CN1973855B - 一种益母草注射剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高品质的益母草注射液及其制备方法。本发明产品通过益母草注射剂HPLC指纹图谱标准，锁定益母草注射剂物质基础的整体特征性物质，优化提取工艺，提高注射剂整体特征性物质基础的一致性，使产品质量稳定一致。

Description

一种益母草注射剂

技术领域

本发明涉及高品质的益母草注射剂。 

背景技术

中药材因种子、产地及生长条件、收采日期等因素的影响，其品质往往存在较大差异，内在物质的组成和比例也相应存在较大差异；通常中药产品中，其有效物质基础不仅受药材的影响，工艺参数的合理性和波动也严重影响内在组份和组成比例的一致性。部分中药产品，特别是中药注射剂因这些不可控因素使同一品种不同生产时期的中药注射剂存在很大差别。近年来，由于人们对药品的认识水平和消费水平均大幅度提高，对中药注射液的负面评价呈上升趋势，中药注射液已陷入了疗效信任危机之中，规范提高中药注射剂的生产水平，提高质量控制水平，提高中药注射剂的质量标准，规范中药注射剂的呼声高涨。国家药监局于2001年决定开展注射剂指纹图谱的研究，以提高中药注射剂的质量水平。由此可见，生产出高品质的中药产品例如中药注射剂一直是人们所期望的。 

目前，国内已有人提出了一些采用中药指纹图谱来控制中药产品质量的设想，例如，沙明等提到将HPLC指纹谱技术应用于中药新药质量控制，中草药，33(2)，第8-10页，2002；谢培山提出了中药色谱指纹图谱质量控制模式的研究与应用，世界科学技术·中药现代化，3(6)，第28-31页，2001；屠鹏飞提到中药注射液指纹图谱检测标准的实施与中药材GAP基地建设，中药研究与信息，3(10)，第17-18页。但由于中药品种的多样性，将指纹图谱技术具体化，并实际应用于某一具体中药材产品的工业化生产上，尚有相当艰难的路要走。 

益母草注射剂已有了一些相关研究报道。章崇仪报道了益母草注射剂的制备及质量控制的研究，其中涉及到益母草注射液质量控制标准的内容，中成药研究1984(9)，第12页；CN1456548A、CN1415603A涉及一种益母草碱盐及其制剂，其中公开了采用益母草总碱或其碱盐制备益母草注射液；CN1530126A、CN1262118A涉及一种含益母草的药物组合物，该组合物可制成注射剂或其它制剂，用于治疗妇科疾病和慢性肾功能衰竭。 

关于盐酸水苏碱的测定方法，同样也有相关文献报道。中国药典(一部)2000年收载了雷氏盐剩余比色法测定总生物碱量的定量方法(以盐酸水苏碱为对照)；姜舜尧报道了采用高效液相色谱法(HPLC)分析益母草药材中水苏碱成分，药物分析杂志，21(4)，第243页，2001；宋晶萍等也对益母草的盐酸水苏碱的HPLC分析法作了研究和报道，广西医药，24(8)，第1289页，2002。 

与其它中药产品一样，如何提高益母草注射剂的品质，一直是人们期望解决的问题。本发明者通过对益母草注射剂进行深入细仔的研究，确立了益母草注射剂HPLC指纹图谱标准，通过锁定益母草注射剂的整体特征性物质基础，优化提取工艺，提高注射剂整体特征性物质基础的一致性，使产品质量稳定一致，从而生产出高品质的益母草注射剂，于是完成了本发明。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高品质的益母草注射剂。 

本发明的另一目的是提供一种生产高品质益母草注射剂的制备方法。 

本发明的再一目的是提供益母草中的盐酸水苏碱的测定方法，用于控制益母草注射剂的产品质量。 

益母草注射液是市售中药产品，原有产品发布过二个执行标准，一是中国药典《1977版》标准，第493页颁布的益母草注射剂： 

本品为唇形科植物益母草制成的灭菌水溶液。含总生物碱以盐酸水苏碱(C₇H₁₃NO₂·HCl)计算，应为标示量的90-110％。 

本品可加0.5-1.0％的苯甲酸。 

【检查】PH值应为4.5-6.5(附录42页)。 

【含量测定】照比色法(附录32页)，在525nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵座标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。从标准曲线中读出供试品溶液中的含量，计算含量。 

【规格】ml:20mg。 

按其可波动的合格范围换算，本品每支含总生物碱以盐酸水苏碱(C₇H₁₃NO₂·HCl)计算，应为18-22mg。 

另一是现在执行标准，卫生部中药成方制剂第二十册WS3-B-3969-98中颁布的益母草注射液： 

本品为益母草经加工制成的灭菌水溶液。 

【制法】取益母草加水煎煮三次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.36～1.38(80℃)，加水稀释至含水量约为35％，分别以88％-95％的乙醇提取三 次，静置，滤过，回收乙醇，用活性炭(用量为0.01％-0.5％)脱色至溶液无色，加1％的苯甲醇，加注射用水使成1ml中含水苏碱20mg，脱炭，精滤，灌封，灭菌，即得。 

【含量测定】 

总生物碱：照分光光度法(附录VB)，D 525nm的波长处分别测定吸收度，用空白试剂的吸收度分别减去对照品与供试品的吸收度，计算，即得。 

【规格】1ml:20mg。 

按其可波动的合格范围换算，本品每支含总生物碱以盐酸水苏碱(C₇H₁₃NO₂·HCl)计算，应为18-22mg。 

已批准上市的中药注射剂，由于注射用中药材的质量受种子来源、产地、采收期等因素的影响；由于受生产工艺波动的影响，中药注射制剂的质量稳定性在生长的时期内没有很好的保证，已有质量标准的各项控制指标和手段，对注射剂的质量不能达到有效控制。 

同样，对于益母草注射剂而言，虽然上述已有标准中给出了每1ml注射剂中含总生物碱以盐酸水苏碱计算应为18-22mg的含量标准，考虑到中药制剂成分复杂，影响因素较多，选用已有标准中规定的比色法分析，在测定的盐酸水苏碱含量符合要求的情况下，并不能确保注射剂品质的一致性。 

本发明者按照国家药监局颁布的《中药注射剂指纹图谱技术要求》和《中药注射剂指纹图谱研究指南》的思路，采用HPLC法，研究并确立了益母草注射液指纹图谱，用以控制产品的质量。本发明中，采用选择性好、灵敏度高的HPLC法，对现在执行标准加以补充，以确保益母草注射剂的品质，对益母草注射剂品质的提高是大有裨益的。 

本发明采用HPLC法，以离子型键合相为分离基质，通过包含有离子交换在内的混合保留机理，使益母草注射剂中盐酸水苏碱得以分离，从而测定其含量。 

不仅如此，本发明还通过成份改变和优化的工艺，来提高益母草注射剂的品质。 

在具体的实施方案中，本发明益母草注射剂为益母草经加工制成的灭菌水溶液。本发明产品的制备工艺如下：取益母草加水煎煮多次，例如2-5次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.36～1.38(80℃)，分别以不同浓度的乙醇提取，静置，滤过，回收乙醇，用适量活性炭脱色至溶液无色或淡黄色，加注射用水使至所需浓度规格，例如成1ml中含总生物碱约20mg，脱炭，精滤，灌封，灭菌，即得。与现有 技术不同的是，本发明工艺在采用常规工艺制得醇沉液后，在加入适量活性炭例如(用量为醇沉液量的0.01％-0.5w/v％)除热原、脱色的同时加入吸附剂，吸附剂是例如选自滑石、膨润土、硅藻土和陶土等矿物中的一种或多种，优选含有已灭菌活化的滑石：硅藻土(1∶0.1-10)，按0.5％-5％(以醇沉液量计，w/v％)混合于药液中存放一段时间，可以是例如12-48小时，通常12-24小时即可，视需要，此段时间可以稍短或更长，脱色至溶液无色或淡黄色，之后不添加苯甲醇或苯甲酸，并在脱炭的同时脱除吸附剂，然后直接进行脱炭之后的步骤。所述的活化是指：高温或其他物理条件的处理。 

现有工艺采用乙醇除杂，专一性差，在除杂的同时，其有效组分含量大幅下降，而需除去的离子则需多次醇沉也不易去掉。而本发明工艺则将醇沉工艺与专一的吸附工艺相结合，严格控制钾离子，显著提高产品质量。活性炭虽然也是吸附性能，但本发明的给出的矿物吸附剂可以显著提高产品的各种性能指标，从而提升产品的品质。 

具体地说，本发明产品由于工艺优化，去除了注射液中钾离子，而取消了原益母草注射液因肌注疼痛而加入的苯甲醇，并具有减轻注射疼痛的效果。 

本发明产品是一种高品质的注射剂，该注射剂理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，每供试品中含10μm以上微粒≤4000粒，含25μm以上微粒≤400粒。不溶性微粒检测法为：取样品50ml，照“中国药典2005版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查。较之于现有产品的每供试品中含10μm以上微粒小于6000粒，含25μm以上微粒小于600粒，品质有了很大的提高。 

此外，本发明产品还具有如下性能： 

蛋白质取本品1ml，加新配制的30％磺基水杨酸试液1ml，混合。放置5分钟，未出现浑浊，符合规定； 

鞣质取本品1ml，加新配制的含1％鸡蛋清的生理氯化钠溶液5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定； 

树脂  取本品5ml，加盐酸1滴，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定； 

草酸盐：取本品适量，用稀盐酸调节PH值至1～2，滤过，取滤液2ml，滤液调节PH至5～6，加3％氯化钙溶液2～3滴。放置10分钟，未出现浑浊或沉淀。 

本发明指纹图谱的确定和含量测定条件如下： 

指纹图谱照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID测定)及《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》 

色谱条件与系统适用性试验  仪器：Waters 2690液相色谱仪；色谱柱：Aicbrom Bond-AQ C18 4.6mm×250mm，5μm；流动相：0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(用0.1％磷酸调pH至5.5)；柱温：30℃；波长：242nm；以随行系统参照物进行试验，出现的色谱峰应不少于参照图谱，图形应相似。连续进样5针，其图形间的相似度应不低于0.99。 

随行系统参照物溶液的制备取随行参照物一支，加300μl水使溶解，即得。随行参照物合成的标准指纹图的标样。 

供试品溶液的制备：益母草注射剂作为供试品溶液。 

测定法分别精密吸取随行系统参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，设置积分参数，积分峰面积；用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度软件计算，益母草注射剂标准指纹图与本品的相似度应不低于0.9。 

确定的指纹图谱是益母草注射剂生产过程中原料采集，中间体、成品生产及产品稳定性质控标准图谱，具有专一性和独创性。用标准指纹图检测用本发明工艺制备的产品中无苯甲醇峰存在。 

【含量测定】总生物碱 

对照品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品25mg，置25ml量瓶中，用0.1mol/l盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含盐酸水苏碱1mg)。 

供试品溶液的制备精密量取本品5ml，置100ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至度，摇匀，即得。 

测定法分别精密量取对照品溶液、供试品溶液、0.1ml/L盐酸溶液各10ml，分别置于三个25ml量瓶中，各精密加入新制的2％硫氰酸铬铵溶液3ml，摇匀，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，置冰浴中放置1小时，滤过，弃去初滤液，取续滤液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白。照分光光度法(附录V B)，D 525nm的波长处分别测定吸收度，用空白试剂的吸收度分别减去对照品与供试品的吸收度，计算，即得。 

盐酸水苏碱照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID测定) 

色谱条件与系统适用性试验  用磺酸基团键合硅胶(SCX)的阳离子交换剂为填充剂；以0.05±0.02mol/L磷酸二氢钾-三乙胺100∶0.1±0.05，用磷酸调pH值至2.3±0.5为流动相；检测波长为203nm。理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于1500。 

对照品溶液的制备精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加流动相配制成每1ml含0.4mg的溶液，即得。 

供试品溶液的制备精密量取本品1ml，置25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。 

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 

本发明产品具有附图2所述的标准图谱。并且分光光度法测每1ml注射液中含总生物碱以盐酸水苏碱为20mg时，采用HPLC法测定含盐酸水苏碱不少于8mg。 

附图说明

图1是盐酸水苏碱对照品图谱。 

图2是益母草注射液标准指纹图谱。 

图3是益母草注射液标准曲线。 

图4是本发明益母草注射液的液相色谱图。 

图5是市售益母草注射液的的液相色谱图。 

具体实施方式

实施例1益母草注射液的制备 

取益母草加水煎煮三次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.36-1.38(80℃)，加水稀释至含水量约为35％，分别以88％-95％浓度的乙醇提取三次，静置，滤过，回收乙醇，加入活性炭(用量为0.1％)和已灭菌活化的滑石∶硅藻土(1∶1)的吸附剂(用量为1％)混合物药液中脱色至溶液无色或淡黄色，并存放24小时后，加注射用水使成1ml中含总生物碱约20mg，脱炭和吸附剂，精滤，灌封，灭菌，即得益母草注射液。照分光光度法(附录VB)，D525nm波长处测定，生物总碱以盐酸水苏碱计含量为20mg/ml，采用实施例3中给出的HPLC法测定，盐酸水苏碱含量为13.78mg/ml。采用实施例4的指纹图谱色谱条件测定，测出的图谱用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度软件计算，本品与标准指纹图谱的相似度为0.99。 

该注射液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测： 

不溶性微粒取样品50ml，照“中国药典2005版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，每供试品中含10μm以上微粒小于4000粒，含25μm以上微粒小于400粒。 

蛋白质取本品1ml，加新配制的30％磺基水杨酸试液1ml，混合。放置5分钟，未出现浑浊，符合规定； 

鞣质取本品1ml，加新配制的含1％鸡蛋清的生理氯化钠溶液5ml，放置10分 钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定； 

树脂取本品5ml，加盐酸1滴，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定； 

草酸盐：取本品适量，用稀盐酸调节PH值至1～2，滤过，取滤液2ml，滤液调节PH至5～6，加3％氯化钙溶液2～3滴。放置10分钟，未出现浑浊或沉淀。 

实施例2益母草注射液的制备 

取益母草加水煎煮三次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.36-1.38(80℃)，加水稀释至含水量约为35％，分别以88％-95％浓度的乙醇提取三次，静置，滤过，回收乙醇，加入活性炭(用量为0.5％)和含有已灭菌活化的滑石∶硅藻土(1∶1)的吸附剂(用量为3％)混合物药液中脱色至溶液无色或淡黄色，并存放24小时后，加注射用水使成1ml中含总生物碱约20mg，脱炭和吸附剂，精滤，灌封，灭菌，即得益母草注射液。照分光光度法(附录VB)，D525nm波长处测定，生物总碱以盐酸水苏碱计含量为20mg/ml，采用实施例3中给出的HPLC法测定，盐酸水苏碱含量为13.46mg/ml。采用实施例4的指纹图谱色谱条件测定，测出的图谱用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度软件计算，本品与标准指纹图谱的相似度为0.98。 

该注射液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测： 

不溶性微粒取样品50ml，照“中国药典2005版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，每供试品中含10μm以上微粒小于4000粒，含25μm以上微粒小于400粒。 

蛋白质取本品1ml，加新配制的30％磺基水杨酸试液1ml，混合。放置5分钟，未出现浑浊，符合规定； 

鞣质取本品1ml，加新配制的含1％鸡蛋清的生理氯化钠溶液5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定； 

树脂取本品5ml，加盐酸1滴，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定； 

草酸盐：取本品适量，用稀盐酸调节PH值至1～2，滤过，取滤液2ml，滤液调节PH至5～6，加3％氯化钙溶液2～3滴。放置10分钟，未出现浑浊或沉淀。 

实施例3益母草注射液盐酸水苏碱的HPLC检测 

(一)实验仪器和试药 

(1)仪器： 

Waters717-Waters2487-M32工作站 

Waters2690-Waters2487-M32工作站 

色谱柱：Alltech SCX 5μ(4.6×250mm) 

Phenosphere SCX 5μ(4.6×250mm) 

MILLIPORE超纯水制备仪 

(2)试药 

样品由成都市时代第一药物研究所有限公司提供。 

对照品中国药品生物制品检验所(盐酸水苏碱，批号：712-9903，供含量测定用) 

试剂磷酸二氢钾为成都化学试剂厂生产，水为超纯水，其余试剂为分析纯。 

(二)色谱条件 

(1)检测波长：203nm。 

(2)分析柱Alltech SCX 5μ(4.6×250mm)阳离子交换色谱柱，以0.05mol/L磷酸二氢钾-三乙胺(100∶0.1)(以磷酸调pH至2.3)为流动相，结果在203nm波长处，对照品和样品均有最大吸收峰，样品中盐酸水苏碱峰与相邻峰分离度大于1.5，理论塔板数以盐酸水苏碱峰计算均大于2000。 

(3)流动相以0.05mol/L磷酸二氢钾-三乙胺(100∶0.1)(以磷酸调pH至2.3)为流动相，流速1ml/min，柱温：30℃。对照品、供试品色谱图见附图1、2。 

(4)色谱条件的评价 

通过不同的人、色谱系统和研究对象对色谱条件及系统适用性进行考察，结果如下： 

1.分离度：样品中盐酸水苏碱的峰能与其它杂质峰达到良好的分离，分离度R≥1.5。 

2.理论板数：对照品及样品中盐酸水苏碱峰的理论板数不小于2000。 

(5)结论用磺酸基团键合硅胶(SCX)的阳离子交换剂为填充剂；以0.05mol/L磷酸二氢钾-三乙胺(100∶0.1)(以磷酸调pH值至2.3)为流动相；检测波长为203nm。理论板数按盐酸水苏碱峰计不低于2000的色谱条件能满足检测要求。 

(三)供试品溶液的制备 

由于样品为注射液，在澄明度和微粒上都有严格控制，并且尽量保留注射液中各物质的实际存在状态，所以我们采用样品直接稀释后进样的方法。 

(四)稳定性试验 

样品稳定性：通过对同一样品在室温放置0、1、2、4、8、24小时的考察，其 稳定性较好，RSD＝1.4％，表明供试品溶液在24小时内测定，结果稳定。结果见表1。 

表1益母草注射液稳定性的考察 

对照品溶液稳定性：通过将浓度为0.0816mg/ml的盐酸水苏碱对照品溶液在室温的条件下放置0、1、2、4、8、24小时的考察，其稳定性较好，RSD＝1.25％，表明对照品溶液在24小时内测定，结果稳定。结果见表2。 

表2对照品溶液稳定性的考察 

(五)方法学研究 

(1)对照品溶液精密度 

精密吸取浓度为0.452mg/ml的盐酸水苏碱对照品溶液10μl注入液相色谱仪5次，记录色谱图，按峰面积计算，结果见表3。说明进样精密度能满足本品的含量测定要求。 

表3盐酸水苏碱对照品溶液的精密度 

(2)线性范围 

精密吸取浓度为0.328mg/ml的盐酸水苏碱对照品溶液5μl、10μl、20μl、30μl、40μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表4，以峰面积为横坐标，盐酸水苏碱对照品进样量为纵坐标，绘制标准曲线见图，  得回归方程。Y＝2.8637E-06X+0.6571，r＝0.9996。显示盐酸水苏碱在1.64～13.12mg范围内有良好的线性关系。 

表4盐酸水苏碱对照品线性试验结果 

(3)重复性试验 

取益母草注射液(批号040807)按含量测定项下供试品制备方法平行操作5次，并测定，结果列于表5。 

表5重复性试验结果 

(4)回收率试验 

精密吸取样品(批号为040806，盐酸水苏碱含量为13.04mg/ml)0.5ml，共5份，分别精密加入盐酸水苏碱对照品6.32mg，加水稀释至1ml，按质量标准正文含量测定项下盐酸水苏碱含量测定方法测定，按下述计算式计算回收率，结果见表6。如表所示，本方法加样回收平均回收率为98.0％，RSD为1.8％，由计算结果可知此提取方法的准确度较好。 

表6加样回收率试验结果 

(5)十六批样品的含量测定 

按本发明的检测方法，测定16批样品，其结果见表7。 

表7十六批样品含量测定结果 

根据16批样品测定结果可见，本品的含量测定限度为每1ml含盐酸水苏碱大于8mg。 

实施例4指纹图谱的确定 

【指纹图谱】照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID测定)及《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》。 

(一)仪器、设备 

使用同一根色谱柱，在柱温、流动相、检测波长相同的情况下，分别在两种型号的仪器上试验。 

1、Waters 2690型高效液相色谱仪，Waters 2487检测器； 

同一天连续进样五次，色谱峰的保留时间重复性很好。 

2、Agilent 1100型高效液相色谱仪：在同一天连续进样五次，色谱峰的保留时间重复性很好。 

在两种型号的仪器上的试验结果表明，使用Waters和Agilent的高效液相色谱仪测定的重复性均好，均可用于益母草注射液水溶性成分指纹图谱的测定，但前者峰形更好，故优选Waters 2690型高效液相色谱仪。 

(二)色谱条件与系统适用性试验仪器：Waters 2690液相色谱仪；色谱柱：Aichrom Bond-AQ C₁₈ 4.6mm×250mm，5μm；流动相：0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(用0.1％磷酸调pH至5.5)；柱温：30℃；波长：242nm；以随行系统参照物进行试验，出现的共有色谱峰应不少于参照图谱，图形应相似。连续进样5针，其图形间的相似度应不低于0.99。 

随行系统参照物溶液的制备取随行参照物一支，加300μl水使溶解，即得。 

供试品溶液的制备取益母草注射液作为供试品溶液。 

测定法分别精密吸取随行系统参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至15分钟，设置积分参数，以峰面积百分率约为0.4％的色谱峰的峰面积设为最小峰面积值；用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度软件计算本品与标准指纹图谱的相似度，应不低于0.9。 

(三)指纹图谱标准的表达内容说明 

指纹图谱标准的主要内容，包括仪器型号及系统适用性的描述，测定方法，相似度计算，相似度限度5个内容。其中系统适用性是决定标准执行成功的关键，它不能按含量测定的方法来描述，其评价指标包括色谱条件，检测条件，记录时间，数据处理参数，系统的稳定性等；测定方法包括供试品溶液制备、进样方法、相似度计算(关键是计算软件的选择和计算方法)；相似度限度根据成品的稳定性、测定方法的重复性、被测定样品的组分的复杂性来决定。 

1、色谱条件与系统适用性 

指纹图谱的测定对色谱条件和仪器的参数控制要求非常高，本标准中使用的色谱分离柱为水性柱，由于水性柱的稳定性不及常用的十八烷基键合硅胶柱，因此系统适用性中，以进样精密度来考察色谱柱是否达到平衡要求；使用仪器规定为WATERS公司生产的2690或2695，检测器为2487，用AGILENT生产的1100液相色谱仪检测器为VWD G1314A测定，除指纹图的保留时间因死体积不同造成差异外，图形基 本相似，如在控制死体积的条件下，同样可用此种仪器测定，由于色谱柱的分离状态、检测器的能量都处于动态，对于系统适用性的控制，以使用随行系统参照物来评价最为有效。关于随行系统参照物的制备有三种，现正在进一步的考察当中，初步拟定用冻干作为随行系统参照物。以随行系统参照物进行试验，出现的共有色谱峰应不少于参照图谱，图形应相似。连续进样5针，其图形间的相似度应不低于0.99，以评价系统是否完全达到平衡。 

2、样品处理及测定方法 

由于样品为注射液，在澄明度和微粒上都有严格控制，并且尽量保留注射液中各物质的实际存在状态，为简化样品制备过程，保证信息的完整性，并能与流动相匹配，采用注射液直接进样的方式。进样量10μl。测定方法为水性色谱柱-磷酸盐缓冲溶液(pH5.5)一等度洗脱为流动相作为分离条件，一张色谱图即完成分离测定。 

3、数据处理方法 

在化学药品有关物质检测时一般以1％作为有关物质限度，所设最小峰面积应保证大于总峰面积1.0％的色谱峰的检出。因本品总体信息量较少，设置积分参数时，以峰面积百分率约为0.4％的色谱峰的峰面积设为最小峰面积值。域值应保证即可排除基线噪音影响又能检测出指纹峰的信息。 

4、相似度限度 

用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度软件考察16批样品与标准指纹图谱的相似度，表明相似度均大于0.95，高于0.9的标准。 

(三)指纹图谱标准的方法验证 

1、重复性验证 

由于本标准采用直接进样，色谱条件研究中的重复性实验也可视为重现性试验，当由一人在同一台仪器，在不同时间测定时，测定结果的RSD为0.2％；当由两人在同一实验室进行测定，相似度的RSD为0.5％。 

2、耐用性验证 

为了验证本标准在不同实验室，使用不同的仪器，由生产单位检验人员按照本标准进行检验，检验结果与本实验室比较其相似度为RSD为0.93％。 

3、指纹图谱标准的整体性评价 

在展开方与色谱条件的研究中，研究重心是色谱成分的展开和检出，由于展开方法我们采用了多种色谱条件和展开模式，其中等离子对(双离子)-梯度有机溶剂展 开法，毛细管电泳法，等浓度磷酸盐反冲溶液-梯度有机溶剂展开法，均能较好的将色谱成分展开，克服了分离度影响整体性的可能；由于受展开条件的限制，质量型检测器如质谱、蒸发光散射检测器等均无用武之地，为了解决色谱成分检出率问题，曾采用了WATTERS公司996检测器及工作站的特殊功能--(MAX PLOT)最大值化，提取各色谱成分最大吸收的色谱图与不同波长的色谱图进行比较，当选择242nm为检测波长时，其色谱成分的检出率为最大值化色谱图的82％，是检出率最高的检测条件，满足了最大信息量化的原则。 

4、供试品稳定性试验 

拟用的稳定性试验方法为以0月指纹图谱为参照标准，比较不同放置时期指纹图谱的相似度，以此评价放置样品共有主组分变化；当相似度为1时，即两图形完全相同。由于色谱参数多为动态变化，即使同一个样品，也难保两张色谱图完全一致，将相似度系数定在0.90以上视为一致，以此提高评价“共有主组分变化的检出率”的可信度。 

	0月	1月	2月	3月
					参照	1	0.999	0.998	0.998

结果表明：以0月指纹图谱为参照标准，比较不同放置时期指纹图谱的相似度，均在0.95以上，表示稳定性良好。 

实施例5 

以本发明益母草注射液为样品，采用实施例4给出的液相色谱方法和条件进行测定，结果如图4。图中，S为本发明样品实测谱图，R为随行参照物样品实测谱图。结果分析表明，相似度为0.997。 

Claims (3)

1.一种益母草注射剂，采用如下工艺制备而成：取益母草加水煎煮三次，合并滤液，滤过，滤液减压浓缩至80℃相对密度为1.36～1.38，分别以88％-95％浓度的乙醇提取，静置，滤过，回收乙醇，用吸附剂处理，加注射用水稀释，精滤，灌封，灭菌，其特征在于：所述吸附剂为滑石和硅藻土的混合物与活性炭，其中，滑石和硅藻土的混合物用量为醇沉液的0.5％-5％w/v，滑石和硅藻土已灭菌活化且重量比为1∶0.1-10，活性炭用量为醇沉液的0.01％-0.5％w/v；所述吸附剂在药液中存放12-24小时；且制备过程中采用Waters2690液相色谱仪测定；指纹图谱技术检测条件为色谱柱：Aichrom Bond-AQ C184.6mm×250mm，5μm；流动相：浓度为0.1mol/L的磷酸二氢钠溶液，用0.1％磷酸调节pH值至5.5；柱温：30℃；波长：242nm；吸取相同量的随行系统参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，设置积分参数，以峰面积百分率约为0.4％的色谱峰的峰面积设为最小峰面积值，记录色谱图至15分钟，中间产物和成品与标准指纹图谱相比较，检测结果相似度应不低于0.9。

2.根据权利要求1所述的注射剂，其特征在于所述中间产物和成品与标准指纹图谱相比较，相似度应不低于0.95。

3.根据权利要求1所述的益母草注射剂，其特征在于不含苯甲醇。

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