CN107782814B - 一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法 - Google Patents

一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立双鱼颗粒定量指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适应性试验：色谱柱C18，以乙腈为流动相A，以体积浓度0.05%三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0~50min，5%A~70%A；流速每分钟为0.7~0.9 ml；检测波长为230 nm和327 nm；柱温25~35℃。本发明方法能够反映双鱼颗粒的主要成分含量的变化情况，用于更好地评价和控制双鱼颗粒的质量。

Description

一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法
技术领域
本发明涉及中药制剂的质量控制方法，特别是一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法。
背景技术
双鱼颗粒由鱼腥草、金银花、赤芍、艾叶、薄荷5味药制成，具有辛凉解表，清热解毒的功效，主要用于外感风热型普通感冒，症见发热头痛，全身酸痛，鼻塞，流涕，咳嗽，咳痰，咽喉发痒，口干而渴，咽喉红肿疼痛，舌红，脉数等症。
中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义，它在一定程度上反映了中药的化学物质基础。同时，结合多指标成分定量分析，已经成为当前中药质量控制的手段之一。
现有技术中尚无有关双鱼颗粒的质量控制方法的明确报道，因此，为了保证其质量和疗效，提供一种双鱼颗粒的质量控制方法更好地对其质量进行控制具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，该方法能够反映双鱼颗粒的主要成分含量的变化情况，用于更好地评价和控制双鱼颗粒的质量。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的。本发明是一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其特点是，该方法采用以下方法建立双鱼颗粒定量指纹图谱：采用高效液相色谱法，
色谱条件与系统适应性试验：色谱柱C18，以乙腈为流动相A，以体积浓度0.05％三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～50min，5％A～70％A；流速每分钟为0.7～0.9ml；检测波长为230nm和327nm；柱温25～35℃。
本发明所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法中：优选以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Kromasil C18，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm。优选流速每分钟为0.8ml；优选柱温30℃。
本发明所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案是，所述的梯度洗脱程序如下：
时间min 乙腈％ 0.05％三氟乙酸％
0～10 5→10 95→90
10～15 10→15 90→85
15～25 15→25 85→75
25～34 25→34 75→66
34～45 34→70 66→30
45～50 70 30
本发明所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案是：建立双鱼颗粒定量指纹图谱后，按相同的方法测定待测双鱼颗粒样品的定量指纹图谱，然后将其与上述双鱼颗粒的定量指纹图谱比较，相似度不低于0.90。
本发明所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案是：
对照品溶液的制备：精密称取新绿原酸对照品、绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、芍药苷对照品、异绿原酸B对照品、异绿原酸A对照品、异绿原酸C对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含新绿原酸18μg、绿原酸110μg、隐绿原酸25μg、芍药苷30μg、异绿原酸B 16μg、异绿原酸A 30μg、异绿原酸C 58μg的混合对照品溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品适量，加入70％甲醇80-120倍体积超声，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得；
优选的供试品溶液的制备方法为：取本品5袋，混匀，研细，取约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，超声提取30分钟，放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录50min图谱，即得。
优选的超声提取的工艺参数为250W，40KHz。
本发明所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案是，每克双鱼颗粒的有效成份含量标准为：含新绿原酸不得少于1.45mg，含绿原酸不得少于9.20mg，含隐绿原酸不得少于1.50mg，含芍药苷不得少于3.40mg，含异绿原酸B不得少于1.10mg，含异绿原酸A不得少2.10mg，异绿原酸C不得少于3.0mg。
本发明所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，优选的待测双鱼颗粒样品的定量指纹图谱的17个共有峰相对保留时间控制范围如下：
Figure BDA0001094208980000021
Figure BDA0001094208980000031
优选的17个共有峰的相对峰面积控制范围如下：
Figure BDA0001094208980000032
Figure BDA0001094208980000041
与现有技术相比，本发明提供一种新的双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，该方法能够反映双鱼颗粒的主要成分含量的变化情况，用于更好地评价和控制双鱼颗粒的质量。主要表现为：
本发明方法采用的色谱条件所获得图谱能较全面的反映本品化学成分，因此能作为指纹图谱较好的控制本品质量；而现有技术方法所获得图谱中色谱峰较少，不能有效控制产品质量。
本发明采用的色谱条件所获得图谱中各色谱峰分离较好，可同时进行定量测定，本次提供资料根据对照品获得情况对7个化学成分进行了定量控制；而现有技术所获得图谱中仅5个主要色谱峰分离较好，同时进行多成分含量测定较难以实现。
本发明采用的色谱柱为常用色谱柱，普通高效液相色谱仪即可实现；而现有技术需采用超高压液相色谱柱和超高效液相色谱仪才能实现。而且本发明采用最适合的洗脱程序、
流速、流动相中酸浓度均可以实现更好地评价和控制双鱼颗粒的质量。
附图说明
图1为波长的考察对比图谱；
图2为洗脱程序的考察对比图谱(230nm)；
图3为洗脱程序的考察对比图谱(327nm)；
图4流动相系统的考察对比图谱(230nm)；
图5流动相系统的考察对比图谱(327nm)；
图4、图5中，A：乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液，B：乙腈-0.05％磷酸水溶液，C：乙腈-0.3％甲酸水溶液；
图6双鱼颗粒指纹图谱和含量测定色谱柱选择图谱(230nm)；
图7双鱼颗粒指纹图谱和含量测定色谱柱选择图谱(327nm)；
图6、图7中：A-Kromasil C18(250×4.6mm，3.5μm)，B-Kromasil C18(150×4.6mm，3.5μm)，C-Kromasil C18(250×4.6mm，5μm)，D-Agilent ZorbaxEclipse C18(4.6×150mm，5μm)；
图8为柱温的考察对比图谱(230nm)；
图9为柱温的考察对比图谱(327nm)；
图10为流速的考察对比图谱(230nm)；
图11为流速的考察对比图谱(327nm)；
图12为延长时间测试滞后峰图谱；
图13为双鱼颗粒对照指纹图谱。
具体实施方式
以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立双鱼颗粒定量指纹图谱：采用高效液相色谱法，
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Kromasil C18，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～50min，5％A～70％A；流速每分钟为0.8ml；检测波长为230nm和327nm；柱温30℃。
梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0001094208980000051
Figure BDA0001094208980000061
建立建立双鱼颗粒定量指纹图谱后，按相同的方法测定待测双鱼颗粒样品的定量指纹图谱，然后将其与上述双鱼颗粒的定量指纹图谱比较，相似度不低于0.90。
其中：
对照品溶液的制备：精密称取新绿原酸对照品、绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、芍药苷对照品、异绿原酸B对照品、异绿原酸A对照品、异绿原酸C对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含新绿原酸18μg、绿原酸110μg、隐绿原酸25μg、芍药苷30μg、异绿原酸B 16μg、异绿原酸A 30μg、异绿原酸C 58μg的混合对照品溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品5袋，混匀，研细，取约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，超声提取30分钟，超声提取的工艺参数为250W，40KHz；放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录50min图谱，即得。
每克双鱼颗粒的有效成份含量标准为：含新绿原酸不得少于1.45mg，含绿原酸不得少于9.20mg，含隐绿原酸不得少于1.50mg，含芍药苷不得少于3.40mg，含异绿原酸B不得少于1.10mg，含异绿原酸A不得少2.10mg，异绿原酸C不得少于3.0mg。
实施例2，一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立双鱼颗粒定量指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适应性试验：色谱柱C18，以乙腈为流动相A，以体积浓度0.05％三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～50min，5％A～70％A；流速每分钟为0.7ml；检测波长为230nm和327nm；柱温25℃。其余与实施例1相同。
实施例3，一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立双鱼颗粒定量指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适应性试验：色谱柱C18，以乙腈为流动相A，以体积浓度0.05％三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～50min，5％A～70％A；流速每分钟为0.9ml；检测波长为230nm和327nm；柱温35℃。其余与实施例1相同。
实施例4，一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Kromasil C18，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm。其余与实施例1或2或3相同。
实施例5，一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法：其中供试品溶液的制备方法为：取本品适量，加入70％甲醇80-120倍体积超声，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得。其余与实施例1或2或3相同。
实施例6，双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法实验，本试验针对双鱼颗粒处方中药味进行指纹图谱和多成分含量测定研究。
1.1仪器与试药
Agilent1200液相色谱仪，DAD紫外检测器，MWD紫外检测器；KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Mettler AE240电子分析天平(梅特勒公司)；BSA224S-CW型电子分析天平(赛多利斯公司)；H1650-W台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；Milli-Q Academic纯水机(密理博公司)。
绿原酸对照品(批号：110753-201314)和芍药苷对照品(批号：110736-201337)，均购自中国食品药品检定研究院；新绿原酸对照品(批号：MUST-13013001)、隐绿原酸对照品(批号：MUST-13013002)、异绿原酸A对照品(批号：MUST-13101101)、异绿原酸B对照品(MUST-13081402)、异绿原酸C对照品(批号：MUST-13081401)，均购自成都曼斯特生物技术有限公司；乙腈和三氟乙酸，均为色谱纯，美国天地公司；甲醇和乙醇均为分析纯，南京化学试剂公司；超纯水。
1.2药品来源
本文研究用双鱼颗粒由江苏康缘药业股份有限公司生产。
1.3指纹图谱参照物的选择
通过与对照品比对，双鱼颗粒指纹图谱中主要已知化合物为芍药苷、芍药内酯苷、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C和新绿原酸，芍药苷在本品指纹图谱中保留时间适中、分离较好、对照品易获得，因此选择芍药苷为本品指纹图谱参照物。
1.4检测方法
1.4.1检测波长的选择
通过230nm、250nm、280nm、300nm和327nm5个检测波长及190～400nm范围全扫描比较分析，检测波长为230nm能较全面的反映双鱼颗粒中化学成分，且各色谱峰分离较好，所以优选230nm为双鱼颗粒指纹图谱测定波长。芍药苷最大吸收波长为230nm，因此芍药苷含量测定波长优选为230nm，结合绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C和新绿原酸紫外吸收曲线，这6个成分含量测定波长优选为327nm。见图1。
1.4.2梯度洗脱程序的选择
将色谱柱固定为Kromasil C18(250×4.6mm，3.5μm)，考察不同洗脱程序(见表1-3)，结果以洗脱程序III所得色谱图中各色谱峰峰型较好、分离较佳。见图2和图3。
表1洗脱程序I
时间(min) 乙腈(％) 0.05％三氟乙酸(％)
0～6 5→10 95→90
6～9 10→15 90→85
9～15 15→25 85→75
15～30 25→50 75→50
30～39 50→65 50→35
39～48 65→80 35→20
48～50 80→85 20→15
表2洗脱程序II
时间(min) 乙腈(％) 0.05％三氟乙酸(％)
0～6 8→10 92→90
6～12 10 90
12～25 10→42 90→58
25～50 42→95 58→5
50～55 95 5
表3洗脱程序III
时间(min) 乙腈(％) 0.05％三氟乙酸(％)
0～10 5→10 95→90
10～15 10→15 90→85
15～25 15→25 85→75
25～34 25→34 75→66
34～45 34→70 66→30
1.4.3流动相的选择
色谱柱固定为Kromasil C18(250×4.6mm，3.5μm)，洗脱程序固定为2.5.2中洗脱程序III。考虑到本品含有大量有机酸类成分，选用乙腈-酸水系统进行研究。比较了乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液、乙腈-0.3％甲酸水溶液和乙腈-0.05％磷酸水溶液系统，结果显示乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液所得色谱图中各色谱峰峰型较好、分离较佳，因此优选乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液作为流动相。见图4和图5。
1.4.4色谱柱的选择
洗脱程序固定为2.5.2中洗脱程序III，对不同品牌的色谱柱进行考察，分别为：Kromasil C18(250×4.6mm，3.5μm)、Kromasil C18(150×4.6mm，3.5μm)、Kromasil C18(250×4.6mm，5μm)和Agilem Zorbax Eclipse C18(4.6×150mm，5μm)。结果显示，KromasilC18(250×4.6mm，3.5μm)对样品的分离效果较好，用2支该类型的色谱柱进行试验，结果重复性较好，因此优选该类型色谱柱为双鱼颗粒指纹图谱和含量测定分析柱。见图6-7。
1.4.5柱温的考察
洗脱程序固定为2.5.2中洗脱程序III，色谱柱固定为Kromasil C18(250×4.6mm，3.5μm)，试验比较了柱温为25℃、30℃和35℃所得图谱，结果柱温为30℃时所得指纹图谱和多成分含量测定图谱中各色谱峰分离较好。见图8-9。
1.4.6流速的考察
洗脱程序固定为2.5.2中洗脱程序III，色谱柱固定为Kromasil C18(250×4.6mm，3.5μm)，柱温为30℃，试验比较了流速为0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min和1.0ml/min所得图谱，结果流速为0.8ml/min时所得指纹图谱和多成分含量测定图谱中各色谱峰分离较好。见图10-11。
1.4.7滞后峰测试
延长测试时间1倍至90分钟，结果45min后50min前有小的色谱峰，因此在双鱼颗粒指纹图谱和多成分含量测定时，将2.5.2中洗脱程序III时间延长至50min。见图12。
综上所述，双鱼颗粒指纹图谱和多成分含量测定检测条件最佳条件确定为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Kromasil C18(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为0.8ml；检测波长为230nm(测定指纹图谱和芍药苷)和327nm(测定绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C和新绿原酸)；柱温30℃。
洗脱程序表
时间(min) 乙腈(％) 0.05％三氟乙酸(％)
0～10 5→10 95→90
10～15 10→15 90→85
15～25 15→25 85→75
25～34 25→34 75→66
34～45 34→70 66→30
45～50 70 30
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录50min图谱，即得。
1.5供试品溶液的制备
1.5.1提取方法的选择
取批号为150201的双鱼颗粒粉末2份，每份约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，考察超声提取(250W，40KHz)30分钟和回流提取60分钟，放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，测定，结果见表4和。
结果表明，超声提取(250W，40KHz)30分钟和回流提取60分钟提取效果无明显差异，考虑到超声提取操作简便，因此本品指纹图谱和多成分含量测定提取方法选择超声提取法。
表4提取方式考察结果(单位：mg/g)
指标成分 回流提取60分钟 超声提取30分钟
新绿原酸 2.25 2.28
绿原酸 13.21 13.18
隐绿原酸 2.58 2.59
芍药苷 3.52 3.49
异绿原酸B 1.65 1.67
异绿原酸A 2.98 2.97
异绿原酸C 6.23 6.28
1.5.2提取溶剂的选择
取批号为150201的双鱼颗粒粉末8份，每份约0.25g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、乙醇、70％乙醇、50％乙醇和30％乙醇25ml，陈定重量，超声提取(250W，40KHz)30分钟，放冷，称重，用相应的溶媒补足减失的重量，摇匀，测定，结果见表5。
结果表明，70％甲醇提取效果较优，因此本品指纹图谱和多成分含量测定提取溶剂选择70％甲醇。
表5提取溶剂考察结果(单位：mg/g)
Figure BDA0001094208980000111
“——”表示色谱峰峰型太差，无法定量计算。
1.5.3提取溶剂用量的选择
取批号为150201的双鱼颗粒粉末3份，每份约0.25g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇15ml、25ml和50ml，超声提取(250W，40KHz)30分钟，放冷，称重，用相应的溶媒补足减失的重量，摇匀，测定，结果见表6。
结果表明，提取溶剂为25ml和50ml的提取效果相当，因此本品指纹图谱和多成分含量测定提取溶剂用量优选确定为25ml。
表6提取溶剂用量考察结果(单位：mg/g)
Figure BDA0001094208980000112
Figure BDA0001094208980000121
1.5.4提取时间的选择
取批号为150201的双鱼颗粒粉末3份，每份约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，分别超声提取(250W，40KHz)15分钟、30分钟和45分钟，放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，测定，结果见表7。
结果表明，提取时间为30分钟即可，因此本品指纹图谱和多成分含量测定提取时间确定优选为30分钟。
表7提取时间考察结果(单位：mg/g)
Figure BDA0001094208980000122
通过上述考察，确定双鱼颗粒指纹图谱和多成分含量测定供试品溶液的制备方法为：取本品5袋，混匀，研细，取约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，超声提取(250W，40KHz)30分钟，放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得。
1.6精密度试验
取批号为150201的双鱼颗粒，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定，测定结果见表8-10。结果表明，供试品溶液中7个指标成分含量、指纹图谱各共有峰的相对保留时间及相对峰面积基本一致(RSD＜3％)。又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99。结果表明该方法精密度良好。
表8双鱼颗粒指标成分精密度考察结果(峰面积)
Figure BDA0001094208980000123
Figure BDA0001094208980000131
表9双鱼颗粒指纹图谱精密度考察结果(各共有峰相对保留时间)
0h 2h 4h 6h 8h 12h 平均 RSD(％)
1 0.26 0.26 0.25 0.26 0.26 0.26 0.26 1.58
2 0.33 0.34 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 1.23
3 0.43 0.44 0.43 0.42 0.43 0.44 0.43 1.74
4 0.62 0.62 0.63 0.63 0.62 0.64 0.63 1.30
5 0.66 0.66 0.65 0.66 0.66 0.67 0.66 0.96
6 0.77 0.76 0.77 0.76 0.77 0.77 0.77 0.67
7 0.78 0.77 0.78 0.77 0.78 0.78 0.78 0.66
8 0.79 0.78 0.79 0.78 0.79 0.79 0.79 0.66
9 0.81 0.80 0.81 0.80 0.80 0.81 0.81 0.68
10 0.89 0.90 0.90 0.89 0.89 0.90 0.90 0.61
11 0.96 0.95 0.96 0.96 0.95 0.96 0.96 0.54
12(S) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
13 1.15 1.15 1.16 1.15 1.15 1.16 1.15 0.45
14 1.18 1.18 1.17 1.17 1.18 1.19 1.18 0.64
15 1.20 1.19 1.19 1.20 1.19 1.21 1.20 0.68
16 1.24 1.24 1.24 1.22 1.23 1.25 1.24 0.84
17 1.30 1.29 1.29 1.30 1.30 1.31 1.30 0.58
表10双鱼颗粒指纹图谱精密度考察结果(各共有峰相对峰面积)
Figure BDA0001094208980000132
Figure BDA0001094208980000141
1.7线性范围考察
精密称取新绿原酸对照品、绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、芍药苷对照品、异绿原酸B对照品、异绿原酸A对照品、异绿原酸C对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含新绿原酸164.8μg、绿原酸806.4μg、隐绿原酸189.6μg、芍药苷243.2μg、异绿原酸B 135.2μg、异绿原酸A 241.6μg、异绿原酸C 465.6μg的混合对照品溶液，将其作为母液用70％甲醇逐倍稀释，依法测定，即得。以对照品的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，各对照品线性范围、回归方程和相关系数见表11。
表11各对照品线性范围、回归方程和相关系数
线性范围(μg/ml) 回归方程 相关系数
新绿原酸 5.15～164.8 Y＝13.61X+3.048 r＝1
绿原酸 25.2～806.4 Y＝22.83X+42.19 r＝0.9999
隐绿原酸 5.92～189.6 Y＝17.72X+4.59 r＝0.9999
芍药苷 7.6～243.2 Y＝15.06X+18.48 r＝0.9997
异绿原酸B 4.22～135.2 Y＝21.45X-1.348 r＝1
异绿原酸A 7.55～241.6 Y＝25.71X-8.784 r＝1
异绿原酸C 14.55～465.6 Y＝23.84X+53.36 r＝0.9998
1.8稳定性试验
取批号为150201的双鱼颗粒，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h和12h测定一次，共测6次，测定结果见表12-14。结果表明，供试品溶液中7个指标成分峰面积、指纹图谱中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积基本一致(RSD＜3％)。又以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均大于0.99，表明供试品溶液室温12小时内稳定性良好。
表12双鱼颗粒指标成分稳定性考察结果(峰面积)
0h 2h 4h 6h 8h 12h 平均 RSD(％)
新绿原酸 301.2 300.8 303.1 300.2 299.8 295.4 300.1 0.85
绿原酸 2999.6 2998.4 2999.9 3005.7 2998.6 2986.3 2998.1 0.21
隐绿原酸 449.8 449.2 450.6 441.0 451.7 442.5 447.5 1.01
芍药苷 540.2 540.7 542.3 539.8 536.2 547.6 541.1 0.69
异绿原酸B 345.1 344.8 346.4 348.2 350.0 341.0 345.9 0.90
异绿原酸A 724.0 723.8 725.3 726.1 720.9 718.3 723.1 0.41
异绿原酸C 1428.3 1429.6 1430.4 1427.5 1425.1 1420.6 1426.9 0.25
表13双鱼颗粒指纹图谱稳定性考察结果(各共有峰相对保留时间)
0h 2h 4h 6h 8h 12h 平均 RSD(％)
1 0.26 0.26 0.25 0.25 0.25 0.26 0.26 2.15
2 0.33 0.33 0.34 0.33 0.34 0.33 0.33 1.55
3 0.44 0.43 0.44 0.44 0.43 0.44 0.44 1.18
4 0.63 0.62 0.63 0.63 0.62 0.63 0.63 0.82
5 0.67 0.67 0.67 0.67 0.66 0.67 0.67 0.61
6 0.77 0.76 0.76 0.77 0.77 0.76 0.77 0.72
7 0.78 0.77 0.77 0.78 0.78 0.78 0.78 0.66
8 0.79 0.78 0.79 0.79 0.79 0.79 0.79 0.52
9 0.81 0.80 0.80 0.80 0.80 0.81 0.80 0.64
10 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.00
11 0.95 0.95 0.96 0.95 0.95 0.96 0.95 0.54
12(S) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
13 1.16 1.16 1.16 1.16 1.15 1.15 1.16 0.45
14 1.17 1.17 1.18 1.18 1.18 1.18 1.18 0.44
15 1.19 1.19 1.19 1.20 1.19 1.20 1.19 0.43
16 1.23 1.23 1.23 1.24 1.23 1.24 1.23 0.42
17 1.29 1.29 1.30 1.29 1.30 1.29 1.29 0.40
表14双鱼颗粒指纹图谱稳定性结果(各共有峰相对峰面积)
Figure BDA0001094208980000151
Figure BDA0001094208980000161
1.9重复性试验
取批号为150201的双鱼颗粒，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液6份，依法测定，测定结果见表15-17。结果表明，供试品溶液中各指标成分含量、共有峰的相对保留时间及相对峰面积基本一致(RSD＜4％)。又以第1份样品所得指纹图谱做为对照计算另5份样品所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99。结果表明该方法重复性良好。
表15双鱼颗粒指标成分重复性考察结果(单位mg/g)
1 2 3 4 5 6 平均 RSD(％)
新绿原酸 2.28 2.25 2.29 2.31 2.30 2.31 2.29 1.00
绿原酸 13.15 13.11 13.18 13.19 13.22 13.2 13.18 0.30
隐绿原酸 2.58 2.55 2.56 2.59 2.54 2.57 2.57 0.73
芍药苷 3.53 3.51 3.48 3.50 3.53 3.47 3.50 0.72
异绿原酸B 1.71 1.7 1.66 1.69 1.72 1.65 1.69 1.65
异绿原酸A 3.01 3 2.96 2.98 2.95 3.03 2.99 1.02
异绿原酸C 6.26 6.24 6.25 6.28 6.21 6.32 6.26 0.60
表16双鱼颗粒指纹图谱重复性考察结果(各共有峰相对保留时间)
Figure BDA0001094208980000162
Figure BDA0001094208980000171
表17双鱼颗粒指纹图谱重复性考察结果(各共有峰相对峰面积)
1 2 3 4 5 6 平均 RSD(％)
1 0.19 0.19 0.20 0.19 0.20 0.19 0.19 2.67
2 0.37 0.38 0.37 0.37 0.38 0.37 0.37 1.38
3 0.15 0.15 0.16 0.16 0.15 0.15 0.15 3.37
4 0.57 0.57 0.56 0.56 0.55 0.56 0.56 1.34
5 0.44 0.45 0.44 0.45 0.45 0.43 0.44 1.84
6 1.21 1.20 1.22 1.19 1.18 1.22 1.20 1.36
7 5.56 5.55 5.57 5.56 5.52 5.56 5.55 0.32
8 0.56 0.57 0.54 0.56 0.57 0.56 0.56 1.96
9 0.84 0.83 0.81 0.83 0.82 0.84 0.83 1.41
10 0.35 0.34 0.35 0.34 0.34 0.34 0.34 1.50
11 0.40 0.39 0.40 0.40 0.39 0.38 0.39 2.08
12(S) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
13 0.66 0.64 0.65 0.64 0.63 0.63 0.64 1.82
14 0.31 0.30 0.31 0.29 0.30 0.31 0.30 2.69
15 1.35 1.35 1.34 1.33 1.33 1.34 1.34 0.67
16 2.63 2.65 2.65 2.62 2.65 2.66 2.64 0.57
17 1.01 1.04 1.04 1.06 1.05 1.03 1.04 1.66
1.10加样回收率试验
取批号为150201的双鱼颗粒粉末6份，每份约0.125g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液(每1ml含新绿原酸286.2μg，绿原酸1605.3μg，隐绿原酸324.1μg，芍药苷435.4μg，异绿原酸B 208.5μg，异绿原酸A 365.6μg，异绿原酸C 763.8μg)1ml，再精密加入70％甲醇24ml，称定重量，超声提取(250W，40KHz)30分钟，放冷，称重，70％甲醇补重，测定，计算回收率。结果表明该方法能准确测定样品中含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芍药苷、异绿原酸B、异绿原酸和异绿原酸C的含量，见表18。
表18 7个指标成分含量测定加样回收率考察结果
Figure BDA0001094208980000181
根据以上方法学考察结果，表明该方法线性、精密度、重复性、稳定性和加样回收率均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱和含量。
1.11样品测定及对照指纹图谱的获得
收集十批双鱼颗粒样品，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依法测定，计算7个指标成分含量、指纹图谱各共有峰的相对保留时间、相对峰面积和相似度，用相似度软件以这十批样品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为对照指纹图谱，见图13。结果见表19-22。
表19双鱼颗粒含量测定结果(单位mg/g)
Figure BDA0001094208980000182
Figure BDA0001094208980000191
表20双鱼颗粒指纹图谱样品测定结果(各共有峰相对保留时间)
150201 150202 150203 141201 141202 141203 141102 141104 150301 150302
1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.24 0.25 0.25 0.25 0.26 0.25
2 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.34 0.33 0.33
3 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43
4 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.63 0.62 0.62 0.63 0.62
5 0.66 0.66 0.66 0.66 0.66 0.66 0.66 0.66 0.66 0.66
6 0.76 0.76 0.76 0.76 0.76 0.76 0.76 0.76 0.76 0.76
7 0.77 0.77 0.77 0.78 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
8 0.79 0.78 0.79 0.79 0.79 0.79 0.79 0.79 0.78 0.79
9 0.80 0.79 0.80 0.80 0.80 0.81 0.80 0.80 0.80 0.81
10 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89
11 0.95 0.95 0.95 0.96 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
12(S) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
13 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15 1.16 1.15
14 1.17 1.17 1.17 1.17 1.17 1.17 1.18 1.17 1.17 1.17
15 1.19 1.19 1.19 1.19 1.20 1.19 1.19 1.19 1.19 1.19
16 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23
17 1.30 1.31 1.30 1.30 1.30 1.30 1.30 1.31 1.30 1.30
表21双鱼颗粒指纹图谱样品测定结果(各共有峰的相对峰面积)
Figure BDA0001094208980000192
Figure BDA0001094208980000201
表22双鱼颗粒指纹图谱样品测定结果(相似度)
批号 相似度
150201 0.970
150202 0.969
150203 0.978
141201 0.931
141202 0.937
141203 0.942
141102 0.985
141104 0.980
150301 0.987
150302 0.988
十批双鱼颗粒指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.90，暂定双鱼颗粒指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度不得低于0.90。
根据上述10批双鱼颗粒含量测定结果，暂定本品每克含新绿原酸不得少于1.45mg，含绿原酸不得少于9.20mg，含隐绿原酸不得少于1.50mg，含芍药苷不得少于3.40mg，含异绿原酸B不得少于1.10mg，含异绿原酸A不得少于2.10mg，异绿原酸C不得少于3.0mg。

Claims (8)

1.一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法采用以下方法建立双鱼颗粒定量指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适应性试验：色谱柱C18，以乙腈为流动相A，以体积浓度0.05％三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～50min，5％A～70％A；流速每分钟为0.7～0.9ml；检测波长为230nm和327nm；柱温25～35℃，所述梯度洗脱程序如下:
时间min 乙腈％ 0.05％三氟乙酸％ 0～10 5→10 95→90 10～15 10→15 90→85 15～25 15→25 85→75 25～34 25→34 75→66 34～45 34→70 66→30 45～50 70 30
对照品溶液的制备：精密称取新绿原酸对照品、绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、芍药苷对照品、异绿原酸B对照品、异绿原酸A对照品、异绿原酸C对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含新绿原酸18μg、绿原酸110μg、隐绿原酸25μg、芍药苷30μg、异绿原酸B16μg、异绿原酸A30μg、异绿原酸C 58μg的混合对照品溶液，即得；供试品溶液的制备：取本品适量，加入70％甲醇80-120倍体积超声，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录50min图谱，即得。
2.根据权利要求1所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其特征在于：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Kromasil C18，柱长为250mm,内径为4.6mm，粒径为3.5μm。
3.根据权利要求1所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其特征在于：流速每分钟为0.8ml；柱温30℃。
4.根据权利要求1－3中任何一项所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其特征在于，建立双鱼颗粒定量指纹图谱后，按相同的方法测定待测双鱼颗粒样品的定量指纹图谱，然后将其与上述双鱼颗粒的定量指纹图谱比较，相似度不低于0.90。
5.根据权利要求4所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其特征在于，供试品溶液的制备：取本品5袋，混匀，研细，取约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，超声提取30分钟，放冷，称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得。
6.根据权利要求4所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其特征在于：超声提取的工艺参数为250W，40KHz。
7.根据权利要求1所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其特征在于：每克双鱼颗粒的有效成份含量标准为：含新绿原酸不得少于1.45mg，含绿原酸不得少于9.20mg，含隐绿原酸不得少于1.50mg，含芍药苷不得少于3.40mg，含异绿原酸B不得少于1.10mg，含异绿原酸A不得少2.10mg，异绿原酸C不得少于3.0mg。
8.根据权利要求1所述的一种双鱼颗粒定量指纹图谱检测方法，其特征在于：待测双鱼颗粒样品的定量指纹图谱的17个共有峰相对保留时间控制范围如下：
峰号 相对保留时间 1 0.24～0.26 2 0.31～0.35 3 0.41～0.45 4 0.59～0.65 5 0.63～0.69 6 0.72～0.80 7 0.73～0.81 8 0.75～0.83 9 0.76～0.84 10 0.85～0.93 11 0.90～0.99 S 1.00 13 1.09～1.21 14 1.11～1.23 15 1.13～1.25 16 1.17～1.29 17 1.24～1.37
17个共有峰的相对峰面积控制范围如下：
Figure FDA0002689979340000021
Figure FDA0002689979340000031
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