CN111650308B - 一种金钗石斛花的hplc指纹图谱构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种黔产道地金钗石斛花HPLC指纹图谱的构建方法，包括供试品溶液的制备，色谱条件的选择，并用高效液相色谱仪进行检测，得到黔产金钗石斛花的指纹图谱。其中色谱条件为：色谱柱为AgilentSB‑C18(250×4.6mm，5μm)，以乙腈‑0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为254nm，流速为0.8m L/min，柱温：30℃，进样量10μL，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对样品指纹图谱进行分析，确定26个共有峰,并指认了其中D‑无水葡萄糖成分，得到黔产金钗石斛花HPLC指纹图谱。所建立的黔产金钗石斛花HPLC指纹图谱特征性强、稳定性高、整体性好，能广泛应用于黔产金钗石斛花的质量控制和真伪鉴别。

Description

一种金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法
技术领域
本发明涉及黔产金钗石斛花的质量分析领域，具体涉及黔产金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法。
背景技术
金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)为兰科石斛属多年生附生草本植物，以新鲜或干燥茎入药，其主要有效成分多为多糖、生物碱等物质，有生津益胃，清热养阴的功效。贵州赤水是金钗石斛的道地产区，采用仿野生栽培技术的金钗石斛，获得了石斛类国家地理标志保护产品。金钗石斛花中含有多种生物活性成分，多糖、黄酮、挥发油等，有润肺、增强免疫力、抗衰老等作用，常用作茶饮和保健佳品。长期以来，金钗石斛的研究主要集中在茎上，目前对于金钗石斛花的HPLC指纹图谱研究未见文献报道。而市场上金钗石斛花存在真伪混杂、产品质量难以保证等问题。为进一步鉴别金钗石斛花的真伪及控制黔产金钗石斛花的质量，本发明以黔产金钗石斛花为研究对象，首次建立了黔产金钗石斛花的HPLC指纹图谱，建立的金钗石斛花HPLC指纹图谱特征性强、稳定性高，整体性好，能广泛应用于黔产金钗石斛花的质量控制和真伪鉴别。
发明内容
本发明的目的在于提供金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，以通过建立特征性强、稳定性高，整体性好的金钗石斛花HPLC指纹图谱，应用于黔产金钗石斛花的质量控制和真伪鉴别。
黔产金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法包括如下步骤：
步骤(1)：供试品溶液的制备：取金钗石斛花粉末0.4g于锥形瓶中，加入甲醇溶液20mL，超声处理120min，冷却至室温，过滤并取滤液于蒸发皿中，在水浴锅上以50℃以下低温蒸干，残渣加甲醇溶液2mL溶解，移至2mL容量瓶中，加甲醇溶液定容，摇匀即得供试品溶液；
步骤(2)：确定色谱条件：色谱柱为Agilent SB-C18(250×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，检测波长：254nm；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10uL。
步骤(3)：进行方法学考察；
步骤(4)：指纹图谱建立及分析：按步骤(1)制备多个批次的金钗石斛花的供试品溶液，将各供试品溶液标定为S1、S2……Sn；将各供试品按步骤(2)的色谱条件进行检测，将得到的图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)进行分析，建立黔产金钗石斛花的HPLC指纹图谱。
优选方案一：作为对基础方案的进一步优化，还包括步骤(3)，流动相梯度洗脱程序具体比例如下设置：0.01～30min，5％-6％A；30～35min，6％-8％A；35～69min，8％-9％A；69～71min，9％-15％A；71～116min，15％-15.5％A；116～118min，15.5％-32％A；118～127min，32％-38％A；127～131min，38％-50％A；131～135min，50％-80％A；135～138min，80％-100％A。
优选方案二：作为对基础方案的进一步优化，所述步骤(3)中，包括精密度考察：精密称定同一样品粉末，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(2)下色谱条件检测，连续进样6次，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的23号色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD应为0.00％～2.62％和0.00％～0.90％。
优选方案三：作为对优选方案一的进一步优化，所述步骤(3)中，包括稳定性考察：精密称定同一样品粉末，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(3)下色谱条件检测，分别在0h、4h、8h、12h、24h、48h进样，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD应为0.00％～2.69％和0.00％～0.90％。
优选方案四：作为对优选方案二的进一步优化，所述步骤(3)中，包括样品重复性考察：精密称定同一样品粉末6份，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(2)下色谱条件检测，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD应为0.00％～2.95％和0.00％～0.47％。
由于金钗石斛花在高效液相色谱仪内检测获得图谱，因此仪器本身的状态对获得的图谱的效果具有很大影响；且由于需要对多份金钗石斛花样品的图谱进行对比，需要向色谱仪反复进样，供试品本身的稳定性也将对图谱结果产生影响，为了避免金钗石斛图谱的获得受仪器因素的干扰，在优选方案二、三、四中，分别对仪器的精密度，分别是对仪器的精密度、稳定性和重复性进行考察，并通过标准偏差RSD值考察仪器的精密度、稳定性和重复性。
优选方案五：作为对基础方案的进一步优化，包括步骤(1.1)：对照品溶液的制备：取D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.2mg的溶液，即得；将对照品溶液按步骤(2)的色谱条件进行检测，得到D-无水葡萄糖对照品HPLC图谱；
所述步骤(4)，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件，对12个不同批次黔产金钗石斛花样品的供试品溶液的HPLC图谱进行分析，将峰面积较大、分离度较好的色谱峰进行标定，确定26个主要特征峰作为共有峰，将供试品溶液的HPLC图谱与D-无水葡萄糖对照品HPLC图谱对比，指认其中26号峰为D-无水葡萄糖，12个批次的金钗石斛花样品供试品溶液的保留时间分别为：1号(5.080min)，2号(9.502min)，3号(14.168min)，4号(15.479min)，5号(21.606min)，6号(26.502min)，7号(43.082min)，8号(45.393min)，9号(47.405min)，10号(52.640min)，11号(53.879min)，12号(57.850min)，13号(60.378min)，14号(62.318min)，15号(63.691min)，16号(67.302min)，17号(71.014min)，18号(78.228min)，19号(79.164min)，20号(80.950min)，21号(81.867min)，22号(91.847min)，23号(94.598min)，24号(97.585min)，25号(126.604min)，26号(132.731min)。12批黔产金钗石斛花样品的相似度均为0.9以上，表明黔产金钗石斛花药材质量稳定，差别较小；且本方法首次建立了黔产金钗石斛花的HPLC指纹图谱。
附图说明
图1为黔产金钗石斛花HPLC指纹图谱；
图2为D-无水葡萄糖对照品HPLC图谱；
图3为12批次金钗石斛花HPLC指纹图谱；
图4为检测波长为220nm条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图5为检测波长为254nm条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图6为检测波长为270nm条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图7为检测波长为330nm条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图8为以柱温为25℃条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图9为以柱温为28℃条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图10为以柱温为30℃条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图11为以流速为0.8ml/min条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图12为以流速为1.0ml/min条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图13为以甲醇为提取溶剂条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图14为以乙醇为提取溶剂条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图15为以30％甲醇溶液为提取溶剂条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图16为以50％甲醇溶液为提取溶剂条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图17为以80％甲醇溶液为提取溶剂条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图18为超声波提取时间为60min时金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图19为超声波提取时间为90min时金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图20为超声波提取时间为120min时金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图21为以甲醇-水为流动相的条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图22为以乙腈-水为流动相的条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图23为以乙腈-0.1％磷酸水为流动相的条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
图24为以乙腈-0.1％冰醋酸水为流动相的条件下金钗石斛花的HPLC指纹图谱。
具体实施方式
实施例一：
金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)，供试品溶液制备：取金钗石斛花粉末0.4g于锥形瓶中，加入甲醇溶液20mL，超声处理120min，冷却至室温，过滤并取滤液于蒸发皿中，在水浴锅上以50℃以下低温蒸干，残渣加甲醇溶液2mL溶解，移至2mL容量瓶中，加甲醇溶液定容，摇匀即得供试品溶液。
步骤(2)：对照品溶液的制备：取D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.2mg的溶液，即得。
步骤(3)，确定色谱条件：色谱柱为Agilent SB-C18(250×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(0.01～30min，5％-6％A；30～35min，6％-8％A；35～69min，8％-9％A；69～71min，9％-15％A；71～116min，15％-15.5％A；116～118min，15.5％-32％A；118～127min，32％-38％A；127～131min，38％-50％A；131～135min，50％-80％A；135～138min，80％-100％A)；检测波长：254nm；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10uL。
步骤(4)，进行方法学考察：
步骤(4.1)，精密度考察：精密称定同一样品粉末，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(3)下色谱条件检测，连续进样6次，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的23号色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD为0.00％～2.62％和0.00％～0.90％，表明仪器精密度良好。
步骤(4.2)，稳定性考察：精密称定同一样品粉末，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(3)下色谱条件检测，分别在0h、4h、8h、12h、24h、48h进样，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的23号色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD为0.00％～2.69％和0.00％～0.90％，表明样品在48h内稳定性良好。
步骤(4.3)，重复性考察：精密称定同一样品粉末6份，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(3)下色谱条件检测，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的23号色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD为0.00％～2.95％和0.00％～0.47％，表明该方法重复性良好。
步骤(5)，指纹图谱测定：按步骤(1)制定12个不同批次的金钗石斛花的供试品溶液各一份，将各供试品溶液标定为S1、S2……S12；将12份供试品溶液按步骤(3)的色谱条件进行检测，记录色谱图，并将所得的图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)进行分析，将峰面积较大、分离度较好的色谱峰进行标定，确定出26个主要特征峰，获得黔产金钗石斛花HPLC指纹图谱；
将对照品溶液按步骤(2)的色谱条件进行检测，得到D-无水葡萄糖对照品HPLC图谱；以对照品的HPLC图谱与供试品溶液的HPLC图谱进行比对，确认26号峰对应D-无水葡萄糖。即供试品溶液中含有D-无水葡萄糖成分，而26个特征峰对应26个不同的成分，说明黔产金钗石斛花中具有与26号特征峰对应的成分，从而使黔产金钗石斛花具有独特性，通过对黔产金钗石斛花该独特性进分析，这可辨别黔产金钗石斛花的真伪。
确定出的26个金钗石斛花样品的HPLC指纹图谱的特征峰对应的保留时间分别为：1号(5.080min)，2号(9.502min)，3号(14.168min)，4号(15.479min)，5号(21.606min)，6号(26.502min)，7号(43.082min)，8号(45.393min)，9号(47.405min)，10号(52.640min)，11号(53.879min)，12号(57.850min)，13号(60.378min)，14号(62.318min)，15号(63.691min)，16号(67.302min)，17号(71.014min)，18号(78.228min)，19号(79.164min)，20号(80.950min)，21号(81.867min)，22号(91.847min)，23号(94.598min)，24号(97.585min)，25号(126.604min)，26号(132.731min)。
上述步骤中，所用仪器设备、试剂如下：
仪器：LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津)、超声机(上海乔跃电子有限公司，JOYN-10A)、水浴锅(上海双捷实验设备有限公司，DRHH-S8)、电热恒温鼓风干燥箱(上海博讯公司，GZX-9070MBE)、万分之一天平(梅特勒-托利多上海有限公司，ME204E)、SHB-111循环水式多用真空泵。
试剂：乙腈(色谱纯，TEDIA天地试剂公司)，甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)，D-无水葡萄糖(中国食品药品检定研究院，批号110833-201506)；实验用水均为娃哈哈纯净水。
上述步骤中，所用的12批次的金钗石斛花样品来源见表1。
表1金钗石斛花样品来源
Figure BDA0002582139720000061
Figure BDA0002582139720000071
上述步骤中，D-无水葡萄糖对照品HPLC图谱见图2，12批金钗石斛花HPLC指纹图谱见图3，其指纹图谱的相似度对比结果见表2。
表2 12批金钗石斛花样品指纹图谱相似度对比结果
Figure BDA0002582139720000072
本法对黔产金钗石斛花进行了HPLC指纹图谱方法学的构建，采用梯度洗脱方法在138min内获得了较好分离效果的特征图谱，确定26个主要特征峰作为共有峰，首次建立了黔产金钗石斛花的HPLC指纹图谱。该图谱能够使金钗石斛花中多数化学成分分离，特征性较强，可以较全面的反映金钗石斛花的化学成分信息。12批黔产金钗石斛花指纹图谱相似度为0.985～0.998，均达到了0.9以上，说明黔产金钗石斛花的整体性化学成分特征相似。本法所建立的黔产金钗石斛花HPLC指纹图谱具有较强的特征性，可用于鉴别黔产金钗石斛花的真伪及质量控制。
对比例一：
按实施例一步骤(1)制定同一批次金钗石斛花样品的供试品溶液1份；
在实施例一步骤(2)的基础上，改变步骤(2)中设定的检测波长，分别将检测波长设定为220nm、254nm、270nm、330nm；其他条件不变。
将同一份供试品溶液按步骤(2)分别在检测波长220nm、254nm、270nm、330nm的色谱条件进行检测，获得对应的指纹图谱，指纹图谱如图4、图5、图6、图7所示。
对比例一中，通过对比220、254、270、330nm波长下的指纹图谱的色谱峰检测情况，可以看出254nm处出现的色谱峰较多，主要的色谱峰能分离开且峰型较好，因此优选254nm作为检测波长。
对比例二：
按实施例一步骤(1)制定同一批次金钗石斛花样品的供试品溶液1份；
在实施例一步骤(2)的基础上，改变步骤(2)中设定的检测温度，分别将柱温设定为25℃、28℃、30℃；其他条件不变。
将同一份供试品溶液按步骤(2)分别在柱温为25℃、28℃、30℃的色谱条件进行检测，获得对应的指纹图谱，指纹图谱如图8、图9、图10所示。
对比例二中，通过对比25℃、28℃、30℃温度下的指纹图谱的色谱峰检测情况，可以看出柱温为30℃时，图谱基线较平稳，色谱峰峰高，峰面积较大，因此优选30℃作为检测温度。
对比例三：
按实施例一步骤(1)制定同一批次金钗石斛花样品的供试品溶液1份；
在实施例一步骤(2)的基础上，改变步骤(2)中设定的流速，分别将流速为0.8m L/min、1.0m L/min；其他条件不变。
将同一份供试品溶液按步骤(2)分别在流速为0.8m L/min、1.0m L/min的色谱条件进行检测，获得对应的指纹图谱，指纹图谱如图11、图12所示。
对比例三中，通过对比0.8m L/min、1.0m L/min流速下的指纹图谱的色谱峰检测情况，可以看出流速为0.8m L/min时，可以使主要的色谱峰都能分离开且峰型较好，故选择流速为0.8m L/min。
对比例四：
在实施例一步骤(1)的基础上，改变提取溶剂，其他条件不变，分别进行供试品溶液制备；分别以甲醇、乙醇、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇作为提取溶剂，制定同一批次金钗石斛花样品的供试品溶液5份；
将5份供试品溶液按实施例一步骤(2)的色谱条件分别进行检测，获得对应的指纹图谱，指纹图谱如图13、图14、图15、图16、图17所示。
对比例四中，对比以甲醇、乙醇、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇作为提取溶剂所获得的指纹图谱的色谱峰检测情况，可以看出以甲醇作为提取溶剂制备的供试品溶液进行检测得到的图谱的基线平稳，色谱峰较多且峰高、峰面积较大，因此优选甲醇作为提取溶剂。
对比例五：
在实施例一步骤(1)的基础上，改变超声处理时间，其他条件不变，分别进行供试品溶液制备；分别将超声波提取时间设定为60min、90min和120min，制定同一批次金钗石斛花样品的供试品溶液3份；
将3份供试品溶液按实施例一步骤(2)的色谱条件分别进行检测，获得对应的指纹图谱，指纹图谱如图18、图19、图20所示。
对比例五中，对比超声处理时间在60min、90min和120min下所获得的指纹图谱的色谱峰检测情况，可以看出对超声处理时间在120min条件下制备的供试品溶液进行检测所得到的图谱的色谱峰较多，峰面积较大，因此优选超声处理时间为120min。
对比例六：
按实施例一步骤(1)制定同一批次金钗石斛花样品的供试品溶液1份；
在实施例一步骤(2)的基础上，改变步骤(2)中设定的流动相，分别将流动相设定为甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％冰醋酸水；其他条件不变。
将同一份供试品溶液按步骤(2)分别在流动相为甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％冰醋酸水的色谱条件进行检测，获得对应的指纹图谱，指纹图谱如图21、图22、图23、图24所示。
对比例六中，通过对比流动相为甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％冰醋酸水条件下的指纹图谱的色谱峰检测情况，可以看出以乙腈-0.1％磷酸水作为流动相处所检测的色谱的基线较稳，分离度较好，因此优选乙腈-0.1％磷酸水作为流动相。

Claims (4)

1.金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：供试品溶液的制备：取金钗石斛花粉末0.4g于锥形瓶中，加入甲醇溶液20mL，超声处理120min，冷却至室温，过滤并取滤液于蒸发皿中，在水浴锅上以50℃以下低温蒸干，残渣加甲醇溶液2mL溶解，移至2mL容量瓶中，加甲醇溶液定容，摇匀即得供试品溶液；
步骤(1.1)：对照品溶液的制备：取D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.2mg的溶液，即得；
步骤(2)：确定色谱条件：采用尺寸250×4.6mm、粒径5μm的Agilent SB-C18色谱柱，流动相：乙腈A-0.1％磷酸水溶液B，检测波长：254nm；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10uL；流动相梯度洗脱程序的比例按如下设置：0.01～30min，5％-6％A；30～35min，6％-8％A；35～69min，8％-9％A；69～71min，9％-15％A；71～116min，15％-15.5％A；116～118min，15.5％-32％A；118～127min，32％-38％A；127～131min，38％-50％A；131～135min，50％-80％A；135～138min，80％-100％A；
步骤(3)：进行方法学考察；
步骤(4)：指纹图谱建立及分析：按步骤(1)制备多个批次的金钗石斛花的供试品溶液，将各供试品溶液标定为S1、S2……Sn；将各供试品按步骤(2)的色谱条件进行检测，将得到的图谱导入2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，建立金钗石斛花的HPLC指纹图谱；
将对照品溶液按步骤(2)的色谱条件进行检测，得到D-无水葡萄糖对照品HPLC图谱；
对12个不同批次黔产金钗石斛花样品的供试品溶液的HPLC图谱进行分析，将峰面积较大、分离度较好的色谱峰进行标定，确定26个主要特征峰作为共有峰，将供试品溶液的HPLC图谱与D-无水葡萄糖对照品HPLC图谱对比，指认其中26号峰为D-无水葡萄糖，12个批次的金钗石斛花样品供试品溶液26个特征峰对应的保留时间分别为：1号保留时间为5.080min，2号保留时间为9.502min，3号保留时间为14.168min，4号保留时间为15.479min，5号保留时间为21.606min，6号保留时间为26.502min，7号保留时间为43.082min，8号保留时间为45.393min，9号保留时间为47.405min，10号保留时间为52.640min，11号保留时间为53.879min，12号保留时间为57.850min，13号保留时间为60.378min，14号保留时间为62.318min，15号保留时间为63.691min，16号保留时间为67.302min，17号保留时间为71.014min，18号保留时间为78.228min，19号保留时间为79.164min，20号保留时间为80.950min，21号保留时间为81.867min，22号保留时间为91.847min，23号保留时间为94.598min，24号保留时间为97.585min，25号保留时间为126.604min，26号保留时间为132.731min。
2.根据权利要求1所述的金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，包括精密度考察：精密称定同一样品粉末，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(2)下色谱条件检测，连续进样6次，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的23号色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD应为0.00％～2.62％和0.00％～0.90％。
3.根据权利要求2所述的金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，包括稳定性考察：精密称定同一样品粉末，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(3)下色谱条件检测，分别在0h、4h、8h、12h、24h、48h进样，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD应为0.00％～2.69％和0.00％～0.90％。
4.根据权利要求3所述的金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，包括样品重复性考察：精密称定同一样品粉末6份，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(2)下色谱条件检测，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD应为0.00％～2.95％和0.00％～0.47％。
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