CN114487242B - 鸡内金和/或醋鸡内金及制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法 - Google Patents

鸡内金和/或醋鸡内金及制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药检测技术领域，具体提供了鸡内金和/或醋鸡内金及制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法，所述构建方法构建得到的特征图谱中含有11个共有特征峰，显著提升了特征峰的数量，而且准确指认了其中的尿苷峰、鸟苷峰、尿嘧啶峰和腺苷峰，因此构建方法能够有效提升鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂特征图谱的精确度，能够充分反应鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的整体性和特征性，这有利于更加全面地监控鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的质量。

Description

鸡内金和/或醋鸡内金及制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，具体涉及一种鸡内金和/或醋鸡内金及制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法。
背景技术
鸡内金，是鸡胃内的角质层，为常用中药，始载于《神农本草经》(禽)上品丹雄鸡项下，2020年版《中华人民共和国药典》将其收载为雉科动物家鸡Gallus gallus domesticusBrisson的干燥沙囊内壁。其味甘，性平，归属脾、胃、小肠、膀胱经，具有健胃消食、涩精止遗、通淋化石的功效，常用于治疗呕吐、腹泻、小儿囤积、遗尿、遗精、石滴痛、胆道忧郁症等疾病。
2020年版《中华人民共和国药典》中，鸡内金药材质量标准仅包括性状、检查(水分、总灰分)和浸出物等检查项，但是并无关于其鉴别、含量测定的检查项，不能实现对鸡内金产品整体质量进行准确描述和评价。作为一味应用历史悠久的药食两用中药，前人对鸡内金的化学组成、药理作用和临床应用开展了许多研究。但是鉴于其化学成分复杂，目前还未见到详细的文献报道揭示其具体有效成分。
现有针对鸡内金的质量研究主要集中在蛋白质、多糖、酶、氨基酸等成分，例如：刘其凤等对鸡内金进行了提取与简单的分析，发现其碱提取物中蛋白质含量约占60％，而其中呈现氨基糖阳性反应的占10％左右，因此初步认为鸡内金中有效成分可能主要是糖蛋白类物质(参见刘其凤等，《鸡内金蛋白类成分的提取与测定》，华西药学杂志，2004，19(4)：281-282)；孙颖等对鸡内金的淀粉酶进行了理化性质研究(参见孙颖等，《鸡内金淀粉酶理化特征研究》，中国中医药信息杂志，2007，14(4)：46-48)；陆维承、李传俊、吕武清等人对不同鸡内金炮制品的酶活力进行测定比较，用来确定鸡内金的最佳炮制辅料及炮制方法(参见陆维承等，《不同炮制工艺对鸡内金中淀粉酶活力的影响》，海峡药学，2010，22(4)：35-36；李传俊等，《鸡内金不同辅料炮制品的酶活性和氨基酸的含量测定》，中国现代医生，2009，47(15)：74-75；吕武清等，《炮制对鸡内金中酶和氨基酸的影响》，中国中药杂志，1994，19(4)：222-223)；梁琨等通过柱前衍生化RP-HPLC测定鸡内金中16种氨基酸的含量(参见梁琨等，《柱前衍生化RP-HPLC测定鸡内金中16种氨基酸的含量》，中国中药杂志，2014，39(8)：1463-1467)。
《上海市中药配方颗粒质量标准-鸡内金配方颗粒》建立了鸡内金配方颗粒特征图谱及含量测定的相关标准，该标准中的方法有效分离的成分较少，分离效果较差，构建的特征图谱的特征峰数量较少，不能全面监控鸡内金产品的质量。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中鸡内金产品质量标准中相关特征图谱因分离度较低而不能全面监控鸡内金产品的质量的缺陷，从而提供一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱及其构建方法和鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的含量测定方法。
为此，本发明提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：(1)制备供试品溶液，供试品选自鸡内金、鸡内金制剂、醋鸡内金或醋鸡内金制剂中的任意一种；(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0min→13min→15min→55min→60min，流动相中甲醇的体积百分比为0％→5％→10％→60％→60％，流动相流速为1.0ml/min→0.5ml/min→0.8ml/min→1.0ml/min→1.0ml/min。
作为特征图谱方法流动相百分比和流速影响均比较大，超出上述范围相对保留时间RSD值较大，不符合要求。
根据本发明任一项所述的构建方法，步骤(1)包括：取供试品，加溶剂，经提取、固液分离，取液体，得到所述供试品溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法，步骤(1)还满足如下A～D中的至少一项：A、所述溶剂选自水或者甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不大于30％，优选不大于10％；B、相对于1g所述供试品，所述溶剂的加入量为30～100ml；C、所述提取的方式为振摇提取、超声提取或回流提取中的一种，优选地，供试品在提取前经研磨或粉碎处理得到粉末；D、所述提取的时间不低于20min，优选为40～60min。
根据本发明任一项所述的构建方法，步骤(1)可以包括：取本品粉末0.3～1.0g，加溶剂30～100ml，超声提取至少20min，取出放冷，称定，加溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
根据本发明任一项所述的构建方法，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还可以包括：检测波长为250～260nm，柱温为33～37℃，进样量为5～15μl。
根据本发明任一项所述的构建方法，步骤(2)中，所述磷酸水溶液中所含磷酸的体积百分数为0.1～0.2％，优选为0.2％。
某些优选的实施方式中，所述构建方法还包括采用尿嘧啶对照品、尿苷对照品、腺苷对照品或鸟苷对照品制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一项所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤。
某些优选的实施方式中，所述构建方法还包括采用鸡内金对照药材或醋鸡内金对照饮片制备对照药材溶液的步骤，以及按照上述任一项所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材溶液得到对照药材参照图谱的步骤。
根据本发明任一项所述的构建方法，鸡内金及制剂选自鸡内金药材、鸡内金饮片和鸡内金制剂中的至少一种，醋鸡内金及制剂选自醋鸡内金饮片和/或醋鸡内金制剂。其中，鸡内金制剂或醋鸡内金制剂是由鸡内金或醋鸡内金提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。
优选地，鸡内金制剂或醋鸡内金制剂可以选自但不局限于干粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软膏剂、溶液剂等制剂。
更优选地，本发明提供的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱的构建方法，可以同时适用于鸡内金药材、鸡内金饮片、醋鸡内金饮片、鸡内金配方颗粒和醋鸡内金配方颗粒的特征图谱的构建。
核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成成分，参与DNA代谢过程，尤其对机体的免疫系统、代谢系统、神经系统及心血管系统等有着很强的调节作用，是改善人类健康和预防疾病的重要组成成分之一，对于鸡内金中核苷类物质的研究尚未见报道。核苷类成分对机体的调节作用与鸡内金的健胃消食、调节血脂水平、调节内分泌生殖系统、改善心肌缺血等药理作用相呼应，因此核苷类成分在鸡内金中可能发挥着重要作用。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述对照品溶液的制备方法可以包括如下步骤：取尿嘧啶对照品、尿苷对照品、腺苷对照品或鸟苷对照品，分别加溶剂制成四种每1ml含尿嘧啶3～8μg、尿苷4～12μg、腺苷3～8μg、鸟苷7～20μg的对照品溶液。优选地，所述溶剂选自水或者甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不大于30％。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述对照药材溶液的制备方法可以包括如下步骤：取鸡内金对照药材或醋鸡内金对照饮片1～2g，加溶剂30～45ml，煎煮30～50min，取出放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
本发明还提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱，由上述任一项所述的构建方法得到。
本发明还提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱，所述特征图谱的特征峰至少包括尿苷峰和鸟苷峰，优选地，所述特征图谱的特征峰至少包括尿苷峰、鸟苷峰、尿嘧啶峰和腺苷峰。
本发明还提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱，所述特征图谱的特征峰包括11个特征峰，1号峰为尿嘧啶峰，3号峰为尿苷峰，4号峰为腺苷峰，5号峰为鸟苷峰，2号峰以及6号峰～11号峰为共有峰。
本发明还提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱，所述特征图谱的特征峰包括11个特征峰，以5号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内；规定值为：0.44(峰2)、1.08(峰6)、2.27(峰7)、2.51(峰8)、2.55(峰9)、3.03(峰10)、3.25(峰11)。
本发明还提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱，所述对照特征图谱包括11个对照特征峰，5号峰为鸟苷峰，以鸟苷峰为对照参比峰，各对照特征峰与对照参比峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内；规定值为：0.44(峰2)、1.08(峰6)、2.27(峰7)、2.51(峰8)、2.55(峰9)、3.03(峰10)、3.25(峰11)。
本发明还提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱，所述对照特征图谱是使用单批次或多批次供试品按照上述任一项所述的构建方法得到的特征图谱。
本发明还提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱，所述对照特征图谱是使用多批次供试品按照上述任一项所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或中位数法制成对照特征图谱。
示例性地，至少3批供试品构建所述对照特征图谱，例如使用1批鸡内金药材、3批鸡内金配方颗粒、1批醋鸡内金饮片和3批醋鸡内金配方颗粒构建所述对照特征图谱。
本发明还提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的含量测定方法，包括如下测定步骤：取供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0min→13min→15min→55min→60min，流动相中甲醇的体积百分比为0％→5％→10％→60％→60％，流动相流速为0.9～1.1ml/min→0.4～0.6ml/min→0.7～0.9ml/min→0.9～1.1ml/min→0.9～1.1ml/min；其中，供试品选自鸡内金、鸡内金制剂、醋鸡内金或醋鸡内金制剂中的任意一种，对照品包括尿苷对照品和/或鸟苷对照品。
作为含量测定方法，流速在上述范围内尿苷和鸟苷含量RSD值均符合要求。
作为具体的实施方式，所述供试品溶液可以按照本发明任一项所述的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂特征图谱的构建方法中的步骤(1)的方法制得；所述测定步骤可以按照本发明任一项所述的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂特征图谱的构建方法中的步骤(2)的方法执行。
本发明还提供了本发明任一项所述的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂特征图谱的构建方法，和/或本发明的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱，和/或本发明的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱，和/或本发明任一项所述的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的含量测定方法在鸡内金产品和/或醋鸡内金产品的质量检测中的应用。
本发明还提供了一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的质量检测方法，包括将待测鸡内金产品和/或醋鸡内金产品的特征图谱与鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱进行比对的步骤；和/或，包括按照本发明任一项所述的含量测定方法测定待测鸡内金产品和/或醋鸡内金产品中尿苷含量和鸟苷含量的步骤；其中，所述待测鸡内金产品和/或醋鸡内金产品的特征图谱为使用待测鸡内金产品和/或醋鸡内金产品本发明上述任一项所述的构建方法得到，所述鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱为本发明所述的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱。
根据本发明所述的质量检测方法，鸡内金产品选自鸡内金药材、鸡内金饮片和鸡内金制剂中的至少一种，醋鸡内金产品选自醋鸡内金饮片和/或醋鸡内金制剂。其中，鸡内金制剂或醋鸡内金制剂是由鸡内金或醋鸡内金提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。优选地，鸡内金制剂或醋鸡内金制剂可以选自但不局限于干粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软膏剂、溶液剂等制剂。更优选地，鸡内金产品选自鸡内金药材、鸡内金饮片和鸡内金配方颗粒中的至少一种，醋鸡内金产品选自醋鸡内金饮片和/或醋鸡内金配方颗粒。
某些实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱。
某些优选的实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱的构建方法，构建得到的特征图谱中含有11个共有特征峰，显著提升了特征峰的数量，而且准确指认了其中的尿苷峰、鸟苷峰、尿嘧啶峰和腺苷峰，因此构建方法能够有效提升鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂特征图谱的精确度，能够充分反应鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的整体性和特征性，这有利于更加全面地监控鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的质量。
2.本发明提供的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，经过大量实验筛选得到特定的洗脱程序，且仅使用一个洗脱程序即可得到11个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，各特征峰峰形好、各特征峰之间分离度高，且能够准确定位尿苷峰、鸟苷峰、尿嘧啶峰和腺苷峰的峰位置，为鸡内金产品和醋鸡内金产品的质量检测和控制提供了依据。
3.本发明提供的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱的构建方法，通过优化提取方式，特别是优化了提取溶剂，确定了最佳提取工艺，能够较全面且足量地提取出供试品中的特征成分，例如能够提取出与尿苷含量相当的鸟苷，这能够进一步提升鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂特征图谱的精确度，能够更加全面地监控鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的质量。
4.本发明提供的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的含量测定方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，经大量实验筛选得到特定的洗脱程序，在该梯度下可准确地测定鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂中有效成分即尿苷和鸟苷的含量，醋鸡内金及其制剂在1.0603～21.2060μg/ml范围内线性满足分析要求，鸡内金及其制剂在1.5145～37.8631μg/ml范围内线性满足分析要求，定量限低，且具有重现性好、稳定性好、准确度高、分析速率快的优点。
5.本发明提供的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的质量检测方法，包括特征图谱构建方法和尿苷、鸟苷含量测定方法，方法操作简单，精密度高、稳定性好、重复性好、准确度高、分析速率快，能够全面、清楚、有效地对鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂进行质量检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1中方法一的梯度条件下的色谱图；
图2为本发明实验例1中方法二的梯度条件下254nm处的色谱图；
图3为本发明实验例1中方法二的梯度条件下360nm处的色谱图；
图4为本发明实验例1中方法三的梯度条件下254nm处的色谱图；
图5为本发明实验例1中方法三的梯度条件下280nm处的色谱图；
图6为本发明实验例1中方法四的梯度条件下的色谱图；
图7为本发明实验例1中醋鸡内金配方颗粒延迟性实验色谱图；
图8为本发明实验例1中专属性实验空白溶剂色谱图；
图9为本发明实验例1中专属性实验尿苷对照品溶液色谱图；
图10为本发明实验例1中专属性实验尿嘧啶对照品溶液色谱图；
图11为本发明实验例1中专属性实验腺苷对照品溶液色谱图；
图12为本发明实验例1中专属性实验尿苷对照品溶液色谱图；
图13为本发明实验例1中专属性实验供试品溶液色谱图；
图14为本发明实验例1中特征峰确认实验的相关色谱图；
图15为本发明实验例1中随行对照药材测定实验的相关色谱图；
图16为本发明实验例1中色谱柱Waters
Figure BDA0003437393030000042
C18(4.6*250mm，5μm)对应的色谱图；
图17为本发明实验例1中色谱柱Waters Xselect HSS T3(4.6*250mm，5μm)对应的色谱图；
图18为本发明实验例1中色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm，5μm)对应的色谱图；
图19为本发明实验例1中相似度计算实验的相关色谱图；
图20为本发明实验例3中鸡内金配方颗粒延迟性实验色谱图；
图21为本发明实验例3中专属性实验空白溶剂色谱图；
图22为本发明实验例3中专属性实验尿苷对照品溶液色谱图；
图23为本发明实验例3中专属性实验尿嘧啶对照品溶液色谱图；
图24为本发明实验例3中专属性实验腺苷对照品溶液色谱图；
图25为本发明实验例3中专属性实验鸟苷对照品溶液色谱图；
图26为本发明实验例3中专属性实验供试品溶液色谱图；
图27为本发明实验例3中特征峰确认实验的相关色谱图；
图28为本发明实验例3中随行对照药材测定实验的相关色谱图；
图29为本发明实验例3中色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm，5μm)对应的色谱图；
图30为本发明实验例3中色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6*250mm，5μm)对应的色谱图；
图31为本发明实验例3中色谱柱Waters
Figure BDA0003437393030000041
C18(4.6*250mm，5μm)对应的色谱图；
图32为本发明实验例3中相似度计算实验的相关色谱图；
图33为本发明实施例1中测得的鸡内金药材特征图谱；
图34为本发明实施例2中测得的醋鸡内金饮片特征图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1
本实验例用于说明醋鸡内金配方颗粒特征图谱的构建方法。
1.仪器与试药：百分之一天平(型号JA1002，厂家为上海浦春计量仪器有限公司)；万分之一天平(型号ML204T，厂家为梅特勒·托利多仪器(上海)有限公司)；电子天平(型号MSA6 6S-OCE-DM，厂家为赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；高效液相色谱仪(型号Waters ACQUITY Arc，厂家为沃特世科技(上海)有限公司)；数控超声波清洗器(型号KQ-100DE，厂家为昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴振荡器(型号THZ-82，厂家为金坛市精达仪器制造有限公司)；色谱柱：Waters
Figure BDA0003437393030000051
C18(柱长250mm，柱内径4.6mm，粒径为5μm)、ZORBAX Eclipse Plus C18(柱长250mm，柱内径4.6mm，粒径为5μm)、Waters XselectHSS T3(柱长250mm，柱内径4.6mm，粒径为5μm)、ZORBAX SB-C18(柱长250mm，柱内径4.6mm，粒径为5μm)。
甲醇(色谱纯，批号：LOT 191614，厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；甲醇(分析纯，批号：20200107，厂家：国药集团化学试剂有限公司)；乙醇(分析纯，批号：20210114，厂家：天津市永大化学试剂有限公司)；磷酸(色谱纯，批号：LOT 190900，厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；水(蒸馏水，批号：20210113H，厂家：广州屈臣氏食品饮料有限公司)；醋鸡内金配方颗粒(批号：21007561、J2002390、18011561、21007021)，北京康仁堂药业有限公司提供；醋鸡内金对照饮片(批号：202104-4-10)，北京康仁堂药业有限公司提供；尿苷对照品(批号：110887-201803，纯度99.5％，厂家：中国食品药品检定研究院)；腺苷对照品(批号：110879-201703，纯度99.7％，厂家：中国食品药品检定研究院)；鸟苷对照品(批号：111977-201501，纯度93.6％，厂家：中国食品药品检定研究院)；尿嘧啶对照品(批号：100469-201302，纯度99.6％，厂家：中国食品药品检定研究院)。
醋鸡内金饮片采用鸡内金药材按照《中国药典》的方法制备。
醋鸡内金配方颗粒的制备方法如下：取醋鸡内金饮片适量，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏，加入糊精适量，干燥，再加入糊精适量，混匀，制粒，即得。
2.醋鸡内金配方颗粒特征图谱的构建
(1)对照品溶液的制备：分别取尿苷对照品、鸟苷对照品、尿嘧啶对照品和腺苷对照品适量，精密称定，加蒸馏水分别制成每1ml含6μg尿苷、10μg鸟苷、4μg尿嘧啶和4μg腺苷的对照品溶液。
(2)对照药材溶液的制备：取粗鸡内金对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加蒸馏水30ml，煎煮40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)供试品溶液的制备：取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(4)高效液相色谱法检测：以十八烷基硅烷键合硅胶为充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水为流动性B，按照表1进行梯度洗脱；检测波长为254nm，柱温为35℃。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定，即得。
表1 梯度洗脱表
Figure BDA0003437393030000052
得到醋鸡内金配方颗粒特征图谱，该特征图谱具有11个共有特征峰，其中1号峰为尿嘧啶峰，3号峰为尿苷峰，4号峰为腺苷峰，5号峰为鸟苷峰，以5号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间的比值为：0.44(峰2)、1.08(峰6)、2.27(峰7)、2.51(峰8)、2.55(峰9)、3.03(峰10)、3.25(峰11)。
3.实验方法优化
3.1流动相及洗脱梯度优化
方法一：醋鸡内金颗粒(批号：J2002390)研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，取续滤液，即得。
ZORBAX SB-C18(4.6*250mm，5μm)色谱柱，以(乙腈：水＝8：2)为流动性A，0.2％磷酸水为流动相B，按下表2中的洗脱梯度检测，检测波长为254nm；柱温35℃；流速0.8ml/min。结果见图1。
表2 方法一梯度洗脱表
Figure BDA0003437393030000061
方法二：取方法一中供试品溶液进行检测。
ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm，5μm)色谱柱，以乙腈为流动性A，0.2％磷酸水为流动相B，按下表3中的洗脱梯度检测，检测波长为254nm和360nm；柱温35℃；流速0.8ml/min。254nm处的检测结果结果见图2，360nm处的检测结果见图3。
表3 方法二梯度洗脱表
Figure BDA0003437393030000062
方法三：取方法一中供试品溶液进行检测。
ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm，5μm)色谱柱，以乙腈为流动性A，0.2％磷酸水为流动相B，按下表4中的洗脱梯度检测，检测波长为254nm和280nm；柱温35℃。254nm处的检测结果结果见图4，280nm处的检测结果见图5。
表4 方法三梯度洗脱表
Figure BDA0003437393030000063
方法四：醋鸡内金颗粒(批号：J2002390)，研细，取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm，5μm)色谱柱，以甲醇为流动性A，0.2％磷酸水为流动相B，按下表5中的洗脱梯度检测，检测波长为254nm；柱温35℃。检测结果见图6。
表5 方法四梯度洗脱表
Figure BDA0003437393030000064
小结：从图1-图6可以看出，方法四所得色谱图的峰形佳，各峰分离效果较好，因此确定该方法为醋鸡内金颗粒检测方法。
3.2系统适用性实验
重复检测5次本实验例第3.1项的方法四，以尿苷峰为参照，进行系统适用性实验，结果见表6。
表6 系统适用性实验结果表
Figure BDA0003437393030000065
Figure BDA0003437393030000071
小结：系统适用性结果符合《中国药典》2020版0512高效液相色谱法相关要求。
3.3延迟性实验
取醋鸡内金配方颗粒(批号：21007561)按照本实验例第2项步骤(3)制得供试品溶液，按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件进样，记录2倍流动相洗脱时间，结果见图7。
小结：从图7可以看出，在60分钟之后没有明显的滞后峰出现，说明此色谱方法符合分析要求。
4.特征图谱的构建与辨识
4.1专属性实验
取空白溶剂作为阴性对照，按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件进样，结果见图8；分别取尿苷、尿嘧啶、腺苷、鸟苷对照品溶液，按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件进样，结果分别见图9、10、11、12；取醋鸡内金配方颗粒供试品溶液，按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件进样，结果见图13。
小结：由图8-图13可以看出，空白溶剂对醋鸡内金配方颗粒特征图谱的检测无干扰，且醋鸡内金配方颗粒供试品中色谱峰分别与对照品溶液色谱峰相对应，表明此方法专属性良好。
4.2特征峰确认
分别取尿苷、尿嘧啶、腺苷和鸟苷对照品溶液以及按照本实验例第2项步骤(3)制得的醋鸡内金颗粒供试品溶液各10μl，按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件测定，对特征峰进行指认，结果见图14。在图14中，A为尿苷对照品溶液的色谱图，B为尿嘧啶对照品溶液的色谱图，C为腺苷对照品溶液的色谱图，D为鸟苷对照品溶液的色谱图，E为供试品溶液的色谱图。
4.3随行对照药材测定
取醋鸡内金对照饮片(202104-4-10)溶液，按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件进行检测，与本实验例4.2项测得的供试品溶液色谱图进行比对，结果见图15。在图15中。S1为对照药材溶液的色谱图，S2为供试品溶液的色谱图。
小结：由图15可以看出，醋鸡内金配方颗粒供试品色谱图中共呈现11个特征峰，与对照药材参照物中各特征峰的保留时间相对应，差异较小。其中，其中1号峰为尿嘧啶峰，3号峰为尿苷峰，4号峰为腺苷峰，5号峰为鸟苷峰，以5号峰为参比峰。
5.方法学考察
5.1重复性
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)6份，研细，分别按照本实验例第2项步骤(3)制备成供试品溶液，并按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。结果显示，6个重复性实验样品中，峰2及峰6～峰11的相对保留时间RSD值均为0.0％，表明本实验例方法的重复性较好。
5.2中间精密度
不同分析人员在不同时间利用另一台Waters e2695-2489高效液相色谱仪(UV检测器)进行中间精密度实验。取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)6份，研细，分别按照本实验例第2项步骤(3)制备成供试品溶液，并按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。结果显示，6个中间精密度实验样品中，峰2及峰6～峰11的相对保留时间RSD在0.0％～1.4％范围内，表明该特征图谱的精密度较好。与重复性样品进行比较，其中间精密度的相对保留时间RSD在0.0％～2.4％范围内，表明该特征图谱的中间精密度较好。
5.3耐用性考察
5.3.1稳定性实验
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)，研细，分别按照本实验例第2项步骤(3)制备成供试品溶液，并分别于0、2、4、6、8、12、24、36、48h按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。结果显示，经过考察48小时内溶液的稳定性发现，峰2及峰6～峰11的相对保留时间RSD值均为0.0％，表示该分析方法稳定性良好，供试品溶液在48小时内较稳定。
5.3.2不同流速考察
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)，研细，按照本实验例第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同流速(0.9、1.0、1.1ml/min)按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。结果显示，以不同流速测定时，峰2及峰6～峰11的相对保留时间的RSD值在0.0％～6.9％范围内，表示流速对该方法影响较大。
5.3.3不同柱温考察
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)，研细，按照本实验例第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同柱温(33、35、37℃)按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。结果显示，以不同柱温测定时，峰2及峰6～峰11的相对保留时间的RSD值在0.0％～3.0％范围内，表示该分析方法在柱温33～37℃范围内具有良好的耐用性。
5.3.4不同色谱柱考察
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)，研细，按照本实验例第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同色谱柱下按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。色谱柱Waters
Figure BDA0003437393030000081
C18(4.6*250mm，5μm)对应的色谱图见图16，色谱柱Waters Xselect HSS T3(4.6*250mm，5μm)对应的色谱图见图17，色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm，5μm)对应的色谱图见图18。
结果显示，采用不同色谱柱测定时，峰2及峰6～峰11的相对保留时间的RSD值在0.0％～13.5％范围内，说明不同型号的色谱柱对该方法影响较大。由图16-图18可以看出，由ZORBAX Eclipse Plus C18型号色谱柱测出的色谱图中各色谱峰分离度高、峰形好，因此确定采用ZORBAX Eclipse Plus C18型号色谱柱。
6.样品测定
6.1醋鸡内金颗粒检测
取三批醋鸡内金颗粒，研细，按照本实验例第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别按照本实验例第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。结果显示，峰2及峰6～峰11的相对保留时间的RSD值在0.0％～0.1％范围内，差异很小，符合质量控制要求。
6.2相似度计算
使用《中药色谱特征图谱相似度评价系统》(2012版)，计算本实验例6.1项中3批三批醋鸡内金颗粒的特征图谱与对照特征图谱的相似度。如图19所示，其中R为对照特征图谱，相似度计算结果见表7。
表7 醋鸡内金颗粒图谱相似度结果
Figure BDA0003437393030000082
小结：由表7可知，以上三批醋鸡内金颗粒特征图谱与对照特征图谱的相似度值在0.85以上，表明各样品中主要色谱峰基本一致，所建的特征图谱具有稳定性和可控性，可作为控制醋鸡内金颗粒质量的评价依据。
实验例2
本实验例用于说明醋鸡内金配方颗粒中核苷类成分的含量测定方法
1.仪器：同实验例1
2.试剂与试药：同实验例1
3.实验方法：同实验例1
4.醋鸡内金颗粒供试品溶液的制备
4.1提取溶剂考察
取醋鸡内金配方颗粒粉末(批号：21007561)9份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入蒸馏水、10％甲醇、30％甲醇、70％甲醇、90％甲醇、10％乙醇、30％乙醇、70％乙醇和90％乙醇各25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液得各供试品溶液。分别取各供试品溶液及尿苷对照品溶液和鸟苷对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，计算各供试品溶液中尿苷及鸟苷含量。结果见表8和表9。
表8 提取溶剂考察尿苷含量结果
Figure BDA0003437393030000091
表9 提取溶剂考察鸟苷含量结果
Figure BDA0003437393030000092
小结：不同提取溶剂考察的结果表明，以水和10％甲醇制样时，尿苷和鸟苷的检测含量相对较高。结合特征图谱检测结果，以水为溶剂图谱中各特征峰分离效果相对较好，峰形佳，故以水作为醋鸡内金颗粒含量测定及特征图谱的最佳提取溶剂。
4.2提取方式考察
取醋鸡内金配方颗粒粉末(批号：21007561)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25ml，密塞，称定重量，分别振摇、超声(功率250W，频率40kHz)、回流处理40分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液得各供试品溶液。分别取各供试品溶液及尿苷对照品溶液和鸟苷对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，计算各供试品溶液中尿苷及鸟苷含量，结果见表10、表11。
表10 提取方式考察尿苷含量结果
Figure BDA0003437393030000101
表11 提取方式考察鸟苷含量结果
Figure BDA0003437393030000102
小结：不同提取方式考察的结果表明，振摇、超声和回流均可将样品提取完全(其中振摇-2数据异常偏低，故去除)。但从操作方便性以及节约时间成本角度考虑，结合特征图谱检测结果无明显差异，因此确定以超声提取为最佳提取方式。
4.3提取溶剂量考察
取醋鸡内金配方颗粒粉末(批号：21007561)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入蒸馏水15、25、50ml，密塞，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)处理40分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液得各供试品溶液。分别取各供试品溶液及尿苷对照品溶液和鸟苷对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，计算各供试品溶液中尿苷及鸟苷含量，结果见表12、表13。
表12 提取溶剂量考察尿苷含量结果
Figure BDA0003437393030000103
表13 提取溶剂量考察鸟苷含量结果
Figure BDA0003437393030000104
小结：不同提取溶剂用量的考察结果表明，以上三种提取溶剂用量均可将样品提取完全，提取溶剂用量为50ml时尿苷和鸟苷含量略高于其他组，结合特征图谱检测结果无明显差异，因此选择以50ml作为最佳提取溶剂量。
4.4提取时间考察
取醋鸡内金配方颗粒粉末(批号：21007561)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25ml，密塞，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)分别处理20、40、60分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液得各供试品溶液。分别取各供试品溶液及尿苷对照品溶液和鸟苷对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，计算各供试品溶液中尿苷及鸟苷含量，结果见表14、表15。
表14 提取时间考察尿苷含量结果
Figure BDA0003437393030000111
表15 提取时间考察鸟苷含量结果
Figure BDA0003437393030000112
小结：不同提取时间考察的结果表明，40和60分钟均可将样品提取完全(其中20min-1、60min-2数据异常偏低，故去除)，从节约时间成本角度考虑，结合特征图谱检测结果无明显差异，因此选择40min作为最佳提取时间。
5.方法学考察
5.1线性
精密称取尿苷对照(纯度：99.5％)7.033mg和鸟苷对照品(纯度：93.6％)5.664mg于250ml容量瓶中，加入蒸馏水使溶解并定容至刻度制成混合对照品溶液⑤，从中精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、4.0ml于10ml容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，分别作为线性对照品溶液①、②、③、④。取上述各浓度对照品溶液①～⑤滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定尿苷和鸟苷色谱峰峰面积。以色谱峰的峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，观察是否呈线性，以最小二乘法进行线性回归，求得尿苷的线性回归方程为Y＝39637.2X+1454.2，R2＝1.000，其线性范围为1.3996～27.9913μg/ml；鸟苷的线性回归方程为Y＝31158.4X+974.4，R2＝1.000，其线性范围为1.0603～21.2060μg/ml。结果见表16和17。
表16 尿苷线性结果
Figure BDA0003437393030000113
表17 鸟苷线性结果
Figure BDA0003437393030000114
5.2重复性
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)6份，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，并计算尿苷和鸟苷含量。结果显示，重复性实验测得醋鸡内金颗粒中尿苷含量均值为0.56mg/g，RSD值为0.2％；鸟苷含量均值为0.45mg/g，RSD值为0.3％，符合方法学验证重复性要求。
5.3中间精密度
不同分析人员在不同时间利用另一台Waterse2695-2489高效液相色谱仪(UV检测器)进行中间精密度实验。取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)6份，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，并计算尿苷和鸟苷含量。结果显示，中间精密度实验测得醋鸡内金颗粒中尿苷含量均值为0.57mg/g，RSD值为0.9％，与重复性实验检测结果的RSD为1.0％；鸟苷含量均值为0.45mg/g，RSD值为0.5％，与重复性实验检测结果的RSD为0.4％，符合方法学验证精密度的要求。
5.4准确度
精密称取尿苷对照品(纯度：99.5％)7.033mg和鸟苷对照品(纯度：93.6％)5.664mg于250ml容量瓶中，加入蒸馏水使溶解并定容至刻度制成混合对照品母液，分别精密量取母液25ml、50ml、75ml至250ml容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度作为混合对照品溶液①、②、③。取重复性项下已知含量的醋鸡内金样品(21007561，尿苷含量为0.56mg/g，鸟苷含量为0.45mg/g)9份，每份约0.5g，精密称定，其中三份分别精密加入含有尿苷0.1400mg、鸟苷0.1060mg的混合对照品溶液50ml，另取三份分别精密加入含有尿苷0.2799mg、鸟苷0.2121mg的混合对照品溶液50ml，另取三份分别精密加入含有尿苷0.4199mg、鸟苷0.3181mg的混合对照品溶液50ml，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，按照下式计算尿苷和鸟苷回收率，结果见表18、19。
Figure BDA0003437393030000121
表18 尿苷回收率结果
Figure BDA0003437393030000122
表19 鸟苷回收率结果
Figure BDA0003437393030000123
小结：结果显示，回收率实验测得尿苷回收率范围为98.27％～102.73％，平均回收率为99.1％，RSD值为1.4％；鸟苷回收率范围为100.22％～104.44％，平均回收率为101.6％，RSD值为1.3％。符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确可靠。
5.5耐用性考察
5.5.1稳定性考察
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24、36、48h按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，分别记录尿苷和鸟苷峰面积的变化情况。结果显示，在48小时内尿苷峰面积变化的RSD值为0.2％，鸟苷峰面积变化的RSD值为0.2％，符合系统分析的要求，供试品溶液在48小时内较稳定。
5.5.2不同流速考察
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同流速(0.9、1.0、1.1ml/min)按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，分别记录尿苷和鸟苷峰面积的变化情况。结果显示，在不同流速下供试品溶液中尿苷平均含量为0.55mg/g，RSD值为1.1％；鸟苷平均含量为0.45mg/g，RSD值为0.3％，表明该方法对0.9～1.1ml/min之间的流速耐用性较好。
5.5.3不同柱温考察
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同柱温(33、35、37℃)按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，分别记录尿苷和鸟苷峰面积的变化情况。不同柱温考察结果显示，在不同柱温下供试品溶液中尿苷平均含量为0.55mg/g，RSD值为1.1％；鸟苷平均含量为0.45mg/g，RSD值为1.1％，表明该方法对33～37℃之间的柱温耐用性较好。
5.5.4不同色谱柱考察
取醋鸡内金颗粒(批号：21007561)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同色谱柱下[色谱柱1：ZORBAX Eclipse plus C18(柱长250mm柱内径4.6mm，粒径为5μm，SN:USUXA34389；色谱柱2：Waters
Figure BDA0003437393030000131
C18(柱长250mm柱内径4.6mm，粒径为5μm，SN:03233924913871；色谱柱3：Waters XSelect HSS T3(柱长250mm柱内径4.6mm，粒径为5μm，SN:01623101914806)]按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，分别记录尿苷和鸟苷的峰面积。
实验结果显示，在不同型号色谱柱条件下，尿苷平均含量为0.57mg/g，RSD值为5.1％；鸟苷平均含量为0.44mg/g，RSD值为2.8％，表明该方法对不同型号色谱柱间的差异较大。从色谱图分离度、峰形考虑，建议采用ZORBAX Eclipse Plus C18型号色谱柱。
实验例3
本实验例用于说明鸡内金配方颗粒特征图谱的构建方法
1.仪器：同实验例1。
2.试剂与试药：鸡内金配方颗粒(批号：21009061、20045321、20009221)，北京康仁堂药业有限公司提供；鸡内金对照药材(批号：202105-1-12)，北京康仁堂药业有限公司提供；其余同实验例1。
鸡内金配方颗粒的制备方法如下：取鸡内金药材适量，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏，加入糊精适量，干燥，再加入糊精适量，混匀，制粒，即得。
3.实验方法
本实验例方法采用实验例1第2项下的醋鸡内金颗粒特征图谱构建方法，以鸡内金颗粒为样品进行相关研究。
3.1系统适用性实验
在选定的色谱条件下，以尿苷(批号：110887-201803)为参照，重复检测5次，进行系统适用性实验，结果见表20。
表20 系统适用性实验结果表
Figure BDA0003437393030000132
小结：系统适用性结果符合《中国药典》2020版0512高效液相色谱法相关要求。
3.2延迟性实验
取鸡内金配方颗粒供试品溶液(批号：21009061)，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件进样，记录2倍流动相洗脱时间，结果见图20。由图20可以看出，在60分钟之后没有明显的滞后峰出现，判断此色谱方法符合分析要求。
4.特征图谱的建立与辨识
4.1专属性实验
取空白溶剂作为阴性对照，按按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件进样，结果见图2；分别取尿苷、尿嘧啶、腺苷、鸟苷对照品溶液和供试品溶液，按按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件进样，空白溶剂的色谱图见图21，尿苷对照品溶液的色谱图见图22、尿嘧啶对照品溶液的色谱图见图23、腺苷对照品溶液的色谱图见图24、鸟苷对照品溶液的色谱图见图25，供试品溶液的色谱图见图26。
小结：由图21至图26可以看出，空白溶剂对鸡内金配方颗粒特征图谱的检测无干扰，且供试品中色谱峰分别与对照品溶液色谱峰相对应，表明此方法专属性良好。
4.2特征峰确认
分别取尿苷、尿嘧啶、腺苷和鸟苷对照品溶液和按照实验例1第2项步骤(3)制备的鸡内金供试品溶液各10μl，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，对特征峰进行指认，结果见图27。图27中，A为尿苷对照品溶液色谱图，B为尿嘧啶对照品溶液色谱图，C为腺苷对照品溶液色谱图，D为鸟苷对照品溶液色谱图，E为供试品溶液色谱图。
4.3随行对照药材测定
取鸡内金对照药材(202105-1-12)溶液，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，与供试品溶液色谱图进行比对，结果见图28。图28中，S1为鸡内金对照药材溶液色谱图，S2为供试品溶液色谱图。
小结：由图28可以看出，鸡内金配方颗粒色谱图中共呈现11个特征峰，与对照药材参照物中各特征峰的保留时间相对应，差异较小。其中，其中1号峰为尿嘧啶峰，3号峰为尿苷峰，4号峰为腺苷峰，5号峰为鸟苷峰，以5号峰为参比峰。
5.方法学考察
5.1重复性
取鸡内金颗粒(批号：21009061)6份，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。结果显示，6个重复性实验样品中，峰2及峰6～峰11的相对保留时间RSD值为0.0％，表明该特征图谱的重复性较好。
5.2中间精密度
不同分析人员在不同时间利用另一台Waters ACQUITY Arc高效液相色谱仪(PDA检测器)进行中间精密度实验。取鸡内金颗粒(批号：21009061)6份，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。中间精密度结果显示，6个中间精密度实验样品中，峰2及峰6～峰11的相对保留时间RSD在0.0％～0.1％，表明该特征图谱的精密度较好。与重复性样品进行比较，其中间精密度的相对保留时间RSD在0.0％～0.3％，表明该特征图谱的中间精密度较好。
5.3耐用性考察
5.3.1稳定性实验
取鸡内金颗粒(批号：21009061)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24、36、48h按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。稳定性实验结果显示，经过考察48小时内溶液的稳定性发现，峰2及峰6～峰11的相对保留时间RSD值在0.0％～0.1％范围内，表示该分析方法稳定性良好，供试品溶液在48小时内较稳定。
5.3.2不同流速考察
取鸡内金颗粒(批号：21009061)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同流速(0.9、1.0、1.1ml/min)按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。不同流速结果显示，峰2及峰6～峰11的相对保留时间的RSD值在0.0％～7.1％范围内，表示流速对该方法影响较大。
5.3.3不同柱温考察
取鸡内金颗粒(批号：21009061)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同柱温(33、35、37℃)按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。不同柱温结果显示，峰2及峰6～峰11的相对保留时间的RSD值在0.0％～3.0％范围内，表明该分析方在柱温33～37℃范围内具有良好的耐用性。
5.3.4不同色谱柱考察
取鸡内金颗粒(批号：21009061)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同色谱柱下按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。结果图29-31，其中，图29对应色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm，5μm)，图30对应色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6*250mm，5μm)，图31对应色谱柱Waters
Figure BDA0003437393030000153
C18(4.6*250mm，5μm)。
结果显示，采用不同色谱柱测定时，峰2及峰6～峰11的相对保留时间的RSD值在0.0％～7.7％范围内，说明不同型号的色谱柱对该方法影响较大。由图29-图31可以看出，由ZORBAX Eclipse Plus C18型号色谱柱测出的色谱图中各色谱峰分离度高、峰形好，因此确定采用ZORBAX Eclipse Plus C18型号色谱柱。
6.样品测定
6.1鸡内金颗粒检测
取三批鸡内金颗粒，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，以5号峰鸟苷峰(S)为参照峰，计算峰2及峰6～峰11的相对保留时间，并计算RSD值。由三批鸡内金颗粒检测结果可知，峰2及峰6～峰11的相对保留时间的RSD值在0.0％～0.1％范围内，差异很小，符合质量控制要求。
6.2相似度计算
使用《中药色谱特征图谱相似度评价系统》(2012版)，计算本实验例6.1项中3批三批鸡内金颗粒的特征图谱与对照特征图谱的相似度。如图32所示，其中R为对照特征图谱，相似度计算结果见表21。
表21 鸡内金颗粒图谱相似度结果
Figure BDA0003437393030000151
小结：由表21可知，以上三批鸡内金颗粒特征图谱与对照特征图谱的相似度值在0.90以上，表明各样品中主要色谱峰基本一致，所建的特征图谱具有稳定性和可控性，可作为控制醋鸡内金颗粒质量的评价依据。
实验例4
本实验例用于说明鸡内金配方颗粒中核苷类成分的含量测定方法
1.仪器：同实验例3
2.试剂与试药：同实验例3
3.实验方法：同实验例1
4.鸡内金颗粒供试品溶液的制备
4.1提取溶剂考察
取鸡内金配方颗粒粉末(批号：21009061)5份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入蒸馏水、10％甲醇、50％甲醇、10％乙醇、50％乙醇各50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液得各供试品溶液。分别取各供试品溶液及尿苷对照品溶液和鸟苷对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，计算各供试品溶液中尿苷及鸟苷含量，结果见表22、表23。
表22 提取溶剂考察尿苷含量结果
Figure BDA0003437393030000152
Figure BDA0003437393030000161
表23 提取溶剂考察鸟苷含量结果
Figure BDA0003437393030000162
小结：不同提取溶剂考察的结果表明，以水和10％甲醇制样时，其检测成分含量相对较高。结合特征图谱检测结果，以水为溶剂图谱中各特征峰分离效果相对较好，峰形佳，故以水作为鸡内金颗粒含量测定及特征图谱的最佳提取溶剂。
4.2提取方式考察
取鸡内金配方颗粒粉末(批号：21009061)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水50ml，密塞，称定重量，分别超声(功率250W，频率40kHz)、回流处理40分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液得各供试品溶液。分别取各供试品溶液及尿苷对照品溶液和鸟苷对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，计算各供试品溶液中尿苷及鸟苷含量，结果见表24、表25。
表24 提取方式考察尿苷含量结果
Figure BDA0003437393030000163
表25 提取方式考察鸟苷含量结果
Figure BDA0003437393030000164
小结：不同提取方式考察的结果表明，超声和回流均可将样品提取完全。但从操作方便以及节约时间成本角度考虑，结合特征图谱检测结果无明显差异，因此确定以超声提取为最佳提取方式。
4.3提取溶剂量考察
取鸡内金配方颗粒粉末(批号：21009061)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入蒸馏水15、25、50ml，密塞，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)处理40分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液得各供试品溶液。分别取各供试品溶液及尿苷对照品溶液和鸟苷对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，计算各供试品溶液中尿苷及鸟苷含量，结果见表26、表27。
表26 提取溶剂量考察尿苷含量结果
Figure BDA0003437393030000171
表27 提取溶剂量考察鸟苷含量结果
Figure BDA0003437393030000172
小结：不同提取溶剂量考察的结果表明，以上三种提取溶剂量均可将样品提取完全，提取溶剂量为50ml时尿苷和鸟苷含量略高于其他组，结合特征图谱检测结果无明显差异，因此选择以50ml作为最佳提取溶剂量。
4.4提取时间考察
取鸡内金配方颗粒粉末(批号：21009061)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25ml，密塞，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)分别处理20、40、60分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液得各供试品溶液。分别取各供试品溶液及尿苷对照品溶液和鸟苷对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，计算各供试品溶液中尿苷及鸟苷含量，结果见表28、表29。
表28 提取时间考察尿苷含量结果
Figure BDA0003437393030000173
表29 提取时间考察鸟苷含量结果
Figure BDA0003437393030000174
小结：不同提取时间考察的结果表明，20、40和60分钟均可将样品提取完全，40min时鸟苷含量略高，结合节约时间成本角度考虑，特征图谱检测结果无明显差异，因此选择40min作为最佳提取时间。
5.方法学考察
5.1线性
精密称取尿苷对照品(纯度：99.6％)11.181mg和鸟苷对照品(纯度：93.6％)10.113mg于250ml容量瓶中，加入蒸馏水使溶解并定容至刻度制成混合对照品溶液⑤，从中精密量取1.0ml、2.5ml、5.0ml、10.0ml于25ml容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，分别作为线性对照品溶液①、②、③、④。取上述各浓度对照品溶液①～⑤滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定尿苷和鸟苷色谱峰峰面积。以色谱峰的峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，观察是否呈线性，以最小二乘法进行线性回归，求得尿苷的线性回归方程为Y＝38821.6X-309.6，R2＝1.000，其线性范围为1.7818～44.5451μg/ml；鸟苷的线性回归方程为Y＝31884.9X+933.6，R2＝1.000，其线性范围为1.5145～37.8631μg/ml。结果见表30、31。
表30 尿苷线性结果
Figure BDA0003437393030000181
表31 鸟苷线性结果
Figure BDA0003437393030000182
5.2重复性
取鸡内金颗粒(批号：21009061)6份，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，并计算尿苷和鸟苷含量。重复性实验测得鸡内金颗粒中尿苷含量均值为0.90mg/g，RSD值为0.3％；鸟苷含量均值为0.85mg/g，RSD值为0.5％，符合方法学验证重复性要求。
5.3中间精密度
不同分析人员在不同时间利用另一台Waters ACQUITY Arc高效液相色谱仪(PDA检测器)进行中间精密度实验。取鸡内金颗粒(批号：21009061)6份，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，并计算尿苷和鸟苷含量。中间精密度实验测得鸡内金颗粒中尿苷含量均值为0.90mg/g，RSD值为0.1％，与重复性实验检测结果的RSD为0.3％；鸟苷含量均值为0.84mg/g，RSD值为0.3％，与重复性实验检测结果的RSD为0.4％，符合方法学验证精密度的要求。
5.4准确度
精密称取尿苷对照品(纯度：99.6％)11.181mg和鸟苷对照品(纯度：93.6％)和10.113mg于250ml容量瓶中，加入蒸馏水使溶解并定容至刻度制成混合对照品母液，分别精密量取母液25ml、50ml、75ml至250ml容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度作为混合对照品溶液①、②、③。取重复性项下已知含量的鸡内金样品(21009061，尿苷含量为0.89mg/g，鸟苷含量为0.85mg/g)9份，每份约0.5g，精密称定，其中三份分别精密加入含有尿苷0.2227mg、鸟苷0.1893mg的混合对照品溶液50ml，另取三份分别精密加入含有尿苷0.4455mg、鸟苷0.3786mg的混合对照品溶液50ml，另取三份分别精密加入含有尿苷、鸟苷0.5679mg的混合对照品溶液50ml，按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，按照下式计算回收率，结果见表32、33。
Figure BDA0003437393030000183
表32 尿苷回收率结果
Figure BDA0003437393030000184
Figure BDA0003437393030000191
表33 鸟苷回收率结果
Figure BDA0003437393030000192
小结：结果显示，回收率实验测得尿苷回收率范围为99.76％～102.03％，平均回收率为101.0％，RSD值为0.7％；鸟苷回收率范围为103.17％～105.49％，平均回收率为104.7％，RSD值为0.8％。符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确可靠。
5.5耐用性考察
5.5.1稳定性考察
取鸡内金颗粒(批号：21009061)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24、36、48h按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，分别记录尿苷和鸟苷峰面积的变化情况。结果显示，在48小时内尿苷峰面积变化的RSD值为0.8％，鸟苷峰面积变化的RSD值为1.2％，符合系统分析的要求，供试品溶液在48小时内较稳定。
5.5.2不同流速考察
取鸡内金颗粒(批号：21009061)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同流速(0.9、1.0、1.1ml/min)按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，分别记录尿苷和鸟苷峰面积的变化情况。不同流速考察结果显示，在不同流速下供试品溶液中尿苷平均含量为0.89mg/g，RSD值为0.5％；鸟苷平均含量为0.84mg/g，RSD值为0.3％，表明该方法对0.9～1.1ml/min之间的流速耐用性较好。
5.5.3不同柱温考察
取鸡内金颗粒(批号：21009061)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同柱温(33、35、37℃)按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，分别记录尿苷和鸟苷峰面积的变化情况。不同柱温考察结果显示，在不同柱温下供试品溶液中尿苷平均含量为1.12mg/g，RSD值为0.1％；鸟苷平均含量为0.85mg/g，RSD值为0.8％，表明该方法对33～37℃之间的柱温耐用性较好。
5.5.4不同色谱柱考察
取鸡内金颗粒(批号：21009061)，研细，按照实验例1第2项步骤(3)制备成供试品溶液，分别于不同色谱柱下[色谱柱1：ZORBAX Eclipse plus C18(柱长250mm柱内径4.6mm，粒径为5μm，SN:USUXA34389；色谱柱2：ZORBAX SB-C18(柱长250mm柱内径4.6mm，粒径为5μm，SN:USCL099141；色谱柱3：Waters
Figure BDA0003437393030000203
C18(柱长250mm柱内径4.6mm，粒径为5μm，SN:03233924913871)]按照实验例1第2项步骤(4)的色谱条件测定，分别记录尿苷和鸟苷的峰面积。实验结果显示，在不同型号色谱柱条件下，尿苷平均含量为0.90mg/g，RSD值为0.3％；鸟苷平均含量为0.82mg/g，RSD值为3.7％，表明该方法对不同型号色谱柱间的耐用性较好。
实施例1
本实施例提供了一种鸡内金药材特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取鸡内金药材(批号：202105-1-12，来源：北京康仁堂药业有限公司)粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相色谱法检测：以十八烷基硅烷键合硅胶为充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水为流动性B，按照表1进行梯度洗脱；检测波长为254nm，柱温为35℃。理论塔板数按鸟苷峰计算应不低于5000。精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，测定得到鸡内金药材特征图谱。
如图33所示，该特征图谱具有11个共有特征峰，以5号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间的比值为：0.44(峰2)、1.08(峰6)、2.27(峰7)、2.51(峰8)、2.55(峰9)、3.03(峰10)、3.25(峰11)，峰结果见表34所示。
表34 鸡内金药材特征图谱的峰结果
Figure BDA0003437393030000201
由表34和图33可知，上述11个特征峰的分离度较高，均在1.5以上，且各峰高均匀，峰形好。各峰面积占总面积比值在1.5％～26.7％之间。
实施例2
本实施例提供了一种醋鸡内金饮片特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于供试品采用醋鸡内金饮片(批号：202104-4-10，来源：北京康仁堂药业有限公司)替换掉鸡内金药材，取醋鸡内金饮片粉碎成粉末为供试品，其余工艺条件均与实施例1相同，得到醋鸡内金饮片特征图谱，如图34所示。
在图34中，该特征图谱具有11个共有特征峰，以5号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间的比值为：0.44(峰2)、1.08(峰6)、2.27(峰7)、2.51(峰8)、2.55(峰9)、3.03(峰10)、3.25(峰11)，峰结果见表35所示。
表35 醋鸡内金饮片特征图谱的峰结果
Figure BDA0003437393030000202
Figure BDA0003437393030000211
上述11个特征峰的分离度较高，均在1.5以上，且各峰高均匀，峰形好。各峰面积占总面积比值在1.1％～26.6％之间。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液，取供试品，加溶剂，经提取、固液分离，取液体，得到所述供试品溶液；所述溶剂选自水；所述提取的方式为超声提取；供试品选自鸡内金、鸡内金制剂、醋鸡内金或醋鸡内金制剂中的任意一种；
(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ZORBAX Eclipse Plus C18型号色谱柱，以甲醇-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0min→13min→15min→55min→60min，流动相中甲醇的体积百分比为0％→5％→10％→60％→60％，流动相流速为1.0ml/min→0.5ml/min→0.8ml/min→1.0ml/min→1.0ml/min。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)还满足如下A～B中的至少一项：
A、相对于1g所述供试品，所述溶剂的加入量为30～100ml；
B、所述提取的时间不低于20min。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的提取时间为40～60min。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为250～260nm，柱温为33～37℃，进样量为5～15μl；
和/或，所述磷酸水溶液中所含磷酸的体积百分数为0.1～0.2％。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括采用尿嘧啶对照品、尿苷对照品、腺苷对照品或鸟苷对照品制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1～4中任一项所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤；和/或
所述构建方法还包括采用鸡内金对照药材或醋鸡内金对照饮片制备对照药材溶液的步骤，以及按照权利要求1～4中任一项所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材溶液得到对照药材参照图谱的步骤。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述特征图谱选自如下(1)～(4)中的任意一项：
(1)所述特征图谱的特征峰至少包括尿苷峰和鸟苷峰；
所述特征图谱的特征峰至少包括尿苷峰、鸟苷峰、尿嘧啶峰和腺苷峰；
(2)所述特征图谱的特征峰包括11个特征峰，1号峰为尿嘧啶峰，3号峰为尿苷峰，4号峰为腺苷峰，5号峰为鸟苷峰，2号峰以及6号峰～11号峰为共有峰；
(3)所述特征图谱的特征峰包括11个特征峰，以5号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内；峰2、峰6-峰11的规定值分别为：0.44、1.08、2.27、2.51、2.55、3.03、3.25；
(4)所述特征图谱由权利要求1～4中任一项所述的构建方法得到。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的构建方法，其特征在于，鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱选自如下(1)～(4)中的任意一项：
(1)所述对照特征图谱包括11个对照特征峰，6号峰为鸟苷峰，以鸟苷峰为对照参比峰，各对照特征峰与对照参比峰的相对保留时间在规定值的±10％
范围之内；峰2、峰6-峰11的规定值分别为：0.44、1.08、2.27、2.51、2.55、3.03、3.25；
(2)使用单批次或多批次供试品按照权利要求1～4中任一项所述的构建方法得到的特征图谱；
(3)使用多批次供试品按照权利要求1～4中任一项所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或中位数法制成对照特征图谱。
8.一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的含量测定方法，其特征在于，包括如下测定步骤：
取供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0min→13min→15min→55min→60min，流动相中甲醇的体积百分比为0％→5％→10％→60％→60％，流动相流速为0.9～1.1ml/min→0.4～0.6ml/min→0.7～0.9ml/min→0.9～1.1ml/min→0.9～1.1ml/min；
其中，供试品选自鸡内金、鸡内金制剂、醋鸡内金或醋鸡内金制剂中的任意一种，对照品包括尿苷对照品和/或鸟苷对照品。
9.根据权利要求8所述的含量测定方法，其特征在于，
所述供试品溶液按照权利要求1～4中任一项所述的构建方法中的步骤(1)制得；所述测定步骤按照权利要求1～4中任一项所述的构建方法中的步骤(2)的方法执行。
10.权利要求1～7中任一项所述的构建方法和/或权利要求8或9所述的含量测定方法在鸡内金产品和/或醋鸡内金产品的质量检测中的应用。
11.一种鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的质量检测方法，其特征
在于，
包括将待测鸡内金产品和/或醋鸡内金产品的特征图谱与鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱进行比对的步骤；和/或
包括按照权利要求8或9所述的含量测定方法测定待测鸡内金产品和/或醋鸡内金产品中尿苷含量和/或鸟苷含量的步骤；
其中，所述待测鸡内金产品和/或醋鸡内金产品的特征图谱为使用待测鸡内金产品和/或醋鸡内金产品按照权利要求1～7中任一项所述的构建方法得到，所述鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱为权利要求7所述的鸡内金及其制剂和/或醋鸡内金及其制剂的对照特征图谱。
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