CN110702813B - 一种苗药黑骨藤hplc指纹图谱研究及多成分含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法。采用HPLC法建立不同产地黑骨藤指纹图谱，并测定其中4种咖啡酰基奎宁酸类化学成分含量，为黑骨藤药材品质评价提供依据；色谱柱为Xtimate C₁₈(4.6mmx250mm,5μm)；以0.1％磷酸水溶液(A)‑乙腈(B)为流动相，梯度洗脱；流速1mL/min；柱温30℃；进样量10μL，检测波长为330nm；使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对样品进行相似度分析，通过黑骨藤HPLC指纹图谱与含量测定，能同时测定4种咖啡酰基奎宁酸类化学成分含量，不同产地之间该4种成分有较大的差异，各成分含量与产地有一定的关联为后期苗药黑骨藤质量标准研究奠定基础。

Description

一种苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种指纹图谱研究及多成分含量测定方法，特别是一种苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法。

背景技术

黑骨藤为萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca Linn.)黑龙骨(Periplocaforrestii Schltr.)的干燥根或全株。药性：味辛、苦、性热；小毒。入冷经。祛风除湿，活血消痈。主治跌打损伤，风湿痹痛，闭经，乳痈，骨折等。是民间广泛应用于治疗闭合性软组织损伤、风湿与类风湿等疾病的民族药。化学成分包括：强心苷类、黄酮类、咖啡酰基奎宁酸类、苯丙素类、三萜类、甾体类等。

但是不同产地黑骨藤的各成分含量存在较大的差异，为了对黑骨藤药材品质评价提供依据，所以研究出一种苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法。本发明具有通过黑骨藤HPLC指纹图谱与含量测定，能同时测定4种咖啡酰基奎宁酸类化学成分含量，不同产地之间该4种成分有较大的差异，各成分含量与产地有一定的关联为后期苗药黑骨藤质量标准研究奠定基础的特点。

本发明的技术方案：一种苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法，包括有以下步骤：

a、供试品溶液的制备：将黑骨藤粉碎过筛，粉末置干燥器中保存，精密称取黑骨藤粉末1.000g，置50mL具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20mL，称定重量，超声提取30min，待冷却至室温后，用50％甲醇补足超声过程中损失的重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

b、对照品溶液的制备：分别精密称取新绿原酸5.00mg、绿原酸5.04mg、隐绿原酸5.00mg、异绿原酸C 5.03mg，分别置于5mL的容量瓶中，以0.1％的磷酸水和乙腈溶液使之充分溶解，定容，配制成浓度分别为新绿原酸1.00mg/mL、绿原酸1.008mg/mL、隐绿原酸1.00mg/mL、异绿原酸C 1.006mg/mL的对照品溶液，备用；

混合对照品溶液的配制：分别精密量取2mL的新绿原酸对照品溶液、5mL的绿原酸对照品溶液、2mL的隐绿原酸对照品溶液、2mL的异绿原酸C对照品溶液置于25mL容量瓶中，用75％的甲醇定容至刻度线，则混合对照品中4种成分的浓度分别为：新绿原酸0.08mg/mL、绿原酸0.2016mg/mL、隐绿原酸0.08mg/mL、异绿原酸C 0.0805mg/mL；

c、将供试品溶液和混合对照品溶液分别进行液相色谱进样测定，将色谱对比后，并分别计算出试品溶液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸的含量；

d、将供试品溶液按进行梯度洗脱，记录HPLC色谱图，并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012)软件，计算相似度。

前述的苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法中，所述步骤a中，将黑骨藤粉碎过24目筛。

前述的苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法中，所述步骤a中，是采用功率200W，频率40KHz进行超声提取30min。

前述的苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法中，所述步骤b中，0.1％的磷酸水和乙腈溶液中0.1％的磷酸水与乙腈溶液的体积比为92:8。

前述的苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法中，所述步骤c和d中的色谱条件为：

色谱柱:XtimateC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)；流动相为0.1％磷酸水(A)-乙腈(B)，按流动相进行梯度洗脱；检测波长为330nm；柱温为30℃；流速为1mL/min；进样量为10μL；

流动相：

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用HPLC法建立不同产地黑骨藤指纹图谱，并测定其中4种咖啡酰基奎宁酸类化学成分含量，为黑骨藤药材品质评价提供依据。方法色谱柱为XtimateC₁₈(4.6mmx250mm,5μm)；以0.1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱；流速1mL/min；柱温30℃；进样量10μL，检测波长为330nm。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对样品进行相似度分析，此外，对27批黑骨藤药材测定结果中共有峰的峰面积进行处理，并应用数理统计软件SPSS进行聚类分析。结果初步建立了以16个共有峰为特征指纹信息，指认了其中4个，并对其新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C的含量进行了测定。结论通过黑骨藤HPLC指纹图谱与含量测定，能同时测定4种咖啡酰基奎宁酸类化学成分含量，不同产地之间该4种成分有较大的差异，各成分含量与产地有一定的关联为后期苗药黑骨藤质量标准研究奠定基础。

实验例：检测方法研究

1仪器与试剂

电子天平(百分之一，型号：JE1002，上海浦春计量仪器有限公司)；电子天平(千分之一，型号：JA2003，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；电子天平(十万分之一，型号：EX225DZH，奥豪斯仪器(常州)有限公司)；超声波清洗机(型号：SB-5200D7，宁波新芝生物科技股份有限公司)；高速多功能粉碎机(型号：0-300B，上海冰都电器有限公司)；循环水式多用真空泵(型号：SHZ-DIII，巩义市予华仪器有限责任公司)；高效液相色谱仪(型号：U-3000，赛默飞世尔科技)；电热鼓风干燥箱(型号：101-2AB，天津市泰斯特仪器有限公司)；高效液相色谱柱(型号：XtimateC18(4.6mm×250mm,5μm)，月旭科技股份有限公司)；其他常规玻璃仪器。

甲醇(色谱纯，批号：20170914，天津市科密欧化学试剂有限公司)；丙酮(批号：20120731，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，批号：20180927，天津市科密欧化学试剂有限公司)；乙醇(批号：20171031，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(批号：20180618，天津市富宇精细化工有限公司)；甲酸(批号：20150612，成都金山化学试剂有限公司)；乙酸(批号：1601101，上海申博化工有限公司)；甲醇(分析纯，批号：20171023，天津市科密欧化学试剂有限公司)；娃哈哈纯净水(娃哈哈食品有限公司)；磷酸(批号：20180501，重庆川东集团有限公司)；

绿原酸对照品(批号：CHB170713)；新绿原酸对照品(批号：CHB180308)；隐绿原酸对照品(批号：CHB170828)；异绿原酸C对照品(批号：CHB171013)，纯度均≥98％，均购于成都克洛玛生物科技有限公司。

黑骨藤药材共27批，来源及其产地见表1，由贵州中医药大学刘刚老师鉴定为萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca Linn)植物黑骨藤(Periploca farrestilSchltr.)。

表1黑骨藤样品来源信息

Table 1 Source information of Periploca farrestil Schltr.

2方法

2.1供试品溶液的制备

将黑骨藤粉碎过二号筛(24目)，粉末置干燥器中保存，备用。

精密称取黑骨藤粉末(S15)1.000g，置50mL具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20mL，称定重量，超声提取30min(功率200W，频率40KHz)，待冷却至室温后，用50％甲醇补足超声过程中损失的重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2对照品溶液的制备

分别精密称取新绿原酸5.00mg、绿原酸5.04mg、隐绿原酸5.00mg、异绿原酸C5.03mg，分别置于5mL的容量瓶中，以0.1％的磷酸水：乙腈(92:8)溶液使之充分溶解，定容，配制成浓度分别为新绿原酸1.00mg/mL、绿原酸1.008mg/mL、隐绿原酸1.00mg/mL、异绿原酸C 1.006mg/mL的对照品溶液，备用。

混合对照品溶液的配制：分别精密量取2mL的新绿原酸对照品溶液、5mL的绿原酸对照品溶液、2mL的隐绿原酸对照品溶液、2mL的异绿原酸C对照品溶液置于25mL容量瓶中，用75％的甲醇定容至刻度线，则混合对照品中4种成分的浓度分别为：新绿原酸0.08mg/mL、绿原酸0.2016mg/mL、隐绿原酸0.08mg/mL、异绿原酸C 0.0805mg/mL。

2.3色谱条件

色谱柱:XtimateC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)；流动相为0.1％磷酸水(A)-乙腈(B)，按表2.2进行梯度洗脱；检测波长为330nm；柱温为30℃；流速为1mL/min；进样量为10μL。

表2流动相梯度洗脱程序

Table 2 Gradient elution program of mobile phase

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验

精密称取黑骨藤药材粉末(S15)一份，按照“2.1”项提取方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行分析，平行进样6次，记录图谱。计算其共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3.0％(n＝6)，符合要求，表明仪器精密度良好。

2.4.2稳定性实验

精密称取黑骨藤药材粉末(S15)一份，按照“2.1”项提取方法制备供试品溶液，分别于0h、4h、6h、8h、12h、24h，32h，48h时按“2.3”项下色谱条件分析，记录图谱。计算其共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3％，结果表明供试品中待测成分在48h内稳定。

2.4.3重复性实验

精密称取黑骨藤药材粉末(S15)，按照“2.1”项提取方法平行制备6份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行分析，记录图谱。计算其共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3.0％(n＝6)，表明此方法具有较好的重复性。

2.5数据分析

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012)软件对HPLC指纹图谱数据进行处理，确定共有峰，生成对照图谱并进行相识度计算，对部分共有峰进行指认并计算其含量。

3结果与分析

3.1指纹图谱的构建及共有峰的确定

按“2.1”项下方法制备各供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，记录HPLC色谱图，并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012)软件，以S15样品色图谱为参照，建立指纹图谱。叠加图及对照指纹图谱见图1、2。

27批黑骨藤样品，共标记了16个共有峰，并对其中4个共有峰进行了指认，分别为新绿原酸(2)、绿原酸(3)、隐绿原酸(4)、异绿原酸C(10)。

3.2黑骨藤样品指纹图谱相识度分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012)软件，以对照图谱(R)为参照，计算相似度，结果见表3。由相似度结果可知，一方面，得到不同产地黑骨藤指纹图谱相似度在0.83～0.998，除S21号批次为0.83，其他均在0.9以上。另一方面，27个不同产地样品间的相似度在0.709～0.999。

表3黑骨样品指纹图谱的相似度评价

Table 3 Fingerprint Similarity Evaluation of periploca farrestilSchltr

3.3指标性成分含量测定

3.3.1线性关系

分别精密称取新绿原酸25.73mg、绿原酸45.54mg、隐绿原酸14.93mg、异绿原酸C10.02mg，分别置于10mL的容量瓶中，用50％的甲醇定容至刻度线，制成质量浓度分为新绿原酸2.573mg/mL、绿原酸4.554mg/mL、隐绿原酸1.493mg/mL、异绿原酸C1.002mg/mL的对照品溶液，摇匀，备用。分别吸取上述对照品溶液各1mL(n＝8)，分别置于5mL、10mL、25mL、50mL、100mL、250mL、500mL、1000mL的容量瓶中，再各自用50％的甲醇定容至刻度线，摇匀，制成浓度由高至低各个浓度梯度的混合对照品溶液，备用。再分别按“2.3”项下色谱条件进样，以峰面积值Y为纵坐标，质量浓度(mg/mL)X为横坐标，计算回归方程，绘制标准曲线。详细结果见下表4。

表4 4种成分的线性关系和线性范围

Table 4 Linear relationship and linear range of four kinds ofcomponents

3.3.2精密度试验

精密称取黑骨藤药材粉末(S15)一份，按照“2.1”项提取方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行分析，平行进样6次，记录图谱。计算其共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD分别为0.16％、0.42％、0.48％、0.52％，表明仪器精密度良好。

3.3.3稳定性试验

精密称取黑骨藤药材粉末(S15)一份，按照“2.1”项提取方法制备供试品溶液，分别于0h、4h、6h、8h、12h、24h，32h，48h时按“2.3”项下色谱条件分析，记录图谱。计算其共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD分别为0.50％、0.47％、0.51％、1.1％，结果表明供试品中待测成分在48h内稳定。

3.3.4重复性试验

精密称取黑骨藤药材粉末(S15)，按照“2.1”项提取方法平行制备6份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行分析，记录图谱。计算其共有峰相对保留时间及相对峰面积的分别为1.1％、1.3％、1.0％、2.2％，表明此方法具有较好的重复性。

3.3.5加样回收试验

分别精密称取新绿原酸8.45mg，绿原酸35.07mg,隐绿原酸6.49mg，异绿原酸C10.28mg于10mL容量瓶中，用50％的甲醇定容至刻度线，制成浓度分别为新绿原酸0.845mg/mL，绿原酸3.507mg/mL，隐绿原酸0.649mg/mL，异绿原酸C1.028mg/mL的对照品溶液，备用。

精密称取0.500g的批次为S15的黑骨藤药材，分别加入上述对照品溶液各1mL，再加入16mL的50％的甲醇，混匀，称重，超声30min，放冷，补重，用0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即可，平行操作6份。按“2.3”项下色谱条件进行分析，记录峰面积并计算回收率，结果显示新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C的回收率分别为103.30％、103.09％、103.02％、98.11％；RSD值分别为1.20％、0.66％、0.70％、2.00％。

3.3.6样品含量测定

通过对27批黑骨藤药材进行色谱分析，测定黑骨藤样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C含量，含量测定结果见表5。

表5黑骨藤4种成分含量测定结果

Table 5 Determination of the content of four components in periplocafarrestil Schltr

3.3.7聚类分析

以各自的含量为变量，采用SPSS 20.0统计软件对27批次的苗药黑骨藤药材样品进行聚类分析，其中，采用组间平均数联结法，以平方欧氏距离作为样品相似度的距离公式，分析结果树状图见图3。如图3所见，在平方欧氏距离为12.5下，可将样品分为3类:即S13、S23、S26、S2、S4、S24、S18、S1、S17、S16聚为第一大类；S6、S22、S5、S8、S27、S3、S25、S11、S9、S14、S7、S19聚为第二大类；S20、S21、S10、S12、S15聚为第三大类。

结果分析:从表8样品含量测定结果发现，苗药黑骨藤中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸这三种咖啡酰基奎宁酸类成分的含量相对要高一点，而异绿原酸C普遍偏低。通过比较不同产地的被测4种咖啡酰基奎宁酸类成分的含量可看出，贵州省内黔南布依族苗族自治州(惠水)至西南方向的安顺市、黔西南布依族苗族自治州，4种被测成分的含量均较高，其中在兴义市采集的黑骨藤药材的含量最高；黔南布依族苗族自治州(龙里)至东南方向的黔东南苗族侗族自治州的交界处，4种被测成分含量普遍较低，其中，在福泉市采集的药材含量最低。贵阳市内花溪区花溪近郊采集的含量较低，但在花溪区花溪大学城贵州中医药大学校内栽培种植的含量较高。此外，在贵阳市内从銧铭药行、王氏虫草行、北京同仁堂、鸿源药行和花果园本草药行中购买的黑骨藤药材的含量均较高。从聚类分析结果可发现，第三大类S20、S21、S10、S12、S15的总体平均含量最高；第二大类S6、S22、S5、S8、S27、S3、S25、S11、S9、S14、S7、S19的总体平均含量居中；第一大类S13、S23、S26、S2、S4、S24、S18、S1、S17、S16的总体平均含量最低。因此，不同产地的苗药黑骨藤中该4种被测成分的含量还是有明显差异的，各成分含量与产地有一定的关联，猜想与其所生长的环境、气候、湿度、土壤等有一定的关系，为后期苗药黑骨藤抗风湿关节炎质量标准研究奠定基础。

4讨论

该实验对提取溶剂及其浓度、提取方法及其提取时间、料液比、流动相、流速、柱温、波长进行了考察筛选。提取溶剂及其浓度中通过比较10％、30％、50％、70％、90％、100％的甲醇溶液和10％、30％、50％、70％、95％的乙醇溶液所提取的样品的色谱图,通过比较其峰形、分离度、峰面积、峰的个数等因素，结果表明50％甲醇溶液所提取的样品效果最好，因此选用50％甲醇溶液作为提取溶剂；提取方法及提取时间考察了实验室中较为常用的回流和超声提取两种方法，并通过比较回流提取30min、60min、90min、120min，超声波提取10min、20min、30min、40min、50min、60min,比较各个色谱图中的峰的个数、峰面积、分离度、峰形，结果发现超声波提取30min的提取效果较好，操作也较为简便，因此选用该方法为提取方法；料液比中通过比较中药材重:提取溶剂体积为1:100、2:10、3:15、4:20、5:25、1:20，比较其色谱图中的峰的个数、峰形、分离度、峰面积，结果发现当料液比为1:20时，提取效果较好，因此选用1:20作为提取时的料液比；流动相中通过比较分析乙腈-水，甲醇-水、乙腈-0.01％甲酸水、乙腈-0.05％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.15％甲酸水、乙腈-0.2％甲酸水，乙腈-0.01％乙酸水、乙腈-0.05％乙酸水、乙腈-0.1％乙酸水、乙腈-0.15％乙酸水、乙腈-0.2％乙酸水，乙腈-0.01％磷酸水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.15％磷酸水、乙腈-0.2％磷酸水，通过比较其色谱图，认为乙腈-0.1％磷酸水的图谱效果较好，因此选用乙腈-0.1％磷酸水作为流动相；流速选用了最常使用的1.0ml/min；柱温考察了45℃、40℃、35℃、30℃、25℃，五个不同温度，结果表明当柱温为30℃时，所得图谱的分离度、峰形、保留时间等都达到了较好的效果，因此选定30℃为柱温；对280nm、285nm、320nm、330nm进行了考察，结果表明，在330nm的波长下，被测成分的吸收最强，干扰最小，于是选择330nm为检测波长。

综上所述，本发明具有通过黑骨藤HPLC指纹图谱与含量测定，能同时测定4种咖啡酰基奎宁酸类化学成分含量，不同产地之间该4种成分有较大的差异，各成分含量与产地有一定的关联，为后期苗药黑骨藤质量标准研究奠定基础的有益效果。

附图说明

图1是本发明的27批黑骨藤样品指纹图谱叠加图；

图2是本发明的黑骨藤对照指纹图谱；

图3是本发明的聚类分析树状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例。一种苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法，构成如图1-3所示，包括有以下步骤：

a、供试品溶液的制备：将黑骨藤粉碎过24目筛，粉末置干燥器中保存，精密称取黑骨藤粉末1.000g，置50mL具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20mL，称定重量，采用功率200W，频率40KHz进行超声提取30min，待冷却至室温后，用50％甲醇补足超声过程中损失的重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

b、对照品溶液的制备：分别精密称取新绿原酸5.00mg、绿原酸5.04mg、隐绿原酸5.00mg、异绿原酸C 5.03mg，分别置于5mL的容量瓶中，以0.1％的磷酸水和乙腈溶液使之充分溶解，(其中0.1％的磷酸水和乙腈溶液中0.1％的磷酸水与乙腈溶液的体积比为92:8)，定容，配制成浓度分别为新绿原酸1.00mg/mL、绿原酸1.008mg/mL、隐绿原酸1.00mg/mL、异绿原酸C 1.006mg/mL的对照品溶液，备用；

混合对照品溶液的配制：分别精密量取2mL的新绿原酸对照品溶液、5mL的绿原酸对照品溶液、2mL的隐绿原酸对照品溶液、2mL的异绿原酸C对照品溶液置于25mL容量瓶中，用75％的甲醇定容至刻度线，则混合对照品中4种成分的浓度分别为：新绿原酸0.08mg/mL、绿原酸0.2016mg/mL、隐绿原酸0.08mg/mL、异绿原酸C 0.0805mg/mL；

c、将供试品溶液和混合对照品溶液分别进行液相色谱进样测定，将色谱对比后，并分别计算出试品溶液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸的含量；

d、将供试品溶液按进行梯度洗脱，记录HPLC色谱图，并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012)软件，计算相似度。

所述步骤c和d中的色谱条件为：

色谱柱:XtimateC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)；流动相为0.1％磷酸水(A)-乙腈(B)，按流动相进行梯度洗脱；检测波长为330nm；柱温为30℃；流速为1mL/min；进样量为10μL；

流动相：

Claims (1)

1.一种苗药黑骨藤HPLC指纹图谱研究及多成分含量测定方法，其特征在于：包括有以下步骤：

a、供试品溶液的制备：将黑骨藤粉碎过24目筛，粉末置干燥器中保存，精密称取黑骨藤粉末1.000g，置50mL具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20mL，称定重量，采用功率200W，频率40KHz进行超声提取30min，待冷却至室温后，用50％甲醇补足超声过程中损失的重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

b、对照品溶液的制备：分别精密称取新绿原酸5.00mg、绿原酸5.04mg、隐绿原酸5.00mg、异绿原酸C 5.03mg，分别置于5mL的容量瓶中，加入0.1％磷酸水与乙腈的体积比为92:8的溶液使之充分溶解，定容，配制成浓度分别为新绿原酸1.00mg/mL、绿原酸1.008mg/mL、隐绿原酸1.00mg/mL、异绿原酸C1.006mg/mL的对照品溶液，备用；

混合对照品溶液的配制：分别精密量取2mL的新绿原酸对照品溶液、5mL的绿原酸对照品溶液、2mL的隐绿原酸对照品溶液、2mL的异绿原酸C对照品溶液置于25mL容量瓶中，用75％的甲醇定容至刻度线，则混合对照品中4种成分的浓度分别为：新绿原酸0.08mg/mL、绿原酸0.2016mg/mL、隐绿原酸0.08mg/mL、异绿原酸C 0.0805mg/mL；

c、将供试品溶液和混合对照品溶液分别进行液相色谱进样测定，将色谱对比后，并分别计算出试品溶液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸的含量；色谱条件为：

色谱柱:规格为4.6mm×250mm,5μm的XtimateC₁₈；流动相为0.1％磷酸水-乙腈，其中0.1％磷酸水为A相，乙腈为B相，按流动相进行梯度洗脱；检测波长为330nm；柱温为30℃；流速为1mL/min；进样量为10μL；

流动相：

d、将供试品溶液按色谱条件进行梯度洗脱，记录HPLC色谱图，并导入2012年版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，计算相似度。

Images