CN111398454B - 一种抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：步骤1：参照峰溶液的制备；步骤2：抗肺癌海牡方供试品溶液的制备；步骤3：分别精密吸取定量参照峰溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4：将步骤3中获得的海牡方指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次海牡方供试品色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，用平均值计算法生成海牡方的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的海牡方指纹图谱，能全面，客观地表征海牡方的质量，有利于全面监控药物的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

一种抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药复方的检测方法，特别涉及一种抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法及其标准指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制和评价中药材或中成药的质量具有重要的意义。
抗肺癌海牡方是名老中医的临床经验方，全方由软坚散结药海藻、牡蛎，配伍以清热解毒药龙葵、北豆根组成，其中海藻为君药，牡蛎为臣药，龙葵和北豆根共为佐药，具有软坚散结、清热解毒、利水消肿之功效，主要用于治疗肺癌、淋巴癌、肝癌等，疗效显著，尤以治疗肺癌最为有效。经过系统的临床前研究发现，海牡方对肺癌具有显著的抑制作用，改善动物生存质量，具有刺激机体天然免疫能力和促进骨髓造血功能，具有很好的临床优势，有望开发成具有海洋特色的抗肺癌中药新药。
然而，海牡方复方成分复杂，个别成分的定性定量分析难以全面反应药品的全面信息，且至今无抗肺癌海牡方指纹图谱的相关研究。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种精密度高、重复性和稳定性好的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，可以用于抗肺癌海牡方的质量控制。
为了实现上述目的，本发明优化了样品前处理方法及色谱条件，建立了海牡方HPLC-ELSD指纹图谱检测方法，对海牡方的有效成分进行了准确的分析，对全面客观评价海牡方的质量具有重要的意义。
本发明采取的具体技术方案为：
一种抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、参照峰溶液的制备：取一定量的澳洲茄碱、澳洲茄边碱、蝙蝠葛碱、蝙蝠葛苏林碱对照品，加甲醇溶解；
步骤2、抗肺癌海牡方供试品溶液的制备：取不同批次的海牡方供试品，分别取一定重量的供试品置于容器中，加5%甲醇溶解，C18 固相萃取柱处理；
步骤3、分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4、将步骤3中获得的海牡方供试品指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次海牡方的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成海牡方的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；
作为优选方案，以上所述的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，步骤2供试品溶液的制备方法为：取海牡方供试品，加5%甲醇溶解，C18 固相萃取柱处理，处理流程为：甲醇活化，水平衡，上样，不同浓度的甲醇水溶液淋洗，甲酸甲醇洗脱，收集洗脱液，N2吹干，残渣加甲醇复溶，离心，取上清液，即得；
作为优选方案，以上所述的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，步骤3中，分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录42分钟内的色谱图。
作为优选方案，以上所述的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温30 ~ 40℃；以乙腈（A）-三乙胺（B）为流动相，梯度洗脱，洗脱梯度为0 ~ 42min，25% ~ 80% A；流速0.9 ~ 1.1 mL·min-1，蒸发光散色检测器进行检测。
作为优选方案，以上所述的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，所述色谱柱为Elite SinoPak C18（4.6×250mm, 5μm）或Ultimate XB-C18（4.6×250mm, 5μm）色谱柱。
作为优选方案，以上所述的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，所述液相色谱仪为Thermo U 3000液相色谱仪或安捷伦1260液相色谱仪。
作为优选方案，以上所述的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，所述乙腈-三乙胺流动相中三乙胺体积比为：0.01‰ ~ 0.5‰。进一步地，所述乙腈-三乙胺流动相中三乙胺体积比为： 0. 1‰。
作为优选方案，以上所述的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，所述蒸发光散射检测器为Alltech 2000ES蒸发光散射检测器；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度105 ~120℃，载气流速2.5 ~ 3.5mL·min-1，或安捷伦1260蒸发光散色检测器；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度：35 ~ 45℃，载气压力：3.0 ~ 3.5bar，Gain：6 ~ 7。
作为优选方案，以上所述的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述供试品指纹图谱中共12个共有峰，其中与澳洲茄碱对应的为5号峰，与澳洲茄边碱对应的为6号峰，与蝙蝠葛碱对应的为8号峰，与蝙蝠葛苏林碱对应的为10号峰。指纹图谱中以澳洲茄碱参照物峰相应的色谱峰为S峰，计算各共有峰的相对保留时间应符合：1号峰0.469~0.487，2号峰0.542~0.552，3号峰0.566~0.578，4号峰0.734~0.770，S峰1.00，6号峰1.058~1.067，7号峰1.227~1.246，8号峰1.245~1.262，9号峰1.295~1.317，10号峰1.323~1.337，11号峰1.350~1.371，12号峰13.87~1.43。
作为优选方案，以上所述的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，其特征在于，各共有峰与S峰取LOG值后的相对峰面积应符合：1号峰0.966~1.026，2号峰0.951~1.016，3号峰0.906~0.960，4号峰0.968~1.054，S峰1.00，6号峰0.944~0.983，7号峰0.997~1.042，8号峰0.872~0.942，9号峰0.892~0.976，10号峰0.900~0.976，11号峰0.839~0.919，12号峰0.993~1.077。
指纹图谱检测条件的优化：
1、供试品溶液制备优化：
本发明通过不同的样品前处理方法（甲醇超声、固相萃取）比较，结果发现固相萃取可有效去除多糖等大极性成分的干扰，故采用固相萃取的方法；本发明对固相萃取洗脱方式（水、15%甲醇、30%甲醇、50%甲醇淋洗，0.5%甲酸甲醇洗脱）的考察中发现：经水、15%甲醇淋洗，0.5%甲酸甲醇洗脱得到的色谱图信息量最多，成分含量高。
2、色谱条件优化：
本发明比较了紫外检测器与蒸发光散色检测器，发现紫外检测器在210nm、254nm、280nm、360nm波长下检测均不理想，梯度洗脱基线漂移，且指纹图谱峰数目少，不能全面反映样品的特征信息。而蒸发光散色检测器基线基本无漂移，色谱峰数目多，可代表的信息量较大，各色谱峰分离度及峰型均较佳，故选用蒸发光散色检测器建立抗肺癌海牡方指纹图谱。
本发明比较了乙腈-三乙胺体系中三乙胺添加体积比例，三乙胺能有效改善色谱峰峰型，但添加比例过高流动相碱性增强对色谱柱损伤较大，经过优化发现三乙胺添加体积比例在0.01‰~0.5‰范围内分离效果均较佳，综合考虑分离效果、色谱峰峰型及色谱柱的损耗最优选择三乙胺体积比为0.1‰。
本发明的有益效果：
1、本发明根据抗肺癌海牡方中所含的活性成分，包括多糖类、生物碱类、皂苷类等化合物的结构性质特点，通过大量的试验筛选出最佳的样品前处理方法，最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测器种类及对应的最佳工作参数，色谱柱，流速，柱温等分析条件，经多次试验验证表明，本发明提供的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法可全面、客观、准确的检测和评价海牡方的质量，为保证临床疗效具有重要意义。
2、本发明所提供的方法所建立的抗肺癌海牡方指纹图谱，能有效地表征海牡方的质量，能够客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，即可避免因测定个别化学成分而判定海牡方质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
3、本发明提供的抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，具有方法简便、精密度、重复性和稳定性好等优点，适用于抗肺癌海牡方的质量控制。
附图说明
图1为十批抗肺癌海牡方HPLC-ELSD指纹图谱。
图2为抗肺癌海牡方HPLC-ELSD标准指纹图谱。
图3为延长时间测试滞后峰图谱。
图4为抗肺癌海牡方HPLC-ELSD指纹图谱中各共有峰归属色谱图。
图5为抗肺癌海牡方HPLC-ELSD指纹图谱中色谱方的对照品定性图。
其中，A：混合对照品溶液，B：供试品溶液，图中：5：澳洲茄碱，6：澳洲茄边碱，8：蝙蝠葛苏林碱，10：蝙蝠葛碱。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例用到的仪器与试剂：
1.1 仪器与试药
Thermo U3000液相色谱仪，DAD紫外检测器，Alltech 2000ES 蒸发光散色检测器ELSD检测器；安捷伦1260液相色谱仪，安捷伦1260蒸发光散色检测器；Newclassis MEMS105DU电子分析天平（梅特勒-托利多公司），H1650-W台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），KQ-500V型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），Cleanert S C18固相萃取柱（1g/6mL，博纳艾杰尔科技有限公司），乙腈、甲醇（色谱纯，默克股份有限公司），三乙胺（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），其余试剂均为分析纯。
澳洲茄碱（批号PS170418-01，纯度≥98.0%），澳洲茄边碱（批号PS170418-02，纯度≥98.0%），蝙蝠葛苏林碱（批号17011202，纯度98.0%）均购自成都普思生物科技股份有限公司；蝙蝠葛碱（批号111867-201503，纯度98.5%）购自中国食品药品检定研究院。
1.2 药品来源
本发明所用十批次的抗肺癌海牡方：NO.1：20180701、NO.2：20180702、NO.3：20180703、NO.4：20180704、NO.5：20181001、NO.6：20181002、NO.7：20190101、NO.8：201904001、NO.9：201904002、NO.10：201908001；均由本实验室生产制备所得（具体方法参见中国专利CN 103520360A）。
实施例1：
步骤1、参照峰溶液的制备：取一定量的澳洲茄碱、澳洲茄边碱、蝙蝠葛碱、蝙蝠葛苏林碱，加甲醇溶解制成每毫升各含0.5mg的混合对照品溶液。
步骤2、分别取10批次的海牡方供试品（批号：NO.1：20180701、NO.2：20180702、NO.3：20180703、NO.4：20180704、NO.5：20181001、NO.6：20181002、NO.7：20190101、NO.8：201904001、NO.9：201904002、NO.10：201908001），取约50mg，精密称定，加2mL 5%甲醇溶解；Cleanert S C18固相萃取柱处理，处理流程为：甲醇活化，水平衡，上样，分别用2倍柱体积的水和15%甲醇水溶液淋洗，3倍柱体积的0.5%甲酸甲醇洗脱，收集洗脱液，N2吹干，残渣加70μL甲醇复溶，离心，取上清液，得10批次的供试品溶液。
步骤3、分别精密吸取各供试品溶液和参照峰溶液注入液相色谱仪，记录42分钟的色谱图；具体的色谱条件为：Elite SinoPak C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以A：乙腈-B：体积比为0.1‰的三乙胺为流动相；梯度洗脱：0 ~15min，25% ~ 36%A；15 ~ 22min，36% ~39%A；22 ~ 28min，39% ~ 43%A；28 ~ 36min，43% ~ 72%A；36 ~ 42min，72% ~ 80%A；流速1.0mL·min-1，柱温35℃；蒸发光散色检测器条件：Alltech 2000ES蒸发光散射检测器；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度115℃，载气流速3.2mL·min-1，进样量10μL。
步骤4、将步骤3中获得的10批次抗肺癌海牡方指纹图谱仪器导出（见图1），并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统A。选择10批抗肺癌海牡方指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰。用平均值计算法生成抗肺癌海牡方的对照指纹图谱，见图2。计算各共有峰的相对保留时间、取LOG后相对峰面积和相似度，结果见表1-3。
参照峰的选择：抗肺癌海牡方中所含的活性成分，包括多糖类、生物碱类、皂苷类等化合物，其中多糖类成分主要发挥免疫调节作用，生物碱类主要发挥细胞毒作用，本发明选择含量较高，保留时间适中，分离度较好的澳洲茄碱作为参照物。
表1. 10批抗肺癌海牡方共有峰相对保留时间
峰号 NO.1 NO.2 NO.3 NO.4 NO.5 NO.6 NO.7 NO.8 NO.9 NO.10
1 0.469 0.469 0.473 0.469 0.474 0.472 0.474 0.472 0.472 0.474
2 0.542 0.542 0.543 0.542 0.542 0.542 0.542 0.543 0.542 0.542
3 0.567 0.567 0.567 0.567 0.568 0.567 0.568 0.568 0.567 0.568
4 0.734 0.734 0.737 0.734 0.745 0.742 0.745 0.744 0.742 0.745
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
6 1.059 1.059 1.060 1.059 1.059 1.058 1.059 1.059 1.058 1.059
7 1.231 1.231 1.230 1.231 1.228 1.227 1.228 1.228 1.227 1.228
8 1.245 1.245 1.245 1.245 1.248 1.246 1.248 1.248 1.246 1.248
9 1.298 1.298 1.297 1.298 1.296 1.295 1.296 1.296 1.295 1.296
10 1.323 1.323 1.324 1.323 1.324 1.323 1.324 1.324 1.323 1.324
11 1.353 1.353 1.352 1.353 1.351 1.350 1.351 1.350 1.350 1.351
12 1.390 1.390 1.389 1.390 1.390 1.387 1.390 1.389 1.387 1.390
表2. 10批抗肺癌海牡方共有峰取LOG后相对峰面积
峰号 NO.1 NO.2 NO.3 NO.4 NO.5 NO.6 NO.7 NO.8 NO.9 NO.10
1 0.991 0.973 0.984 0.977 0.996 1.026 1.010 0.997 1.022 1.004
2 0.970 0.951 0.970 0.955 0.975 1.005 1.008 0.979 1.000 1.009
3 0.929 0.906 0.930 0.909 0.934 0.949 0.960 0.938 0.946 0.958
4 0.997 0.980 0.992 0.981 0.987 1.038 1.011 0.987 1.032 1.005
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
6 0.962 0.951 0.961 0.955 0.944 0.960 0.953 0.948 0.961 0.951
7 1.022 1.002 1.023 1.003 1.039 1.024 1.029 1.042 1.027 1.030
8 0.925 0.899 0.926 0.902 0.872 0.903 0.874 0.874 0.935 0.874
9 0.966 0.959 0.965 0.955 0.928 0.973 0.923 0.931 0.976 0.921
10 0.950 0.949 0.948 0.952 0.900 0.953 0.974 0.903 0.957 0.976
11 0.884 0.890 0.867 0.891 0.866 0.875 0.919 0.867 0.912 0.918
12 1.032 1.018 1.021 1.017 1.020 1.028 1.077 1.022 1.030 1.076
表3. 10批抗肺癌海牡方指纹图相似度结果
批次 相似度 批次 相似度
NO.1 0.952 NO.6 0.948
NO.2 0.952 NO.7 0.925
NO.3 0.950 NO.8 0.916
NO.4 0.952 NO.9 0.948
NO.5 0.902 NO.10 0. 925
指纹图谱技术参数的确定，上述实验结果表明，十批抗肺癌海牡方指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.9，因此暂定抗肺癌海牡方指纹图谱标准为：供试品图谱与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算软件计算，相似度不得低于0.9。根据十批指纹图谱中各共有峰相对保留时间和相对峰面积应符合表4的限度范围。
表4. 共有峰相对保留时间和取LOG后相对峰面积限度范围
峰号 相对保留时间 取LOG后相对峰面积
1 0.469 ~ 0.487 0.966 ~ 1.026
2 0.542 ~ 0.552 0.951 ~ 1.016
3 0.566 ~ 0.578 0.906 ~ 0.960
4 0.734 ~ 0.770 0.968 ~ 1.054
S 1.000 1.000
6 1.058 ~ 1.067 0.944 ~ 0.983
7 1.227 ~ 1.246 0.997 ~ 1.042
8 1.245 ~ 1.262 0.872 ~ 0.942
9 1.295 ~ 1.317 0.892 ~ 0.976
10 1.323 ~ 1.337 0.900 ~ 0.976
11 1.350 ~ 1.371 0.839 ~ 0.919
12 1.387 ~ 1.434 0.993 ~ 1.077
2、抗肺癌海牡方指纹图谱成分来源分析
将处方4味药材分别按海牡方供试品溶液制备方法制备各单味药供试品溶液，进样分析，通过保留时间分析，指纹图谱中标定的12个共有峰，其中2、3、4、5、6、11、12号峰来自龙葵，7、8、10号峰来自北豆根，1、9号峰为合煎产生的新成分，参见图4。
3、色谱峰指认
本实验用对照品比对，确定共有峰中5号峰为澳洲茄碱、6号峰为澳洲茄边碱、8号峰为蝙蝠葛苏林碱、10号峰为蝙蝠葛碱。对照品比对的结果见图5。
4、色谱条件的优化：
4.1 检测器的选择
紫外检测器与Alltech蒸发光散色检测器联用，比较发现紫外检测器在210nm、254nm、280nm、360nm波长下检测均不理想，梯度洗脱基线漂移，且指纹图谱峰数目少，不能全面反映样品的特征信息。而蒸发光散色检测器基线基本无漂移，色谱峰数目多，可代表的信息量较大，各色谱峰分离度及峰型均较佳，故选用增发光散色检测器建立抗肺癌海牡方指纹图谱。
4.2 流动相的选择
分别考察体积浓度为0.05‰、0.1‰、0.3‰、0.5‰的三乙胺对分离效果的影响，结果0.05‰、0.1‰、0.3‰、0.5‰三乙胺分离效果均较佳，综合考虑分离效果、色谱峰峰型及色谱柱的损耗最优选择0.1‰。
4.3 柱温的考察
分别考察了柱温为30℃、35℃和40℃对分离效果的影响，结果3个柱温条件下12个共有峰均可得到较好的分离，柱温为35℃时各峰分离度及峰型最好，因此优选柱温为35℃。
4.4 流速的考察
分别考察流速为0.8mL/min、0.9mL/min、1.0 mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min对分离效果的影响，结果流速为0.9～1.1mL/min时12个共有峰均可得到较好的分离，流速1.0mL/min时各峰分离度及峰型最好，保留时间合适，因此优选流速为1.0m L/min。
4.5 色谱柱的考察
对不同品牌的色谱柱进行考察，Elite SinoPak C18（4. 6mm × 250mm, 5μm）、Ultimate XB-C18（4. 6mm × 250mm, 5μm）、Aglient ZORBAX SB-C18（4. 6mm × 250mm,5μm），结果显示，Elite SinoPak C18和Ultimate XB-C18对样品的分离效果均较好，其中Elite SinoPak 色谱柱的各峰分离度及峰型最好，因此优选Elite SinoPak C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱。
4.6 滞后峰的测试
延长测试时间至60min，结果42min后无色谱峰，因此在抗肺癌海牡方指纹图谱测定时，色谱条件适宜，无滞后成分影响样品测定，结果见图2。
综上所述，确定抗肺癌海牡方指纹图谱测定色谱条件为：Elite SinoPak C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，流动相A：乙腈-B：体积比为0.1‰的三乙胺；梯度洗脱，0 ~15min，25% ~ 36%A；15 ~ 22min，36% ~ 39%A；22 ~ 28min，39% ~ 43%A；28 ~ 36min，43% ~72%A；36 ~ 42min，72% ~ 80%A ；流速1.0mL·min-1，柱温35℃；蒸发光散色检测器条件：Alltech 2000ES蒸发光散射检测器；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度115℃，载气流速3.2mL·min-1，进样量10μL。
4.7 供试品溶液的制备
方法一：取本品，研细，取约50mg，精密称定，加2mL甲醇，超声（500W，40KHz）处理1小时，放冷，摇匀，离心，取上清液，N2吹干，加70μL甲醇复溶，离心，取上清液，即得。
方法二：取本品，研细，取约50mg，精密称定，加2mL 5%甲醇溶解；Cleanert S C18固相萃取柱处理，处理流程为：甲醇活化，水平衡，上样，分别用2倍柱体积的水和15%甲醇、30%甲醇、50%甲醇淋洗，3倍柱体积的0.5%甲酸甲醇洗脱，收集洗脱液，N2吹干，残渣加70μL甲醇复溶，离心，取上清液，即得。
方法三：取本品，研细，取约50mg，精密称定，加2mL 5%甲醇溶解；Cleanert S C18固相萃取柱处理，处理流程为：甲醇活化，水平衡，上样，分别用2倍柱体积的水和15%甲醇水溶液淋洗，3倍柱体积的0.5%甲酸甲醇洗脱，收集洗脱液，N2吹干，残渣加70μL甲醇复溶，离心，取上清液，即得。
经考察，方法一制备的供试品溶液中多糖等大极性成分干扰严重，方法二制备的供试品溶液峰数量较少，不能全面反应样品的特征信息，方法三即可有效去除多糖等大极性成分的干扰，又未造成中小极性成分的损失，且基线平稳；综上所述，采用方法三制备供试品溶液。
5、方法学验证
5.1 精密度试验
取批号为201904001的抗肺癌海牡方，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品10μL，重复进样6次，记录色谱图。以澳洲茄碱为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表5及表6。各共有峰相对保留时间RSD均小于0.5%，取LOG后相对峰面积RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。
表5. 抗肺癌海牡方HPLC-ELSD指纹图谱精密度考察结果（相对保留时间）
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD/%
1 0.481 0.479 0.478 0.482 0.483 0.483 0.422
2 0.543 0.543 0.543 0.543 0.543 0.542 0.054
3 0.569 0.566 0.567 0.567 0.567 0.567 0.153
4 0.762 0.764 0.766 0.767 0.769 0.770 0.393
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
6 1.060 1.060 1.059 1.060 1.060 1.059 0.026
7 1.234 1.234 1.234 1.235 1.234 1.234 0.018
8 1.254 1.254 1.255 1.255 1.255 1.256 0.052
9 1.304 1.305 1.305 1.305 1.304 1.304 0.018
10 1.329 1.330 1.330 1.330 1.330 1.331 0.050
11 1.360 1.359 1.360 1.359 1.358 1.358 0.063
12 1.398 1.397 1.397 1.397 1.397 1.397 0.021
表6. 抗肺癌海牡方HPLC-ELSD指纹图谱精密度考察结果（取LOG后相对峰面积）
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD/%
1 0.980 0.993 0.996 0.985 1.008 1.004 1.095
2 0.999 0.999 0.991 1.016 1.003 1.011 0.911
3 0.936 0.939 0.934 0.932 0.951 0.946 0.774
4 0.979 0.968 0.983 0.976 0.976 0.974 0.495
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
6 0.964 0.962 0.965 0.958 0.977 0.961 0.659
7 0.997 0.997 1.007 1.007 1.006 1.015 0.695
8 0.904 0.905 0.912 0.911 0.906 0.907 0.345
9 0.899 0.894 0.899 0.900 0.912 0.892 0.797
10 0.941 0.939 0.947 0.957 0.971 0.934 1.439
11 0.855 0.857 0.892 0.891 0.898 0.848 2.584
12 1.007 1.007 1.029 1.018 1.046 1.007 1.550
5.2 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h和24h进样，记录色谱图，以澳洲茄碱为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表7及表8。各共有峰相对保留时间RSD均小于0.5%，取LOG后相对峰面积RSD均小于3%，表明供试品溶液在24h内保持稳定。
表7. 抗肺癌海牡方HPLC-ELSD指纹图谱稳定性考察（相对保留时间）
峰号 0h 4h 8h 12h 24h RSD/%
1 0.470 0.473 0.472 0.473 0.471 0.276
2 0.542 0.543 0.543 0.542 0.543 0.101
3 0.567 0.568 0.566 0.567 0.569 0.201
4 0.764 0.764 0.765 0.765 0.764 0.072
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
6 1.060 1.059 1.059 1.060 1.060 0.052
7 1.235 1.234 1.236 1.235 1.234 0.068
8 1.255 1.254 1.255 1.255 1.256 0.056
9 1.305 1.304 1.305 1.305 1.304 0.042
10 1.329 1.329 1.330 1.330 1.328 0.063
11 1.357 1.358 1.358 1.359 1.357 0.062
12 1.397 1.397 1.398 1.397 1.397 0.032
表8. 抗肺癌海牡方HPLC-ELSD指纹图谱稳定性考察（取LOG后相对峰面积）
峰号 0h 4h 8h 12h 24h RSD/%
1 0.985 0.982 0.985 0.998 0.979 0.732
2 1.002 0.997 0.981 1.004 0.991 0.929
3 0.924 0.915 0.924 0.937 0.921 0.897
4 0.992 0.973 0.972 0.998 0.979 1.169
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
6 0.968 0.956 0.957 0.956 0.946 0.815
7 1.018 1.020 1.010 1.015 1.008 0.516
8 0.920 0.920 0.923 0.935 0.928 0.700
9 0.940 0.921 0.921 0.941 0.924 1.096
10 0.930 0.958 0.938 0.928 0.935 1.261
11 0.873 0.850 0.839 0.868 0.872 1.750
12 1.041 1.019 1.028 1.020 1.019 0.923
5.3 重复性
取海牡方样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液6份，依法测定。以澳洲茄碱为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表9及表10。各共有峰相对保留时间RSD均小于1%，取LOG后相对峰面积RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。
表9. 抗肺癌海牡方HPLC-ELSD指纹图谱重复性考察（相对保留时间）
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD/%
1 0.485 0.483 0.480 0.486 0.485 0.487 0.529
2 0.552 0.549 0.548 0.551 0.549 0.552 0.309
3 0.578 0.575 0.574 0.577 0.575 0.577 0.262
4 0.740 0.742 0.744 0.740 0.744 0.751 0.514
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
6 1.065 1.062 1.061 1.063 1.062 1.067 0.212
7 1.246 1.238 1.234 1.239 1.235 1.240 0.335
8 1.262 1.252 1.249 1.254 1.252 1.255 0.350
9 1.317 1.307 1.303 1.308 1.304 1.309 0.388
10 1.337 1.328 1.324 1.331 1.327 1.332 0.340
11 1.371 1.362 1.356 1.362 1.357 1.362 0.367
12 1.410 1.401 1.397 1.401 1.434 1.402 0.988
表10. 抗肺癌海牡方HPLC-ELSD指纹图谱重复性考察（取LOG后相对峰面积）
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD/%
1 0.993 0.981 0.992 0.966 0.974 0.966 1.247
2 1.009 1.005 1.010 1.003 0.999 0.998 0.504
3 0.928 0.934 0.945 0.933 0.934 0.935 0.569
4 1.039 1.031 1.031 1.052 1.031 1.012 1.238
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
6 0.983 0.973 0.951 0.974 0.982 0.968 1.193
7 1.022 1.022 1.013 1.017 1.010 1.015 0.508
8 0.927 0.925 0.930 0.942 0.932 0.933 0.637
9 0.912 0.914 0.913 0.925 0.916 0.922 0.585
10 0.959 0.959 0.942 0.955 0.956 0.949 0.702
11 0.882 0.870 0.874 0.870 0.874 0.868 0.579
12 1.006 0.998 1.009 1.010 1.007 0.993 0.677
以上结果表明，本发明提供的抗肺癌海牡方指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价海牡方的质量，为保证临床疗效具有重要意义。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、参照峰溶液的制备：取一定量的澳洲茄碱、澳洲茄边碱、蝙蝠葛碱、蝙蝠葛苏林碱对照品，加甲醇溶解；
步骤2、抗肺癌海牡方供试品溶液的制备：取不同批次的海牡方供试品，分别取一定重量的供试品置于容器中，加5%甲醇溶解，C18 固相萃取柱处理；所述C18 固相萃取柱处理流程为：甲醇活化，水平衡，上样，分别用2倍柱体积的水和15%甲醇水溶液淋洗，3倍柱体积的0.5%甲酸甲醇洗脱，收集洗脱液，N2吹干，残渣加甲醇复溶，离心，取上清液，即得；所述抗肺癌海牡方由海藻、牡蛎、龙葵、北豆根组成；
步骤3、分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4、将步骤3中获得的海牡方供试品指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次海牡方色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成海牡方的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；
所述供试品指纹图谱中共12个共有峰，其中与澳洲茄碱对应的为5号峰，与澳洲茄边碱对应的为6号峰，与蝙蝠葛碱对应的为8号峰，与蝙蝠葛苏林碱对应的为10号峰；以澳洲茄碱参照物峰相应的色谱峰为S峰，计算各共有峰的相对保留时间应符合：1号峰0.469～0.487，2号峰0.542～0.552，3号峰0.566～0.578，4号峰0.734～0.770，S峰1.00，6号峰1.058～1.067，7号峰1.227～1.246，8号峰1.245～1.262，9号峰1.295～1.317，10号峰1.323～1.337，11号峰1.350～1.371，12号峰13.87～1.43；各共有峰与S峰取LOG值后的相对峰面积应符合：1号峰0.966～1.026，2号峰0.951～1.016，3号峰0.906～0.960，4号峰0.968～1.054，S峰1.00，6号峰0.944～0.983，7号峰0.997～1.042，8号峰0.872～0.942，9号峰0.892～0.976，10号峰0.900～0.976，11号峰0.839～0.919，12号峰0.993～1.077；
所述的步骤3中，液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温30～40℃；以A：乙腈-B：三乙胺为流动相，三乙胺体积百分数为 0.01‰ ~ 0.5‰，梯度洗脱，洗脱梯度为：0 ~15min，25% ~ 36%A；15 ~ 22min，36% ~ 39%A；22 ~ 28min，39% ~ 43%A；28 ~36min，43% ~ 72%A；36 ~ 42min，72% ~ 80%A；流速0.9 ~ 1.1 mL·min-1，Alltech 2000ES蒸发光散射检测器进行检测，蒸发光散射检测器参数：漂移管温度105 ~ 120℃，载气流速2.5 ~ 3.5mL·min-1。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤3中，分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录42分钟的液相色谱图。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱仪的色谱柱为EliteSinoPak C18或Ultimate XB-C18色谱柱。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱仪为Thermo U 3000液相色谱仪或安捷伦1260液相色谱仪。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述乙腈-三乙胺流动相中三乙胺体积数为0.1‰。
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