(65％～67％→62％～64％)；30～45min，流动相中A(36％～38％→38％～40％)，流动相中B(62％～64％→60％～62％)；

柱温：25～35℃；

流速：0.8～1.2ml/min；

检测波长：225nm；

理论板数：按穿心莲内酯峰计算不低于5000；

分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液各10～50μl，注入高效液相色谱仪，测定。

优选地，所述色谱条件为：流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(5％→20％)，流动相中B(95％→80％)；5～15min，流动相中A(20％→30％)，流动相中B(80％→70％)；15～25min，流动相中A(30％→34％)，流动相中B(70％→66％)；25～30min，流动相中A(34％→37％)，流动相中B(66％→63％)；30～45min，流动相中A(37％→39％)，流动相中B(63％→61％)。

优选地，所述柱温为30℃。

优选地，所述流速为1.0ml/min。

优选地，分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定。

优选地，所述步骤(4)中构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的方法为：(1)通过对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，对供试品溶液图谱中的共有特征峰进行指认，得到11个共有特征峰；(2)对10批莲芝消炎胶囊样品进行HPLC检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成由11个共有特征峰构成的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱。

所述莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱包括11个共有特征峰，其中，1～6号峰为未知成分峰，属于山芝麻；7～11号峰属于穿心莲，其中，7号峰为穿心莲内酯峰，11号峰为脱水穿心莲内酯峰，其他为未知成分峰；

以穿心莲内酯参照峰7号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.33±0.033；2号峰：0.40±0.040；3号峰：0.50±0.050；4号峰：0.70±0.070；5号峰：0.71±0.071；6号峰：0.80±0.080；7号峰：1.00±0.10；8号峰：1.07±0.107；9号峰：1.49±0.149；10号峰：1.76±0.176；11号峰：1.82±0.182。

本发明还提供了根据所述的构建方法构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱在莲芝消炎胶囊检测中的应用。

根据本发明构建方法构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱可用于检测莲芝消炎胶囊的质量和/或真伪。

本发明还提供了一种莲芝消炎胶囊检测方法，利用高效液相色谱法检测得到待测莲芝消炎胶囊HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件与莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。

优选地，所述的检测方法包括以下步骤：

1)取待测莲芝消炎胶囊，研细，向细粉中加入甲醇超声提取，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；利用高效液相色谱法检测得到待测莲芝消炎胶囊样品HPLC图谱，所述色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.01％～0.2％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(3％～7％→18％～22％)，流动相中B(93％～97％→78％～82％)；5～15min，流动相中A(18％～22％→28％～32％)，流动相中B(78％～82％→68％～72％)；15～25min，流动相中A(28％～32％→33％～35％)，流动相中B(68％～72％→65％～67％)；25～30min，流动相中A(33％～35％→36％～38％)，流动相中B(65％～67％→62％～64％)；30～45min，流动相中A(36％～38％→38％～40％)，流动相中B(62％～64％→60％～62％)；

柱温：25～35℃；

流速：0.8～1.2ml/min；

检测波长：225nm；

理论板数：按穿心莲内酯峰计算不低于5000；

精密吸取待测莲芝消炎胶囊样品制备得到的供试品溶液10～50μl，注入高效液相色谱仪，测定；

2)将步骤1)获得的待测莲芝消炎胶囊HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件与莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品；

所述莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱包括11个共有特征峰，其中，1～6号峰为未知成分峰，属于山芝麻；7～11号峰属于穿心莲，其中，7号峰为穿心莲内酯峰，11号峰为脱水穿心莲内酯峰，其他为未知成分峰；

以穿心莲内酯参照峰7号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.33±0.033；2号峰：0.40±0.040；3号峰：0.50±0.050；4号峰：0.70±0.070；5号峰：0.71±0.071；6号峰：0.80±0.080；7号峰：1.00±0.10；8号峰：1.07±0.107；9号峰：1.49±0.149；10号峰：1.76±0.176；11号峰：1.82±0.182；

3)根据步骤2)的比对结果判定待测莲芝消炎胶囊样品的质量和/或真伪。

优选地，所述步骤1)中待测莲芝消炎胶囊细粉与甲醇的质量体积比为(0.1～2.0)g：(10～50)ml。

更优选地，所述步骤1)中待测莲芝消炎胶囊细粉与甲醇的质量体积比为0.5g：20ml。

优选地，所述步骤1)中色谱条件为：流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(5％→20％)，流动相中B(95％→80％)；5～15min，流动相中A(20％→30％)，流动相中B(80％→70％)；15～25min，流动相中A(30％→34％)，流动相中B(70％→66％)；25～30min，流动相中A(34％→37％)，流动相中B(66％→63％)；30～45min，流动相中A(37％→39％)，流动相中B(63％→61％)。

优选地，所述步骤1)中柱温为30℃。

优选地，所述步骤1)中流速为1.0ml/min。

优选地，所述步骤1)中精密吸取待测莲芝消炎胶囊样品制备得到的供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定。

所述步骤3)中判定标准为：将步骤1)获得的待测莲芝消炎胶囊HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件与莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明首次构建了莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱，根据本发明方法构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱所包含的特征峰全面，定位准确，可有效鉴别莲芝消炎胶囊的真伪，为评价其质量的优劣提供了快速标准检测方法，有望成为莲芝消炎胶囊中成药质量控制的标准方法；(2)本发明采用高效液相色谱法，在同一色谱条件下同时检测莲芝消炎胶囊中的两味药材成分，对有效成分既能定性又能定量，这种方法是现有技术中所没有的，用视觉直观辨识图谱的异同，用半定量指标量化样品的真伪、优劣，具有方便、快捷、稳定、精密度高、重现性好等特点，可准确可靠的控制莲芝消炎胶囊的质量；(3)本发明克服了单一成分含量测定难以反映产品真实投料情况，为完整、准确评价莲芝消炎胶囊的质量提供了新的方法和手段，并获得药材与成品之间的相关性，避免了莲芝消炎胶囊质量控制的单一性和片面性；(4)本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高、重现性好等特点，可准确可靠的检测和控制莲芝消炎胶囊的质量。

附图说明

图1为本发明对照品溶液HPLC图谱。

图2为本发明山芝麻阴性样品HPLC图谱。

图3为本发明穿心莲阴性样品HPLC图谱。

图4为本发明莲芝消炎胶囊HPLC图谱。

图5为本发明10批次莲芝消炎胶囊的HPLC图谱叠加图。

图6为本发明构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例中检测仪器为Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪及其Chromeleon 7工作站；穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品由中国食品药品检定研究院提供；乙腈为色谱纯；莲芝消炎胶囊、穿心莲干浸膏、山芝麻干浸膏由广州白云山光华制药有限公司提供。

实施例1

1、本发明莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的构建方法的一种实施例，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：精密称取细粉0.5g，置20ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液制备：精密称取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品，加甲醇制成每1ml含穿心莲内酯0.44mg、脱水穿心莲内酯0.53mg的溶液，作为对照品溶液；

(3)阴性样品溶液制备：分别取穿心莲干浸膏、山芝麻干浸膏研细，精密称取细粉0.2g，置20ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为穿心莲阴性样品溶液和山芝麻阴性样品溶液；

(4)高效液相色谱检测，构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱：

色谱条件：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(5％→20％)，流动相中B(95％→80％)；5～15min，流动相中A(20％→30％)，流动相中B(80％→70％)；15～25min，流动相中A(30％→34％)，流动相中B(70％→66％)；25～30min，流动相中A(34％→37％)，流动相中B(66％→63％)；30～45min，流动相中A(37％→39％)，流动相中B(63％→61％)；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：225nm；

理论板数：按穿心莲内酯峰计算不低于5000；

分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定。

2、莲芝消炎胶囊HPLC图谱特征峰确定

通过对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，对供试品溶液图谱中的共有特征峰进行指认，得出供试品溶液图谱中的共有特征峰(如图1-4所示)。

特征峰确定：本实施例得到的莲芝消炎胶囊HPLC图谱包括11个共有特征峰，其中，1～6号峰为未知成分峰，属于山芝麻；7～11号峰属于穿心莲，其中，7号峰为穿心莲内酯峰，11号峰为脱水穿心莲内酯峰，其他为未知成分峰。

特征峰的描述：以穿心莲内酯参照峰7号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.33±0.033；2号峰：0.40±0.040；3号峰：0.50±0.050；4号峰：0.70±0.070；5号峰：0.71±0.071；6号峰：0.80±0.080；7号峰：1.00±0.10；8号峰：1.07±0.107；9号峰：1.49±0.149；10号峰：1.76±0.176；11号峰：1.82±0.182。

3、构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱

取莲芝消炎胶囊10批，按本实施例的上述条件，得到10批莲芝消炎胶囊样品的HPLC图谱(如图5所示)，以穿心莲内酯参照峰7号峰为参照峰，其相对保留时间为1.00，计算10批样品共有特征峰相对保留时间，结果见下表1。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对10批图谱进行比较，确定共有特征峰，生成由11个共有特征峰构成的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱(如图6所示)。

表1 10批供试品共有特征峰相对保留时间

相似度分析：计算10批供试品HPLC图谱与生成的HPLC特征图谱的相似度，结果均大于0.90。相似度比较结果见表2。

表2 10批供试品HPLC图谱相似度评价结果

样品批号	T50011	T50012	T50013	T60019	T60020
						相似度	0.976	0.961	0.982	0.931	0.945
样品批号	T60021	T70033	T70034	T70035	T70036
						相似度	0.977	0.964	0.987	0.991	0.969

实施例2

1、本发明莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的构建方法的一种实施例，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：精密称取细粉0.1g，置50ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液制备：精密称取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品，加甲醇制成每1ml含穿心莲内酯0.1mg、脱水穿心莲内酯0.1mg的溶液，作为对照品溶液；

(3)阴性样品溶液制备：分别取穿心莲干浸膏、山芝麻干浸膏研细，精密称取细粉0.04g，置20ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为穿心莲阴性样品溶液和山芝麻阴性样品溶液；

(4)高效液相色谱检测，构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱：

色谱条件：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.01％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(7％→22％)，流动相中B(93％→78％)；5～15min，流动相中A(22％→32％)，流动相中B(78％→68％)；15～25min，流动相中A(32％→35％)，流动相中B(68％→65％)；25～30min，流动相中A(35％→38％)，流动相中B(65％→62％)；30～45min，流动相中A(38％→40％)，流动相中B(62％→60％)；

柱温：25℃；

流速：0.8ml/min；

检测波长：225nm；

理论板数：按穿心莲内酯峰计算不低于5000；

分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液各30μl，注入高效液相色谱仪，测定。

2、莲芝消炎胶囊HPLC图谱特征峰确定

通过对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，对供试品溶液图谱中的共有特征峰进行指认，得出供试品溶液图谱中的共有特征峰。

3、构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱

取10批莲芝消炎胶囊，按本实施例的上述条件，得到10批莲芝消炎胶囊样品的HPLC图谱。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对10批图谱进行比较，确定共有特征峰，生成由11个共有特征峰构成的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱。

本实施例构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱同实施例1。

实施例3

1、本发明莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的构建方法的一种实施例，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：精密称取细粉2g，置10ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液制备：精密称取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品，加甲醇制成每1ml含穿心莲内酯4.0mg、脱水穿心莲内酯4.0mg的溶液，作为对照品溶液；

(3)阴性样品溶液制备：分别取穿心莲干浸膏、山芝麻干浸膏研细，精密称取细粉1.0g，置10ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为穿心莲阴性样品溶液和山芝麻阴性样品溶液；

(4)高效液相色谱检测，构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱：

色谱条件：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(3％→18％)，流动相中B(97％→82％)；5～15min，流动相中A(18％→28％)，流动相中B(82％→72％)；15～25min，流动相中A(28％→33％)，流动相中B(72％→67％)；25～30min，流动相中A(33％→36％)，流动相中B(67％→64％)；30～45min，流动相中A(36％→38％)，流动相中B(64％→62％)；

柱温：35℃；

流速：1.2ml/min；

检测波长：225nm；

理论板数：按穿心莲内酯峰计算不低于5000；

分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液各50μl，注入高效液相色谱仪，测定。

2、莲芝消炎胶囊HPLC图谱特征峰确定

通过对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，对供试品溶液图谱中的共有特征峰进行指认，得出供试品溶液图谱中的共有特征峰。

3、构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱

取10批莲芝消炎胶囊，按本实施例的上述条件，得到10批莲芝消炎胶囊样品的HPLC图谱。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对10批图谱进行比较，确定共有特征峰，生成由11个共有特征峰构成的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱。

本实施例构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱同实施例1。

实施例4

本实施例研究本发明莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱构建方法的精密度、稳定性和重复性。

1、精密度试验

按照特征图谱精密度规定方法操作，以批号为T70036的莲芝消炎胶囊为供试品，依实施例1所述方法，连续进样6次，分别对共有特征峰时间进行统计。结果显示，共有峰相对保留时间的RSD为0.9％，说明本发明莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱构建方法精密度好。

2、稳定性试验

按照特征图谱稳定性测定方法操作，以批号为T70036的莲芝消炎胶囊为供试品，依实施例1所述方法，于不同时间(0、2、4、8、16、24h)检测，分别对特征峰时间进行统计。结果显示特征峰相对保留时间的RSD为0.8％，说明本发明莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱构建方法稳定性好。

3、重复性试验

按照特征图谱重复性规定方法操作，以批号为T70036的莲芝消炎胶囊为供试品，依照实施例1所述方法制备6份样品，进样检测，分别对共有特征峰时间进行统计。结果显示共有峰相对保留时间的RSD为1.4％，说明本发明莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱构建方法重复性好。

以上试验结果表明，本发明构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的方法可靠，具有很好的精密度、稳定性和重复性，构建得到的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱能比较全面的反映莲芝消炎胶囊中的信息，确保产品投料的准确性与正确性。

实施例5

本发明莲芝消炎胶囊检测方法的一种实施例，包括以下步骤：

1)采用与实施例1相同的高效液相色谱检测方法检测得到待测莲芝消炎胶囊样品HPLC图谱；

2)将步骤1)获得的待测莲芝消炎胶囊HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件与实施例1构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。

3)根据步骤2)的比对结果判定待测莲芝消炎胶囊样品的质量和真伪。

实施例6

本发明莲芝消炎胶囊检测方法的一种实施例，包括以下步骤：

1)采用与实施例2相同的高效液相色谱检测方法检测得到待测莲芝消炎胶囊样品HPLC图谱；

2)将步骤1)获得的待测莲芝消炎胶囊HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件与实施例1构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品；

3)根据步骤2)的比对结果判定待测莲芝消炎胶囊样品的质量和真伪。

实施例7

本发明莲芝消炎胶囊检测方法的一种实施例，包括以下步骤：

1)采用与实施例3相同的高效液相色谱检测方法检测得到待测莲芝消炎胶囊样品HPLC图谱；

2)将步骤1)获得的待测莲芝消炎胶囊HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件与实施例1构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品；

3)根据步骤2)的比对结果判定待测莲芝消炎胶囊样品的质量和真伪。

实施例8

本实施例以实施例5中检测方法为例，研究本发明莲芝消炎胶囊检测方法鉴定莲芝消炎胶囊质量的效果和检测效率。

取20批莲芝消炎胶囊(由A、B、C、D四个不同厂家生产)，按实施例5的的检测方法进行测定，得到20批次样品的HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价对样品HPLC图谱与HPLC特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品，并和现有检测方法进行对比。所述现有检测方法为：鉴别1)取本品2粒，倾出内容物，用60％乙醇10ml溶解，滤过，滤液置水浴上挥干，残渣加水10ml使溶解，加入醋酸乙酯5ml，振摇提取，分取醋酸乙酯液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取山芝麻对照药材，用60％乙醇加热回流，滤过，回收乙醇，浓缩至稠膏，干燥，取0.3g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各3μl，分别点子同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝色荧光斑点。鉴别2)取本品1粒，倾出内容物，加乙醇10ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取脱水穿心莲内酯对照品，加乙醇制成每1ml含3mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-无水乙醇(14∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视后，用新配制的二硝基苯甲酸试液与5％氢氧化钾溶液等体积混合液喷雾，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。

检测结果为按现有检测方法20批次产品均为合格品，而按本发明检测方法检测A、B、C、D四个厂家16批次产品为合格品，C、D厂家各2批次产品为不合格品，结果见表3。

表3现有检测方法及本发明检测方法对20份莲芝消炎胶囊样品的质量鉴定

结果

根据上述检测结果可知，本发明检测方法能有效鉴别莲芝消炎胶囊的质量，所构建的方法稳定性好，精密度高，重复性好，而现有检测方法由于标准不全面，不能全面反应莲芝消炎胶囊的质量，很容易造成误检，将不合格莲芝消炎胶囊产品鉴定为合格产品。此外，现有检测方法一天最多只能检出4批左右样品，完成上述20份样品的检测需要5天左右的时间，而本发明检测方法一天可以检出30批左右样品，一天之内即可完成上述20份样品的检测，具有很高的检测效率，且操作简便。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：取莲芝消炎胶囊研细，向细粉中加入甲醇超声提取，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；

(2)对照品溶液制备：取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品，加入甲醇溶解，得到对照品溶液；

(3)阴性样品溶液制备：分别取穿心莲干浸膏、山芝麻干浸膏研细，向细粉中加入甲醇超声提取，摇匀，滤过，取续滤液，得到穿心莲阴性样品溶液和山芝麻阴性样品溶液；

(4)高效液相色谱检测，构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱；

所述步骤(4)中色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱；流动相：以乙腈为流动相A，以0.01％～0.2％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(3％～7％→18％～22％)，流动相中B(93％～97％→78％～82％)；5～15min，流动相中A(18％～22％→28％～32％)，流动相中B(78％～82％→68％～72％)；15～25min，流动相中A(28％～32％→33％～35％)，流动相中B(68％～72％→65％～67％)；25～30min，流动相中A(33％～35％→36％～38％)，流动相中B(65％～67％→62％～64％)；30～45min，流动相中A(36％～38％→38％～40％)，流动相中B(62％～64％→60％～62％)；柱温：25～35℃；流速：0.8～1.2ml/min；检测波长：225nm；理论板数：按穿心莲内酯峰计算不低于5000；分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液各10～50μl，注入高效液相色谱仪，测定；

所述步骤(1)中莲芝消炎胶囊细粉与甲醇的质量体积比为(0.1～2.0)g：(10～50)ml；

所述步骤(2)获得的对照品溶液中，穿心莲内酯浓度为0.1mg/ml～4.0mg/ml，脱水穿心莲内酯浓度为0.1mg/ml～4.0mg/ml；

所述步骤(3)中穿心莲干浸膏细粉与甲醇的质量体积比为(0.04～1.0)g：(10～20)ml；所述山芝麻干浸膏细粉与甲醇的质量体积比为(0.04～1.0)g：(10～20)ml。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中构建莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱的方法为：(1)通过对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，对供试品溶液图谱中的共有特征峰进行指认，得到11个共有特征峰；(2)对10批莲芝消炎胶囊样品进行HPLC检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成由11个共有特征峰构成的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱包括11个共有特征峰，其中，1～6号峰为未知成分峰，属于山芝麻；7～11号峰属于穿心莲，其中，7号峰为穿心莲内酯峰，11号峰为脱水穿心莲内酯峰，其他为未知成分峰；以穿心莲内酯参照峰7号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.33±0.033；2号峰：0.40±0.040；3号峰：0.50±0.050；4号峰：0.70±0.070；5号峰：0.71±0.071；6号峰：0.80±0.080；7号峰：1.00±0.10；8号峰：1.07±0.107；9号峰：1.49±0.149；10号峰：1.76±0.176；11号峰：1.82±0.182。

4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法构建的莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱在莲芝消炎胶囊检测中的应用。

5.一种莲芝消炎胶囊检测方法，其特征在于，利用高效液相色谱法检测得到待测莲芝消炎胶囊HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件与莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品；包括以下步骤：1)取待测莲芝消炎胶囊样品，研细，向细粉中加入甲醇超声提取，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；利用高效液相色谱法检测得到待测莲芝消炎胶囊HPLC图谱，所述色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱；流动相：以乙腈为流动相A，以0.01％～0.2％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(3％～7％→18％～22％)，流动相中B(93％～97％→78％～82％)；5～15min，流动相中A(18％～22％→28％～32％)，流动相中B(78％～82％→68％～72％)；15～25min，流动相中A(28％～32％→33％～35％)，流动相中B(68％～72％→65％～67％)；25～30min，流动相中A(33％～35％→36％～38％)，流动相中B(65％～67％→62％～64％)；30～45min，流动相中A(36％～38％→38％～40％)，流动相中B(62％～64％→60％～62％)；柱温：25～35℃；流速：0.8～1.2ml/min；检测波长：225nm；理论板数：按穿心莲内酯峰计算不低于5000；精密吸取待测莲芝消炎胶囊样品制备得到的供试品溶液10～50μl，注入高效液相色谱仪，测定；2)将步骤1)获得的待测莲芝消炎胶囊HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件与莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品；所述莲芝消炎胶囊HPLC特征图谱包括11个共有特征峰，其中，1～6号峰为未知成分峰，属于山芝麻；7～11号峰属于穿心莲，其中，7号峰为穿心莲内酯峰，11号峰为脱水穿心莲内酯峰，其他为未知成分峰；以穿心莲内酯参照峰7号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.33±0.033；2号峰：0.40±0.040；3号峰：0.50±0.050；4号峰：0.70±0.070；5号峰：0.71±0.071；6号峰：0.80±0.080；7号峰：1.00±0.10；8号峰：1.07±0.107；9号峰：1.49±0.149；10号峰：1.76±0.176；11号峰：1.82±0.182；3)根据步骤2)的比对结果判定待测莲芝消炎胶囊样品的质量和/或真伪。

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