CN113759057A - 一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药检测技术领域，具体公开了一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法，其构建方法包括以下步骤，(1)薤白供试品溶液的制备；(2)取薤白供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为水‑甲醇，梯度洗脱程序包括：0→22min，流动相中甲醇的体积百分数为：5％→11％，得到特征图谱，实现了包括腺苷和胸苷在内的共有特征峰的分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，噪音干扰较小，特征峰峰形好、分离度高，而且可以准确定位腺苷和胸苷的峰位置，充分的反映薤白水提取物及其制剂的整体性和特征性，为薤白水提取物及其制剂的质量检测和控制提供依据。

Description

一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法。
背景技术
薤白为百合科植物小根蒜Allium macrostemon Bge.或薤Allium chinenseG.Don的干燥鳞茎加工制成的，具有通阳散结，行气导滞的功能，用于胸痹心痛，脘腹痞满胀痛，泻痢厚重。薤白中含有甾体皂苷、挥发油、含氮化合物、酸性成分、多糖、无机元素等多种成分。据报道腺苷具有扩张管状血管、增加冠状动脉血流量、扩张周围血管作用及减弱心肌收缩力的作用，是薤白治疗胸痹等症的主要活性成分之一。
中药汤剂是临床用药的主要形式，其发挥疗效的基础是标准汤剂中成分，因此对标准汤剂中的成分的种类及量进行控制，更符合临床的要求，可保证用药的有效性。中药配方颗粒是以传统中药饮片为原料，经过提取、浓缩、干燥、制粒等生产工艺，加工制成的一种统一规格、统一剂量、统一质量标准的新型配方用药。它是以中药标准汤剂为基础，在中医理论指导下使用，与传统中药汤剂相比，具有服用方便、易贮藏、便携带、质量可控等特点。薤白配方颗粒作为临床常用品种，故建立其质量控制方法具有重要的研究意义。
薤白配方颗粒中含量指标性成分为腺苷，《中国药典》2020版一部薤白项下无含量测定及特征图谱的相关标准，有关于瓜蒌薤白颗粒含量及特征图谱的研究，但该方法色谱条件过于复杂，且只能指认腺苷的成分峰，专属性不强，还存在峰形差，分离度低的问题，因此，研究一种新的有效、准确、全面地检测包括薤白配方颗粒在内的薤白制剂产品以及薤白水提取物的质量是本发明需要解决的技术问题。
发明内容
因此，本发明的目的在于解决现有技术中薤白水提取物及其制剂特征图谱的构建方法无法有效、准确、全面地提供薤白水提取物及其制剂中有效成分的色谱信息，峰形差，分离度低的问题，提供了一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法。
具体的，本发明公开了一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤，
(1)薤白供试品溶液的制备；
(2)取薤白供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水-甲醇为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→22min，流动相中甲醇的体积百分数为：5％→11％。
在某些优选的实施方式中，步骤(2)中，检测波长为258-262nm，流速为0.9-1.1mL/min，柱温为28-32℃。
在某些优选的实施方式中，步骤(1)包括，称取薤白供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液；
在某些优选的实施方式中，所述步骤(1)还满足如下A-C中的任意一项或者多项：
A、加入10-40倍量溶剂，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为0.3-5h；
B、所述固液分离选自离心或者过滤；
C、溶剂选自甲醇、水和乙醇中的至少一种。
在某些优选的实施方式中，所述的构建方法还包括采用腺苷对照品和/或胸苷对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照本发明任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤；
优选的，每1mL对照品溶液中含0.01-0.5mg腺苷和/或含0.01-0.5mg胸苷；
更优选的，所述溶剂选自甲醇水溶液或者纯甲醇；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不小于30％。
本发明中，薤白水提取物及其制剂指可以是薤白水提取物，也可以是由薤白水提取物制成的制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂等。
某些优选的实施方式中，还包括薤白水提物和/或薤白制剂的对照特征图谱的构建，对多批薤白水提物和/或薤白制剂供试品检测得到的特征图谱，利用中药色谱特征图谱相似度评价系统生成薤白水提物和/或薤白制剂的对照特征图谱。至少采用3批薤白配方颗粒，例如采用3个批次、7个批次、15个批次、17个批次的薤白标准汤剂冻干粉。
某些优选的实施方式中，利用中药色谱特征图谱相似度评价软件生成薤白水提物和/或薤白制剂的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
上述薤白制剂指由薤白水提取物制成的制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂等。
本发明还提供了一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱，由上述任一所述的构建方法得到。
本发明还提供了一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱，其具有腺苷峰和胸苷峰；
本发明还提供了一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱，其具有4个共有特征峰，按照出峰时间依次编号，1号峰为胸苷峰，2号峰为共有特征峰，3号峰为腺苷峰，4号峰为共有特征峰；
本发明还提供了一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱，其具有4个共有特征峰，以腺苷峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.73(峰1)、0.88(峰2)、1.00(峰3)和1.12(峰4)。
本发明还提供了一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱，其具有4个共有特征峰，保留时间分别为12.467min、14.149min、17.165min、19.20min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<5.0％、RSD<3.0％、<0.5％、<0.05％。
本发明还提供了一种薤白水提取物及其制剂的对照特征图谱，其具有4个共有特征峰，以腺苷峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.73(峰1)、0.88(峰2)、1.00(峰3)和1.12(峰4)。
本发明还提供了一种薤白水提取物及其制剂的对照特征图谱，其具有4个共有特征峰，保留时间分别为12.467min、14.149min、17.165min、19.20min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<5.0％、RSD<3.0％、<0.5％、<0.05％。
本发明中，薤白水提取物及其制剂的对照特征图谱还可以使用单批次或者多批次薤白水提取物和/或其制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱；可选的，对照特征图谱还可以使用多批次薤白水提取物和/或其制剂供试品按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成特征图谱。
本发明解决的另一技术问题是克服现有技术无法测定薤白水提取物和/或其制剂中腺苷的含量的缺陷，从而提供了一种薤白水提取物及其制剂中腺苷的含量测定方法。
包括如下步骤：薤白供试品溶液的制备；
腺苷对照品溶液的制备：
测试步骤：取供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为水-甲醇，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→22min，流动相中甲醇的体积百分数为：5％→11％。
作为具体的实施方式，所述薤白供试品溶液是按照本发明任一所述的薤白水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法中的步骤(1)的方法进行制备；所述测试步骤是按照本发明任一所述的薤白水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法中的步骤(2)的方法进行测试。
本发明还提供了一种薤白水提取物及其制剂的质量检测方法，包括将待测薤白产品的特征图谱与薤白水提取物及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测薤白产品的特征图谱为使用待测薤白产品按照本发明任一所述的薤白水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法得到，所述薤白水提取物和/或其制剂的对照特征图谱为本发明所述的薤白水提取物及其制剂的对照特征图谱；和/或包括将待测薤白产品按照本发明所述的薤白水提取物及其制剂中腺苷的含量测定方法测定含量的步骤。
采用相似度评价待测薤白产品品的质量，当待测薤白产品的特征图谱与薤白水提物及其制剂的对照特征图谱的相似度如果不低于0.90-1.00(例如0.85)，则为质量合格；如果低于0.90-1.00(例如0.85)，则为不合格；具体地，所述相似度通过中药色谱特征图谱相似度评价软件得到。
本发明中，待测薤白产品可以是薤白水提取物，也可以是由薤白水提取物制成的制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂等。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述的薤白水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为水-甲醇，进行梯度洗脱，通过优选梯度洗脱程序，最终仅使用1个洗脱程序即可得到4个共有特征峰，并实现了包括腺苷和胸苷在内的共有特征峰的分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，噪音干扰较小，特征峰峰形好、分离度高，而且可以准确定位腺苷和胸苷的峰位置，充分的反映薤白水提取物及其制剂的整体性和特征性，为薤白水提取物及其制剂的质量检测和控制提供依据。
2.本发明所述的薤白水提取物及其制剂中腺苷的含量测定方法，通过优化色谱条件以及对提取方式、温度、溶剂、溶液浓度、提取时间等提取条件进行考察，确定了最佳提取工艺和色谱条件，使得含量测定方法，准确度和精密度更高、重复性、稳定性和耐用性更好，能够更加全面的对薤白水提取物及其制剂进行质量监控。
3.本发明所述的薤白水提取物及其制剂的质量检测方法，通过待测薤白产品的特征图谱与对照特征图谱进行比较，以及通过对薤白水提取物及其制剂中腺苷的含量进行测定，可以全面、清楚、有效的对薤白水提取物及其制剂进行质量检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为薤白标准汤剂3D扫描色谱图；
图2为方法一条件下的色谱图，上为腺苷对照品色谱，下为供试品色谱；
图3为方法二条件下的色谱图，上为腺苷对照品色谱，下为供试品色谱；
图4为方法三条件下的色谱图，上为腺苷对照品色谱，下为供试品色谱；
图5为方法四条件下的色谱图，上为腺苷对照品色谱，下为供试品色谱；
图6为薤白标准汤剂冻干粉延迟性谱图；
图7为薤白配方颗粒延迟性谱图；
图8为17批薤白标准汤剂冻干粉的特征图谱；
图9为3批薤白配方颗粒的特征图谱；
图10为薤白标准汤剂冻干粉对照图谱及共有峰标识；
图11为薤白配方颗粒对照图谱及共有峰标识；
图12为薤白标准汤剂冻干粉图谱中1号峰和3号峰的确认图；
图13为薤白配方颗粒中1号峰和3号峰的确认图；
图14为薤白对照药材图谱；
图15为薤白标准汤剂与对照药材图谱对比图；
图16为薤白配方颗粒与对照药材图谱对比图；
图17为17批薤白标准汤剂冻干粉特征图谱与参照物特征图谱的对比；
图18为薤白标准汤剂冻干粉专属性考察图；
图19为薤白配方颗粒的HPLC图谱；
图20为对比例1中薤白配方颗粒的特征图谱；
图21为对比例1中薤白配方颗粒图谱与腺苷对照品图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。重量倍量是指每克薤白配方颗粒饮片加入水的毫升数(ml/g)。
实验例1特征图谱的构建
1、仪器、试剂及试药
仪器：岛津LC-2010A高效液相色谱仪；ME104E电子天平(梅特勒·托利多)，JY20002电子天平(梅特勒·托利多)，BSA124S电子天平(赛多利斯科技仪器(北京)有限公司)，BT25S电子天平(赛多利斯科技仪器(北京)有限公司)。
色谱柱：WATERS
Figure BDA0003200462010000051
C18(柱长250mm柱内径4.6mm，粒径为5μm)
试药：薤白标准汤剂冻干粉可以采用本领域常规方法制备，例如本发明中按照如下步骤制备：取薤白饮片200g，置于砂锅中，浸泡30分钟，一煎加入饮片量6倍水(每毫克饮片加水6毫升)，武火煮沸后，文火煎煮30分钟，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量4倍水，武火煮沸后，文火煎煮20分钟，趁热过滤，迅速冷却备用；合并滤液，浓缩(65℃)，浓缩至料液比约为1：1(相对密度为1.05-1.10)，冷冻干燥，即得。
本发明采用的薤白标准汤剂冻干粉的批号分别为：200618-725800-01、200529-724400-02、200610-713800-03、200703-725800-04、200703-725800-05、200703-043100-06、200703-043100-07、200703-725800-08、200703-043100-09、200703-725800-10、200703-043100-11、200703-727000-12、200703-710000-13、200703-710038-14、200703-712000-15、200703-714100-17、200703-724400-18。
薤白配方颗粒可以采用本领域常规方法制备，例如本发明中按照包括如下步骤制备：取薤白饮片200kg，沸腾(100℃)提取一次，加水量为饮片量12倍(每毫克饮片加水12毫升)，提取2小时，150目滤布趁热过滤，滤液80℃减压浓缩，至相对密度为1.08±0.02(60℃)，进行喷雾干燥，进风温度设定为180℃，粉碎，干法制粒，包装规格为2g/袋、100g/瓶包装、250g/瓶包装，密封储存。
本发明采用的薤白配方颗粒的批号分别为：KL200618-725800-01、KL 200529-724400-02、KL 200610-713800-03。
腺苷对照品(批号：110879-201703，纯度99.7％，中国食品药品检定研究院)
试剂：甲醇(merk)为色谱纯；水为蒸馏水(屈臣氏)；其它试剂均为分析纯。
2、色谱条件的优化
(1)检测波长的选择
供试品溶液的制备：取薤白标准汤剂冻干粉，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
对薤白标准汤剂冻干粉供试品溶液进行3D全扫图，如图1所示，在260nm左右时特征图谱信息较丰富，故选用260nm为特征图谱的检测波长。
(2)梯度洗脱程序的优化
供试品溶液的制备：取薤白标准汤剂冻干粉，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：取腺苷对照品适量，精密称定，加90％甲醇制成每1ml含13.21μg腺苷对照品的溶液，即得。
方法一：采用高效液相色谱法对上述供试品溶液和对照品溶液进行检测，色谱条件如下：Waters
Figure BDA0003200462010000063
C18(4.6*250mm，5μm)色谱柱；以磷酸盐缓冲液(pH6.5)-甲醇(85：15)为流动相；检测波长为260nm。柱温30℃，流速1ml/min。其中，pH6.5的磷酸缓冲液由如下方法制备：取0.01mol/L磷酸二氢钠68.5ml与0.01mol/L磷酸氢二钠31.5ml，混合，即得。结果见图2和表2。
结果显示：利用该方法获得的薤白标准汤剂冻干粉色谱图中，只检测到腺苷的峰，其他峰基本堆积在前面，故需要调整流动相比例，看能否改善。
方法二：针对方法一的色谱中各峰的情况，优化流动相比例，改为以磷酸盐缓冲液(pH6.5)-甲醇(93：7)为流动相，其他色谱条件不变。结果见图3和表2。
结果显示：经过对流动相比例进行调整后，可得到5个特征峰，但该方法采用缓冲盐作为流动相，对色谱柱及仪器损害较大，考虑将缓冲盐更换为水进行测定。
方法三：针对方法二的色谱条件进行优化，改为水-甲醇(93：7)为流动相，其他色谱条件不变。结果见图4和表2。
结果显示：从图可以看出，水作为流动相基本可以代替缓冲盐流动相，方法基本可行，但各峰距离相对较远，尝试优化流动相比例，使各峰分离可达到分离要求，且间距合适。
方法四：针对方法三进行流动相比例优化，以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按表1规定进行梯度洗脱；其他色谱条件不变，结果见图5和表2。
表1梯度洗脱表
Figure BDA0003200462010000061
表2各梯度色谱峰系统适用性参数
Figure BDA0003200462010000062
Figure BDA0003200462010000071
从图可以看出，相对于方法三来说，方法四出峰完成时间略有缩短，但供试品峰形优于方法3，且各峰理论板数、拖尾因子、分离度均符合分析要求，且该方法获得色谱图的重现性好，因此确定该方法为特征图谱方法。
(3)特征图谱构建方法的确定
薤白标准汤剂冻干粉供试品溶液或者薤白配方颗粒供试品溶液的制备：取薤白标准汤剂冻干粉或者薤白配方颗粒适量，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，加70％甲醇10ml，超声处理(功率250W，频率50kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
色谱条件：采用高效液相色谱法对上述供试品溶液进行检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，(4.6*250mm，5μm)色谱柱，以甲醇为流动相A，水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；柱温为30℃；检测波长为260nm，进样量10μl。理论板数按腺苷峰计算应不低于3000；
表3梯度洗脱表
Figure BDA0003200462010000072
(4)延迟性试验
取薤白标准汤剂冻干粉按照本实验例第2(3)项方法制备得到薤白标准汤剂冻干粉供试品溶液，取薤白配方颗粒按照本实验例第2(3)项方法制备得到薤白配方颗粒供试品溶液，分别按本实验例第2(3)项的色谱条件进样，记录2倍流动相洗脱时间结果见图6和7。
结果显示：结果表明，在22分钟之后没有明显的滞后峰出现，此色谱方法符合分析要求。
(5)系统适用性实验
在本实验例第2(3)项的色谱条件下，以腺苷为参照，进行系统适用性实验，结果见表4。
表4系统适用性实验结果表
Figure BDA0003200462010000073
结果显示：腺苷峰理论板数、分离度、拖尾因子及重复性均符合分析要求。
3、特征图谱特征峰的建立与辨识
(1)对照图谱的获得及共有峰的标识
分别取17批标准汤剂冻干粉，按照本实验例第2(3)项下方法获得其特征图谱，见表5、图8，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版本)，以S1液相图谱为参照图谱，按中位数计算，得出薤白标准汤剂冻干粉对照图谱，并进行共有峰的标识，见图10。
表5薤白标准汤剂冻干粉样品列表
Figure BDA0003200462010000081
结果显示：使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版本)，对17批薤白标准汤剂冻干粉进行共有峰标识，共标识4个共有峰。
分别取3批配方颗粒，按照正文方法获得其液相图谱，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版本)，以S1液相图谱为参照图谱，按中位数计算，得出薤白配方颗粒对照图谱，并进行共有峰的标识，结果见图9和11。
表6薤白配方颗粒样品列表
Figure BDA0003200462010000082
结果显示：使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版本)，对17批薤白配方颗粒进行共有峰标识，共标识4个共有峰。
4、特征峰的确认
取腺苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含20μg腺苷对照品的溶液，作为腺苷对照品溶液；取胸苷对照品，精密称定，加70％甲醇，制成每1ml含胸苷20μg的溶液，作为胸苷对照品溶液；注入高效液相色谱仪，按照本实验例第2(3)项下方法测定，并分别与标准汤剂冻干粉和配方颗粒进行图谱比较，结果见图12和13所示。
S1为腺苷对照品溶液，S2为胸苷对照品溶液，图10中的S3为薤白标准汤剂冻干粉的供试品溶液，图11的S3为薤白配方颗粒的供试品溶液。
1号峰为胸苷、3号峰为腺苷。
5、随行对照药材的测定
取薤白对照药材1.5g，加水50ml，煮沸50分钟，滤过，滤液减压浓缩至干，同本实验例第2(3)项下供试品溶液制备方法制备，作为对照药材参照物溶液。取薤白对照药材(121130-201906)溶液，按照本实验例第2(3)项下方法测定，进行特征图谱分析，并分别与标准汤剂冻干粉和配方颗粒进行图谱比较，结果见图14-16所示。
结果显示：由以上图谱可以看出，薤白对照药材与标准汤剂冻干粉和配方颗粒相比较，特征峰保留时间与峰数差异较小，可为标准研究制定提供依据。
6、数据处理
根据中药指纹图谱技术的要求对17批薤白标准汤剂冻干粉的特征图谱进行分析。
6.1相似度
使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版本)，计算17批薤白标准汤剂冻干粉的特征图谱与对照特征图谱的相似度，其结果见表7。
表7相似度结果表
Figure BDA0003200462010000091
结果显示：17批薤白标准汤剂冻干粉特征图谱与对照特征图谱的相似度为0.909～1.000，均高于0.90，表明图谱的差异较小。
6.2相对保留时间和相对峰面积
17批薤白标准汤剂冻干粉特征图谱与腺苷参照物、胸苷参照物特征图谱保留时间一致，见图17。
表8 17批薤白标准汤剂冻干粉相对保留时间表
Figure BDA0003200462010000101
表9 17批薤白标准汤剂冻干粉峰面积表
Figure BDA0003200462010000102
Figure BDA0003200462010000111
结果显示：由17批薤白标准汤剂冻干粉特征图谱可知，各特征峰相对保留时间差异较小，均在±5％范围内，符合质量控制要求，选择相对保留时间的平均值作为测定值；规定值为：0.88(峰2)、1.12(峰4)，允许误差：±10％。而相对峰面积的差异较大，其RSD值为84.30％～95.52％，不符合质量控制要求，因此对相对峰面积不做规定。
实验例2方法学验证
1、精密度
(1)重复性
取薤白标准汤剂冻干粉(批号：200529-724400-02)6份，按照实验例1第2(3)项下方法测定，获得其特征图谱，以3号峰为参照峰，计算相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。
结果显示：根据重复性考察结果，各特征峰的相对保留时间RSD在0.03％～0.17％范围内，相对峰面积的RSD在1.98％～2.91％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)6份，按照实验例1第2(3)项下方法测定，获得其特征图谱，以3号峰为参照峰，计算相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。
结果显示：根据重复性考察结果，各特征峰的相对保留时间RSD在0.01％～0.05％范围内，相对峰面积的RSD在0.33％～2.06％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
(2)中间精密度
不同分析人员在不同时间利用另一台Waters e2695高效液相色谱仪进行中间精密度实验，取薤白标准汤剂冻干粉(批号：200529-724400-02)6份，按照实验例1第2(3)项下方法测定，获得其特征图谱，以3号峰为参照峰，计算相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。
结果显示：根据中间精密度考察结果，各特征峰的相对保留时间RSD在0.04％～0.12％范围内，相对峰面积的RSD在0.89％～2.17％范围内。不同仪器间相对保留时间RSD在0.22％～0.24％，相对峰面积RSD在0.21％～0.68％范围内，实验结果表明该特征图谱方法符合中间精密度分析要求。
不同分析人员在不同时间利用另一台Waters e2695高效液相色谱仪进行中间精密度实验，取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)6份，按照实验例1第2(3)项下方法测定，获得其特征图谱，以3号峰为参照峰，计算相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。
结果显示：根据中间精密度结果，各特征峰的相对保留时间RSD在0.04％～0.15％范围内，相对峰面积的RSD在1.08％～3.40％范围内。不同仪器间相对保留时间RSD在0.04％～0.30％，相对峰面积RSD在1.98％～2.13％范围内，实验结果表明该特征图谱方法符合中间精密度分析要求。
2、耐用性
(1)稳定性
取薤白标准汤剂冻干粉(批号：200529-724400-02)，按照实验例1第2(3)项下方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按照实验例1第2(3)项下方法测定，获得其特征图谱，以3号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。
结果显示：稳定性实验结果可知，溶液中化学成分在24小时稳定，各特征峰的相对保留时间RSD在0.01％～0.13％范围内，相对峰面积的RSD在0.55％～1.79％范围内，表明溶液在24小时内稳定性良好。
取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)按照实验例1第2(3)项下方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按照实验例1第2(3)项下方法测定，获得其特征图谱，以3号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD，结果如下。
结果显示：稳定性实验结果可知，溶液中化学成分在24小时稳定，各特征峰的相对保留时间RSD在0.07％～0.18％范围内，相对峰面积的RSD在1.50％～2.81％范围内，表明溶液在24小时内稳定性良好。
(2)不同流速考察
取薤白标准汤剂冻干粉(批号：200529-724400-02)，按照实验例1第2(3)项下方法制备供试品溶液，分别采用不同流速0.9ml/min、1.0ml/min及1.1ml/min按照实验例1第2
(3)项下方法测定，考察实验方法对于不同流速的耐用性。
结果显示：由以上数据可以看出，不同流速条件下，相对保留时间及相对峰面积RSD值均在5％以内，表明该方法对流速有较好的耐用性。
取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)，按照实验例1第2(3)项下方法制备供试品溶液，分别采用不同流速0.9ml/min、1.0ml/min及1.1ml/min按照实验例1第2(3)项下方法测定，考察实验方法对于不同流速的耐用性。
结果显示：由以上数据可以看出，不同流速条件下，相对保留时间及相对峰面积RSD值均在5％以内，表明该方法对流速有较好的耐用性。
(3)不同柱温考察
取薤白标准汤剂冻干粉(批号：200529-724400-02)，按照实验例1第2(3)项下方法制备供试品溶液，分别于不同柱温28℃、30℃、32℃下，按照实验例1第2(3)项下方法测定，考察实验方法对于不同柱温的耐用性。
结果显示：由以上数据可以看出，不同柱温条件下，相对保留时间及相对峰面积RSD值均在5％以内，表明该方法对柱温有较好的耐用性。
取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)，按照实验例1第2(3)项下方法制备供试品溶液，分别于不同柱温28℃、30℃、32℃下，按照实验例1第2(3)项下方法测定，考察实验方法对于不同柱温的耐用性。
结果显示：由以上数据可以看出，不同柱温条件下，相对保留时间及相对峰面积RSD值均在5％以内，表明该方法对柱温有较好的耐用性。
(4)不同波长考察：
取薤白标准汤剂冻干粉(批号：200529-724400-02)，按照实验例1第2(3)项下方法制备供试品溶液，分别于不同检测波长258nm、260nm、262nm下，按照实验例1第2(3)项下方法测定，考察实验方法对于不同波长的耐用性。
不同检测波长条件下，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值均在5％以内，表明该方法对波长有较好的耐用性。
取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)，按照实验例1第2(3)项下方法制备供试品溶液，分别于不同检测波长258nm、260nm、262nm下，按照实验例1第2(3)项下方法测定，考察实验方法对于不同波长的耐用性。
由以上数据可以看出，不同检测波长条件下，相对保留时间及相对峰面积RSD值均在5％以内，表明该方法对波长有较好的耐用性。
实验例3含量测定方法的建立
1、仪器、试剂及试药
同实验例1。
2、色谱条件的确认
Waters
Figure BDA0003200462010000141
C18(4.6*250mm，5μm)色谱柱，以甲醇为流动相A，水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；柱温为30℃；检测波长为260nm，在选定的条件下，腺苷与样品中其他组分色谱峰可基线分离，按腺苷峰计，理论塔板数(n)为6500，大于3000，符合分析要求，结果如下。
表10梯度洗脱程序
Figure BDA0003200462010000142
3、系统适用性
在上述选定的条件下，以腺苷为参照，进行系统适用性实验，结果见表11。
表11系统适用性实验结果表
Figure BDA0003200462010000143
结果显示：腺苷峰理论板数、分离度、拖尾因子及重复性均符合分析要求。
3、供试品溶液的制备
供试品溶液的制备方法参考《中国药典》2020年版一部冬虫夏草含量测定方法，并在该方法的基础上对提取方式、提取溶剂的类型、溶液的浓度和提取时间进行了考察。
(1)提取方式考察
分别称取薤白标准汤剂冻干粉4份，每份约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入90％甲醇10ml，密塞，称定重量，采用不同的提取方式[超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流]提取40分钟，取出，放冷，称定重量，用90％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，精密吸取续滤液10μl，注入高效液相色谱仪，按本实验例第2项的色谱条件测定，测定峰面积，计算腺苷的含量，结果见表12。
表12不同提取方式的比较
Figure BDA0003200462010000144
结果显示：不同提取方式所获得的供试品溶液中腺苷的含量差异不大，从实验操作的简单性考虑，确定采用超声处理作为供试品溶液制备的提取方式。
(2)提取溶剂种类考察
分别取薤白标准汤剂冻干粉9份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入适当溶剂(乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、水)10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入高效液相色谱仪，按本实验例第2项的色谱条件测定，测定各峰峰面积，结果见表13。
表13不同提取溶剂的比较
Figure BDA0003200462010000151
结果显示：采用乙醇、70％乙醇作为提取溶剂时，样品峰为分离，无法积分，采用甲醇、50％乙醇作为溶剂时，目标峰峰形极差，其他溶剂所得峰形正常，从含量测定的结果看，70％甲醇作为提取溶剂时，腺苷含量最高，且各特征峰分离度较好，故确定提取溶剂为70％甲醇。
(3)溶液的浓度考察
取薤白标准汤剂冻干粉适量，研细，取取约0.2g、0.5g、1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇10ml(稀释倍数为50、20、10)，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，取出，放冷，称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液10μl，注入高效液相色谱仪，按本实验例第2项的色谱条件测定，测定峰面积，计算腺苷的含量。结果见表14所示。
表14溶剂溶度的比较
Figure BDA0003200462010000152
结果显示：稀释倍数为10倍时，样品提取不完全，含量偏低，稀释倍数为20倍时，含量最高，最终确定供试品的浓度为取样量0.5g，提取溶剂量为10ml。
(4)提取时间考察
分别称取薤白标准汤剂冻干粉6份，每份0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)一定时间(20分钟、30分钟、40分钟)，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，精密吸取续滤液10μl，注入高效液相色谱仪，按本实验例第2项的色谱条件测定，测定峰面积，计算腺苷的含量，结果见表15。
表15提取时间考察
Figure BDA0003200462010000161
结果显示：不同超声时间所获得的供试品溶液中腺苷含量差异不大，为保证不同批次均能提取完全，确定提取时间为40分钟。
(5)确定的最优方法
薤白标准汤剂冻干粉供试品溶液或者薤白配方颗粒供试品溶液的制备：取薤白标准汤剂冻干粉或者薤白配方颗粒适量，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，加70％甲醇10ml，超声处理(功率250W，频率50kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：取腺苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为腺苷对照品溶液；
色谱条件：采用高效液相色谱法对上述供试品溶液进行检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，(4.6*250mm，5μm)色谱柱，以甲醇为流动相A，水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；柱温为30℃；检测波长为260nm，进样量10μl。理论板数按腺苷峰计算应不低于3000。
表16梯度洗脱表
Figure BDA0003200462010000162
实验例4含量测定方法的方法学验证
1、准确度
精密称取腺苷对照品1.296mg、2.590mg、3.583mg，分别置于250ml容量瓶中，加70％甲醇稀释并定容至刻度，作为对照品溶液。取已知含量的薤白标准汤剂冻干粉，精密称取9份，每份0.25g，分别按照0.5：1、1：1、1.5：1的量，即分别加入10ml对照品溶液，测定加样回收率，余下操作同按实验例3第2项，并计算回收率，回收率(％)＝(测得量-样品含量)/对照品加入量×100％。
结果显示：回收率实验所测得的回收率范围为104.24％～109.25％，RSD值为1.73％，符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确。
精密称取腺苷对照品1.522mg、2.294mg，分别置于250ml容量瓶中，加70％甲醇稀释并定容至刻度，作为对照品溶液②、③，精密量取对照品溶液②25ml至50ml容量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液①。取已知含量的薤白标准汤剂冻干粉，精密称取9份，每份0.25g，分别按照0.5：1、1：1、1.5：1的量，即分别加入10ml对照品溶液①、②、③，测定加样回收率，余下操作同按实验例3第2项，并计算回收率。
结果显示：回收率实验所测得的回收率范围为99.51％～108.50％，RSD值为3.31％，符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确。
2、精密度
(1)重复性：取薤白标准汤剂冻干粉6份，按实验例3第3(5)项方法制备供试品溶液并测定腺苷含量。
结果显示：重复性实验所测得薤白标准汤剂冻干粉中腺苷平均含量为0.370mg/g，其RSD为1.30％，符合方法学验证重复性要求。
取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)6份，按实验例3第3(5)项方法制备供试品溶液并测定腺苷含量，结果显示所测得薤白配方颗粒中腺苷平均含量为0.244mg/g，其RSD为0.64％，符合方法学验证重复性要求。
(2)中间精密度：不同分析人员在不同时间利用另一台Waters e2695高效液相色谱仪进行中间精密度实验。取薤白标准汤剂冻干粉6份，按实验例3第3(5)项方法制备供试品溶液并测定腺苷含量，
结果显示：中间精密度实验所测得薤白标准汤剂冻干粉中的腺苷平均含量为0.345mg/g，RSD值为2.42％，与重复性实验的腺苷含量RSD为4.94％，符合方法学验证精密度要求。
不同分析人员在不同时间利用Waters e2695高效液相色谱仪进行中间精密度实验。取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)6份，按实验例3第3(5)项方法制备供试品溶液并测定腺苷含量。
中间精密度实验所测得薤白配方颗粒中的腺苷平均含量为0.247mg/g，RSD值为1.92％，结果显示：中间精密度实验所测得薤白配方颗粒中的腺苷平均含量为0.247mg/g，RSD值为1.92％，与重复性实验的腺苷含量RSD为1.51％，符合方法学验证精密度要求。
(3)专属性
取薤白标准汤剂冻干粉供试品溶液、取薤白配方颗粒供试品溶液、腺苷对照品溶液、阴性对照溶液，按正文方法获得其色谱图，其结果见图18-19。
(4)线性
取腺苷对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含0.043689mg的溶液，作为腺苷的对照品母液，分别精密吸取对照品母液1ml、3ml、5ml、7ml，分别置于25ml、10ml、10ml、10ml容量瓶中，加70％甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，精密吸取上述溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按实验例3第2项方法测定腺苷色谱峰峰面积，以腺苷色谱峰的峰面积为纵坐标，腺苷的浓度为横坐标，观察是否呈线性；最终求得回归方程为y＝35692x–28479，R2＝0.999，其线性范围为0.001748mg/ml～0.043689mg/ml。
取腺苷对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含0.02485521mg的溶液，作为腺苷的对照品母液，分别精密吸取对照品母液1ml、3ml、5ml、8ml，分别置于25ml、10ml、10ml、10ml容量瓶中，加70％甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，精密吸取上述溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按正文方法测定腺苷色谱峰峰面积，以腺苷色谱峰的峰面积为纵坐标，腺苷的浓度为横坐标，观察是否呈线性；最终求得回归方程为y＝34496158.7672x+678.9053，R2＝0.9998，其线性范围为0.00099mg/ml～0.02486mg/ml。
(6)耐用性
1)稳定性考察：取薤白标准汤剂冻干粉，按实验例3第2项制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按实验例3第2项方法进行测定，记录腺苷峰峰面积的变化情况。取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)，按实验例3第2项制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按实验例3第2项方法进行测定，记录腺苷峰峰面积的变化情况。
结果显示：由以上数据可知，薤白标准汤剂冻干粉24小时内腺苷的峰面积RSD值为0.30％，薤白配方颗粒24小时内腺苷的峰面积RSD值为1.04％，溶液稳定性良好，符合分析要求。
2)不同流速的考察：取薤白标准汤剂冻干粉，按实验例3第2项供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别采用不同流速(0.9ml/min、1.0ml/min及1.1ml/min)按实验例3第2项方法进行测定，考察实验方法对于流速的耐用性。取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)，按实验例3第2项制备供试品溶液，分别采用不同流速(0.9ml/min、1.0ml/min及1.1ml/min)按实验例3第2项方法进行测定，考察实验方法对于流速的耐用性。结果显示：采用不同流速测得的薤白标准汤剂冻干粉中腺苷含量的RSD为0.20％，采用不同流速测得的薤白配方颗粒中腺苷含量的RSD为1.29％，表明该方法对流速有较好的耐用性。
3)不同柱温考察：取薤白标准汤剂冻干粉，按实验例3第2项供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别于不同柱温(28℃、30℃及32℃)按实验例3第2项方法进行测定，考察实验方法对于柱温的耐用性。取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)，按实验例3第2项制备供试品溶液，分别于不同柱温(28℃、30℃及32℃)按实验例3第2项方法进行测定，考察实验方法对于柱温的耐用性。结果显示：采用不同柱温测得的薤白标准汤剂冻干粉中腺苷含量的RSD为0.97％，采用不同柱温测得的薤白配方颗粒中腺苷含量的RSD为0.40％，表明该方法对柱温有较好的耐用性。
4)不同检测波长考察：取薤白标准汤剂冻干粉，按实验例3第2项供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别于不同波长(258nm、260nm、262nm)按实验例3第2项方法进行测定，考察实验方法对波长的耐用性，取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)，按实验例3第2项制备供试品溶液，分别于不同波长(258nm、260nm、262nm)按实验例3第2项方法进行测定，考察实验方法对波长的耐用性，结果显示：采用不同波长测得的薤白标准汤剂冻干粉中腺苷含量的RSD为0.74％，采用不同波长测得的薤白配方颗粒中腺苷含量的RSD为1.07％，表明该方法对波长有较好的耐用性。
5)不同品牌色谱柱考察：取薤白标准汤剂冻干粉，按实验例3第2项供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别采用不同色谱柱(安捷伦、资生堂、沃特世)按实验例3第2项方法进行测定，考察实验方法对不同色谱柱的耐用性，取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)，按实验例3第2项制备供试品溶液，分别采用不同色谱柱(安捷伦、资生堂、沃特世)按实验例3第2项方法进行测定，考察实验方法对不同色谱柱的耐用性，结果显示：采用不同品牌色谱柱测得的薤白标准汤剂冻干粉中腺苷含量RSD为2.5％，采用不同品牌色谱柱测得的薤白配方颗粒中腺苷含量RSD为1.46％，表明该方法对不同品牌色谱柱有较好的耐用性。
(7)样品测定
取薤白标准汤剂冻干粉，按实验例3第2项供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，并进行测定，结果见表17所示。
表17 17批标煎冻干粉样品测定结果
Figure BDA0003200462010000191
取薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01、KL200529-724400-02、KL200610-713800-03)按实验例3第2项方法进行测定，结果如下。
表18薤白三批配方颗粒中腺苷含量
Figure BDA0003200462010000192
Figure BDA0003200462010000201
根三批颗粒含量测定结果0.24mg/g、0.17mg/g、0.18mg/g均在颗粒含量范围内，符合标准规定。
对比例1
采用鄢海燕等发表的《瓜蒌薤白颗粒的高效液相色谱特征图谱及与组方药味的相关性》中醋酸乙酯部位的供试品溶液的制备步骤和色谱条件，对薤白配方颗粒(批号：KL200618-725800-01)进行测定。
结果见图20-21所示，从图20可以看出，采用对比例1的色谱条件对薤白配方颗粒进行测定，无法得到文献中的10个特征峰，且该方法所测薤白配方颗粒峰形较差，分离效果不好；
从图21看，采用对比例1所测得的薤白配方颗粒，未检测到腺苷的特征峰，推断可能萃取步骤导致腺苷损失。
发明所做的举例，而并非是对本发明实施方法的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)薤白供试品溶液的制备；
(2)取薤白供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水-甲醇为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→22min，流动相中甲醇的体积百分数为：5％→11％。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，检测波长为258-262nm，流速为0.9-1.1mL/min，柱温为28-32℃。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)包括，称取薤白供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)还满足如下A-C中的任意一项或者多项：
A、提取时加入10-40倍量溶剂，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为0.3-5h；
B、所述固液分离选自离心或者过滤；
C、溶剂选自甲醇、水和乙醇中的至少一种。
5.根据权利要求1-4中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用腺苷对照品和/或胸苷对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤；
优选的，每1mL对照品溶液中含0.01-0.5mg腺苷和/或含0.01-0.5mg胸苷；
更优选的，所述溶剂选自水或者体积分数不低于30％的甲醇水溶液。
6.一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱，其特征在于，所述薤白的特征图谱选自如下(1)-(5)中任意一项：
(1)其具有腺苷峰和胸苷峰；
(2)其具有4个共有特征峰，按照出峰时间依次编号，1号峰为胸苷峰，2号峰为共有特征峰，3号峰为腺苷峰，4号峰为共有特征峰；
(3)其具有4个共有特征峰，以腺苷峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.73(峰1)、0.88(峰2)、1.00(峰3)和1.12(峰4)；
(4)其具有4个共有特征峰，保留时间分别为12.467min、14.149min、17.165min、19.20min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<5.0％、RSD<3.0％、<0.5％、<0.05％；
(5)采用薤白水提取物和/或其制剂按照权利要求1-5中任一所述的构建方法得到。
7.一种薤白水提取物及其制剂的对照特征图谱，其特征在于，所述薤白水提取物及其制剂的对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项：
(1)其具有4个共有特征峰，以腺苷峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.73(峰1)、0.88(峰2)、1.00(峰3)和1.12(峰4)；
(2)其具有4个共有特征峰，保留时间分别为12.467min、14.149min、17.165min、19.20min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<5.0％、RSD<3.0％、<0.5％、<0.05％；
(3)使用单批次或者多批次薤白水提取物和/或其制剂按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到的薤白水提取物和/或其制剂的特征图谱；
(4)使用多批次薤白水提取物和/或其制剂按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
8.一种薤白水提物及其制剂中腺苷的含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
薤白供试品溶液的制备；
腺苷对照品溶液的制备：
测试步骤：取薤白供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水-甲醇为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→22min，流动相中甲醇的体积百分数为：5％→11％。
9.根据权利要求8所述的薤白水提物及其制剂中腺苷的含量测定方法，其特征在于，
所述薤白供试品溶液是按照权利要求1-5中任一所述的薤白水提物及其制剂的特征图谱的构建方法中的步骤(1)的方法进行制备；所述测试步骤是按照权利要求1-5中任一所述的薤白水提物及其制剂的特征图谱的构建方法中的步骤(2)的方法进行测试。
10.一种薤白水提物及其制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测薤白产品的指纹图谱与薤水提物及其制剂的对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测薤白产品的指纹图谱为使用待测薤白水提物或者其制剂产品按照权利要求1-5中任一所述的构建方法得到，所述薤白水提物及其制剂的对照指纹图谱为权利要求7所述的薤白水提物及其制剂的对照指纹图谱；和/或，包括将待测薤白产品按照权利要求8或9所述的薤白水提物及其制剂中腺苷的含量测定方法测定含量的步骤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114062563A (zh) * 2021-12-09 2022-02-18 吉林修正药业新药开发有限公司 一种枳实薤白桂枝汤hplc特征图谱构建方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104215702A (zh) * 2013-06-04 2014-12-17 吉林康乃尔药业有限公司 丹蒌片指纹图谱检测方法
CN107202853A (zh) * 2017-06-30 2017-09-26 吉林省东方制药有限公司 血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104215702A (zh) * 2013-06-04 2014-12-17 吉林康乃尔药业有限公司 丹蒌片指纹图谱检测方法
CN107202853A (zh) * 2017-06-30 2017-09-26 吉林省东方制药有限公司 血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEUNGJOO LEE ET AL: "Antidepressant-like activity of the aqueous extract of Allium macrostemon in mice" *
刘红;陈燕芹;邓峰;贾娇;: "反相高效液相色谱法同时测定小根蒜中尿苷、鸟苷和腺苷" *
鄢海燕;邹纯才;朱磊;章圣朋;周文莉;王洁;: "瓜蒌薤白正丁醇部位腺苷含量及特征图谱" *
马杰,王乃利,高培红,姚新生: "RP─HPLC法测定中药薤白中腺苷的含量" *
黄瑜 等: "HPLC 法同时测定小根蒜中8 种碱基和核苷类成分的含量" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114062563A (zh) * 2021-12-09 2022-02-18 吉林修正药业新药开发有限公司 一种枳实薤白桂枝汤hplc特征图谱构建方法

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