CN112326822B - 华佗再造丸hplc特征图谱及其构建方法和应用 - Google Patents

华佗再造丸hplc特征图谱及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种华佗再造丸HPLC特征图谱及其构建方法和应用。所述HPLC特征图谱包括12个特征峰，以7号峰槲皮素峰为参照峰。将待测华佗再造丸的HPLC特征图谱与上述华佗再造丸的HPLC特征图谱进行比较，可以从整体上更好地控制华佗再造丸的质量，为华佗再造丸的生产和临床应用提供了有效保障。

Description

华佗再造丸HPLC特征图谱及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种华佗再造丸HPLC特征图谱及其构建方法和应用。
背景技术
中药特征图谱是指某种或某几种中药材中所共有的、具有特征性的某类成分的色谱或光谱的图谱。目前，特征图谱是国际公认的可以控制中药质量有效成分的方法，是当前中药界关注的热点问题。近年来，人们逐步认识到，只针对某一化学成分而形成的质量控制方法，已经不能恰当的反应中药的内在质量，中药特征图谱作为一种多指标的质量控制模式，能够更好的控制产品内在质量，提升产品的真实性与有效性。
目前，对华佗再造丸的质量控制，主要是通过药材的薄层鉴别、成分的含量测定以及GC特征图谱进行控制，其中，药材的薄层鉴别、成分的含量测定无法全面反应产品的质量状况，中药GC特征图谱则侧重于反映脂溶性类成分，而 HPLC特征图谱侧重于反映水溶性类成分。因此上述方法虽能在一定程度上检测产品质量，但仍缺乏对水溶性类成分的全面反映。
发明内容
基于此，有必要针对现有技术无法全面反映华佗再造丸水溶性类成分质量状况的问题，提供一种华佗再造丸HPLC特征图谱。
具体技术方案如下：
一种华佗再造丸HPLC特征图谱，所述HPLC特征图谱包括12个特征峰，以7号峰槲皮素峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：
1号峰：相对保留时间为0.108±0.0054；
2号峰：相对保留时间为0.183±0.0091；
3号峰：相对保留时间为0.289±0.0144；
4号峰：相对保留时间为0.525±0.0262；
5号峰：相对保留时间为0.543±0.0271；
6号峰：相对保留时间为0.711±0.0355；
7号峰：相对保留时间为1.000±0.0500；
8号峰：相对保留时间为1.088±0.0544；
9号峰：相对保留时间为1.128±0.0564；
10号峰：相对保留时间为1.294±0.0647；
11号峰：相对保留时间为1.343±0.0671；
12号峰：相对保留时间为1.635±0.0817。
本发明还提供一种所述的华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤a、取槲皮素对照品，用50％v/v～100％v/v甲醇水溶液制成每mL含槲皮素对照品100μg的溶液，作为对照品溶液；
步骤b、取华佗再造丸粉末，用50％v/v～100％v/v甲醇水溶液配成所述华佗再造丸粉末浓度为62.5～250mg/mL的溶液，过滤，取续滤液作为供试品溶液；
步骤c、用高效液相色谱法测定所述对照品溶液和所述供试品溶液，色谱条件为：采用C18色谱柱，流动相采用A相与B相的混合溶液进行梯度洗脱，检测波长为254nm，柱温为25℃～35℃，流速为0.9～1.1mL/min，进样量为5～20μL，理论塔板数按槲皮素峰计算≥20000，其中，所述A相为乙腈，所述B相为0.1wt％～0.3wt％乙酸水溶液，所述混合溶液中所述A相的体积百分比为 5％～78％。
在其中一个实施例中，所述步骤c中所述梯度洗脱的时间及流动相体积比例为：
0～45min，A相：5％～19％、B相：95％～81％；
45～140min，A相：19％～78％、B相：81％～22％。
在其中一个实施例中，所述步骤c中所述C18色谱柱的内径为4.6mm，柱长为250mm，填料粒度为5μm。
在其中一个实施例中，所述步骤c中所述柱温为30℃。
在其中一个实施例中，所述步骤c中所述流速为1.0mL/min。
在其中一个实施例中，所述步骤c中所述进样量为20μL。
在其中一个实施例中，所述步骤b中所述溶液的浓度为250mg/mL。
本发明还提供所述的华佗再造丸HPLC特征图谱在华佗再造丸检测中的应用。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明采用高效液相色谱法对华佗再造丸的多种水溶性指标性成分进行测定，建立了华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，按此方法可以构建出华佗再造丸标准特征图谱，并可以用此方法对待测华佗再造丸的HPLC特征图谱进行构建。将待测华佗再造丸的HPLC特征图谱与上述华佗再造丸的HPLC特征图谱进行比较，可以从整体上更好地控制华佗再造丸的质量，为华佗再造丸的生产和临床应用提供了有效保障。
附图说明
图1为10批华佗再造丸的HPLC图谱；
图2为华佗再造丸的HPLC特征对照图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例提供了一种华佗再造丸HPLC特征图谱，所述HPLC特征图谱包括12个特征峰，以7号峰槲皮素峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：
1号峰：相对保留时间为0.108±0.0054；
2号峰：相对保留时间为0.183±0.0091；
3号峰：相对保留时间为0.289±0.0144；
4号峰：相对保留时间为0.525±0.0262；
5号峰：相对保留时间为0.543±0.0271；
6号峰：相对保留时间为0.711±0.0355；
7号峰：相对保留时间为1.000±0.0500；
8号峰：相对保留时间为1.088±0.0544；
9号峰：相对保留时间为1.128±0.0564；
10号峰：相对保留时间为1.294±0.0647；
11号峰：相对保留时间为1.343±0.0671；
12号峰：相对保留时间为1.635±0.0817。
该特征图谱可以从整体上更好地控制华佗再造丸的质量，为华佗再造丸的生产和临床应用提供了有效保障。
本发明实施例还提供了一种上述华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
步骤a、取槲皮素对照品，用50％v/v～100％v/v甲醇水溶液制成每mL含槲皮素对照品100μg的溶液，作为对照品溶液；
步骤b、取华佗再造丸粉末，用50％v/v～100％v/v甲醇水溶液配成所述华佗再造丸粉末浓度为62.5～250mg/mL的溶液，过滤，取续滤液作为供试品溶液；
步骤c、用高效液相色谱法测定所述对照品溶液和所述供试品溶液，色谱条件为：采用C18色谱柱，流动相采用A相与B相的混合溶液进行梯度洗脱，检测波长为254nm，柱温为25℃～35℃，流速为0.9～1.1mL/min，进样量为5～ 20μL，理论塔板数按槲皮素峰计算≥20000，其中，所述A相为乙腈，所述B相为0.1wt％～0.3wt％乙酸水溶液，所述混合溶液中所述A相的体积百分比为 5℃～78％。
本发明采用高效液相色谱法对华佗再造丸的多种水溶性指标性成分进行测定，建立了华佗再造丸特征图谱的构建方法，按此方法可以构建出华佗再造丸标准特征图谱，并可以用此方法对待华佗再造丸的HPLC特征图谱进行构建。
具体地，上述步骤b中，所述溶液的浓度为250mg/mL，该浓度溶液中槲皮素的含量更接近对照品溶液中的含量，所得色谱峰面积更接近对照品溶液所得峰面积，从而使对比结果更准确。
上述步骤c中，所述C18色谱柱内径为4.6mm，柱长为250mm，填料粒度为5μm，优选的柱内径、柱长、填料粒径与流速相配合，可以避免管壁效应。
进一步优选的，所述梯度洗脱的时间及流动相体积比例为：0～45min，A 相：5％～19％、B相：95％～81％；45～140min，A相：19％～78％、B相： 81％～22％。由于待测溶液中成分复杂，用单一流动相可能无法良好分离各组分，使用优选的洗脱时间及流动相比例，可以使待测溶液中性质差异较大的组分根据各自的性质、按各自适宜的容量因子k实现良好的分离。
进一步优选的，所述柱温为30℃。柱温过高会使各组分的分配系数K值变小，分离度减小，柱温过低降低传质速率，柱效能下降，而且会延长分析时间。
进一步优选的，所述流速为1.0mL/min，在该流速下，待测溶液的保留时间和分离效果更为理想。
进一步优选的，所述进样量为20μL，该进样量可以使峰面积大小适中，测量结果更为准确。
以及，本发明实施例还提供了上述华佗再造丸HPLC特征图谱在华佗再造丸检测中的应用。
将待测华佗再造丸的HPLC特征图谱与上述华佗再造丸的HPLC特征图谱进行比较，可以从整体上更好地控制华佗再造丸的质量，为华佗再造丸的生产和临床应用提供了有效保障。
以下为具体的实施例，如无特别说明，实施例中采用的试剂均为市售产品，华佗再造丸为广州白云山奇星药业有限公司生产产品。
实施例1
本实施例提供了一种华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，具体步骤如下：
步骤a、取槲皮素对照品，用50％v/v甲醇水溶液制成每mL含槲皮素对照品100μg的溶液，作为对照品溶液；
步骤b、取华佗再造丸适量，研碎，取约0.625g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％v/v甲醇水溶液50mL，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次(30mL、 30mL、25mL)，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加50％v/v甲醇水溶液溶解，转移至10mL量瓶中，加50％v/v甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
步骤c、用高效液相色谱法测定对照品溶液和供试品溶液，色谱条件为：采用ZOBAXEclipse XDB C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相由A相和B 相组成，A相为乙腈，B相为0.05wt％乙酸水溶液，进行梯度洗脱，0～45min， A相：5％～19％、B相：95％～81％；45～140min，A相：19％～78％、B相： 81％～22％；检测波长为254nm；柱温为25℃，流速为0.8mL/min，进样量为5 μL，理论塔板数按槲皮素峰计算为21000。
实施例2
本实施例提供了一种华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，具体步骤如下：
步骤a、取槲皮素对照品，用75％v/v甲醇水溶液制成每mL含槲皮素对照品100μg的溶液，作为对照品溶液；
步骤b、取华佗再造丸适量，研碎，取约1.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％v/v甲醇水溶液50mL，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次(30mL、 30mL、25mL)，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加75％v/v甲醇水溶液溶解，转移至10ml量瓶中，加75％v/v甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
步骤c、用高效液相色谱法测定对照品溶液和供试品溶液，色谱条件为：采用AKZONOBEL Kromasil C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相由A相和 B相组成，A相为乙腈，B相为0.1wt％乙酸水溶液，进行梯度洗脱，0～45min， A相：5％～19％、B相：95％～81％；45～140min，A相：19％～78％、B相： 81％～22％；检测波长为254nm；柱温为35℃，流速为0.9mL/min，进样量为 10μL，理论塔板数按胡椒碱峰计算为22000。
实施例3
本实施例提供了一种华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，具体步骤如下：
步骤a、取槲皮素对照品，用甲醇制成每mL含槲皮素对照品100μg的溶液，作为对照品溶液；
步骤b、取华佗再造丸适量，研碎，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL 使溶解，置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次(30mL、30mL、25mL)，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
步骤c、用高效液相色谱法测定对照品溶液和供试品溶液，色谱条件为：采用Symmetry Shield C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相由A相和B相组成，A相为乙腈，B相为0.2wt％乙酸水溶液，进行梯度洗脱，0～45min，A相： 5％～19％、B相：95％～81％；45～140min，A相：19％～78％、B相：81％～ 22％；检测波长为254nm；柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，理论塔板数按胡椒碱峰计算为20050。
实施例4
本实施例提供了一种华佗再造丸HPLC特征图谱，具体如下：
采用实施例3所述华佗再造丸特征图谱的构建方法建立10批次华佗再造丸 HPLC特征图谱，如图1所示，相似度结果如表1所示。
表1相似度结果
分析结果(参考模板文件名为：SIGNAL01.cdf)
Figure BDA0002745752430000091
对10批供试品特征图谱的检测结果进行了分析、比较，选择批号为1155 的供试品的特征图谱作为对照图谱(图2)。因为该供试品相对保留时间较接近于 10批供试品的平均相对保留时间，且与相似度软件产生的对照图谱最为接近，分离度较好。结果见表2。
表2 10批华佗再造丸样品测定结果
Figure BDA0002745752430000092
Figure BDA0002745752430000101
实施例5
本实施例提供了上述华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法的方法学考察：
(1)精密度考察：取同一份供试品溶液，在实施例3所述华佗再造丸特征图谱的构建方法中的色谱条件下，重复进样6次，每次进样20μL，考察共有峰的相对保留时间的一致性，结果如表3所示，共有峰相对保留时间的RSD均小于 5％，相似度结果如表4所示，表明该方法精密度好。
表3各共有峰相对保留时间
Figure BDA0002745752430000102
Figure BDA0002745752430000111
表4相似度结果
分析结果(参考模板文件名为：SIGNAL01.cdf)
Figure BDA0002745752430000112
(2)重复性考察：取同一批样品，按实施例3所述华佗再造丸特征图谱的构建方法中的供试品制备方法制备6份供试品溶液，在实施例3所述华佗再造丸特征图谱的构建方法中的色谱条件下进行重复性考察，考察各色谱峰相对保留时间的一致性，结果如表5所示，共有峰相对保留时间的RSD均小于5％，相似度结果如表6所示，表明方法重复性良好。
表5各共有峰相对保留时间
Figure BDA0002745752430000113
Figure BDA0002745752430000121
表6相似度结果
分析结果(参考模板文件名为：SIGNAL01.cdf)
Figure BDA0002745752430000122
(3)稳定性考察：取同一供试品溶液，在实施例3所述华佗再造丸特征图谱的构建方法中的色谱条件下，分别在0，5，10，15，20，22.5，25，27.5小时进行检测，每次进样20μL，考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果如表7所示，共有峰相对保留时间的RSD均小于5％，相似度如表8所示，表明供试品溶液24小时内稳定。
表7各共有峰相对保留时间
Figure BDA0002745752430000123
Figure BDA0002745752430000131
表8相似度结果
分析结果(参考模板文件名为：SIGNAL01.cdf)
Figure BDA0002745752430000132
综合如上实施例可知，本发明所提供的华佗再造丸特征图谱的构建方法检测方法简单、易操作，特征性成分相应色谱峰保留完整，溶液稳定性良好，且该方法精密度高、重现性良好，具有一定的专属性，所得特征图谱中各色谱峰之间分离效果良好。用本发明实施例所提供的华佗再造丸特征图谱的构建方法所构建的华佗再造丸HPLC特征图谱能有效的表征其质量，有利于全面监控产品质量。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、取槲皮素对照品，用50％v/v～100％v/v甲醇水溶液制成每mL含槲皮素对照品100μg的溶液，作为对照品溶液；
步骤b、取华佗再造丸粉末，用50％v/v～100％v/v甲醇水溶液配成所述华佗再造丸粉末浓度为62.5～250mg/mL的溶液，过滤，取续滤液作为供试品溶液；
步骤c、用高效液相色谱法测定所述对照品溶液和所述供试品溶液，色谱条件为：采用C18色谱柱，流动相采用A相与B相的混合溶液进行梯度洗脱，检测波长为254nm，柱温为25℃～35℃，流速为0.9～1.1mL/min，进样量为5～20μL，理论塔板数按槲皮素峰计算≥20000，其中，所述A相为乙腈，所述B相为0.1wt％～0.3wt％乙酸水溶液；
所述步骤c中所述梯度洗脱的时间及流动相体积比例为：
0～45min，A相：5％～19％、B相：95％～81％；
45～140min，A相：19％～78％、B相：81％～22％；
所述HPLC特征图谱包括12个特征峰，以7号峰槲皮素峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：
1号峰：相对保留时间为0.108±0.0054；
2号峰：相对保留时间为0.183±0.0091；
3号峰：相对保留时间为0.289±0.0144；
4号峰：相对保留时间为0.525±0.0262；
5号峰：相对保留时间为0.543±0.0271；
6号峰：相对保留时间为0.711±0.0355；
7号峰：相对保留时间为1.000±0.0500；
8号峰：相对保留时间为1.088±0.0544；
9号峰：相对保留时间为1.128±0.0564；
10号峰：相对保留时间为1.294±0.0647；
11号峰：相对保留时间为1.343±0.0671；
12号峰：相对保留时间为1.635±0.0817。
2.根据权利要求1所述的华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤c中所述C18色谱柱的内径为4.6mm，柱长为250mm，填料粒度为5μm。
3.根据权利要求1所述的华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤c中所述柱温为30℃。
4.根据权利要求1所述的华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤c中所述流速为1.0mL/min。
5.根据权利要求1所述的华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤c中所述进样量为20μL。
6.根据权利要求1所述的华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤b中所述华佗再造丸粉末溶液的浓度为250mg/mL。
7.根据权利要求1所述的华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述B相为0.2wt％乙酸水溶液。
8.根据权利要求1所述的华佗再造丸HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤b中所述甲醇水溶液的浓度为100％v/v。
9.权利要求1所述的构建方法构建获得的华佗再造丸HPLC特征图谱在华佗再造丸检测中的应用。
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