CN102706998A

CN102706998A - 生脉注射液的质量控制方法

Info

Publication number: CN102706998A
Application number: CN2012100332173A
Authority: CN
Inventors: 欧阳强; 沙美; 夏振江; 戴德玲
Original assignee: JIANGSU SZYY GROUP PHARMACEUTICAL Ltd
Current assignee: JIANGSU SZYY GROUP PHARMACEUTICAL Ltd
Priority date: 2012-02-15
Filing date: 2012-02-15
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明涉及一种注射液的质量控制方法。特别涉及生脉注射液的质量控制方法。本发明提供了一种采用高效液相色谱法控制生脉注射液制剂的质量的方法，该方法能够快速准确的对生脉注射液中的人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd和五味子醇甲进行精确的定性和定量分析。本发明提供的质量控制方法具有良好的精密度、稳定性和重复性，能够更全面、有效、简便的达到控制生脉注射液质量的目的。

Description

生脉注射液的质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种中药注射剂的质量控制方法，具体是指生脉注射液的质量控制方法。本质量控制方法包括含量测定方法及特征峰的定性和定量方法。

背景技术

生脉注射液的处方源自古方生脉散，由红参、麦冬、五味子三味药材经过提取后制成的灭菌水溶液。该品种最初由华西医科大学研制，现收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十五册(WS3-B-2865-98)，2001年被列为国家中药保护品种。现阶段可生产生脉注射液的企业有十余家，已申请该品种中药保护的企业有8家。

由于其在临床上用于治疗气阴两亏，脉虚欲脱的心悸、气短、四肢厥冷、汗出、脉欲绝及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等具有上述证候者所取得的良好的效果。其应用也越来越广泛。但是随着临床研究的不断深入及国家关于中药注射剂安全性再评价工作的展开，对于生脉注射液的质量控制的研究越来越深入。

生脉注射液主要是由三味药红参、麦冬及五味子制成。其组成成分复杂，人参中的成分就分为9类，主要成分为皂苷、糖类。杨华元等用薄层扫描法测及采用薄层层析-比色法测定生脉注射液中有效成分人参总皂苷含量。

随着研究技术的不断发展，高效液相色谱法在测定物质的含量应用越来越广泛。王秀兰等采用高效液相色谱法测定生脉注射液中人参皂苷Rg1，Re的含量，色谱柱为用十八烷基硅烷键合相柱，流动相为乙睛一0.05％磷酸溶液(18∶82)，检测波长203nm，并对萃取方法进行了探讨。张梅等高效液相色谱法测定生脉注射液中人参皂甙Rb1的含量。其流动相为乙腈-甲醇-水(255∶744∶11)，用磷酸调pH至3.0，柱温30℃，流速为0.8ml/min，检测波长205nm，量程0.02A UFS。闻俐毓等用HPLC法测定生脉注射液中人参皂苷Re的含量，以C18柱，乙睛-0.05％磷酸(19∶81)为流动相，检测波长203nm。石雪萍等采用HPLC法测定生脉注射液中五味子醇甲的含量，流动相为甲醇-水(65∶35)为流动相，紫外检测波长254nm进行测定，柱温30℃，流速1.0ml/min。于敏等建立新生脉注射液中人参皂苷Rg2的含量测定方法，采用高效液相法，色谱柱为C18柱，流动相为甲醇-水(65∶35)，检测波长203nm，流速1.0ml/min，柱温为25℃。王琴等采用RP-HPLC测定生脉注射液中皂苷Rb1含量。张伶等建立测定生脉注射液中人参皂苷Rg1和Re含量的RP-HPLC分析方法.以RP-C18色谱柱为固定相，以乙腈-磷酸溶液(质量分数0.05％)(19∶81)为流动相，检测波长为203nm，流速为1.0mL/min。白晶等采用RP-HPLC法同时测定生脉注射液中人参皂苷及Rb1与五味子醇甲的含量。李章万等用3，5-二硝基苯甲酞氯(3，5-DNB)为衍生化剂，以高效液相色谱衍生化法测定红参及生脉注射液中人参二醇和人参三醇的含量，供试品经提取，水解和衍生化等处理后，测得红参中人参二醇及人参三醇的含量约为0.9％和0.5％；生脉注射液中分别约为0.7mg/ml和0.5mg/ml，甲醇-水(95∶5)为流动相，检测波长230nm。

在卫生部药品标准中药成方制剂第十五册(WS3-B-2865-98)生脉注射液标准中的含量测定规定了人参皂甙Re及Rg1的测定，根据以上研究还应该对其它成分的含量(例如五味子醇甲)进行测定。

随着指纹图谱技术在中药材质量控制中的应用，对于生脉注射液的指纹图谱的也有研究。夏晶等以Waters symmetryshield TM-RP18(4.6mm×250mm；5.0μm)色谱柱为分析柱，以乙腈(A).水(B)为流动相，梯度洗脱，0～30min(B：100→90％)；30～40min(B：90→77％)；40～50min(B：77％)；50～85min(B：77→40％)；85～95min(B：40→0％)；95～105min(B：0％)；105～115 min(B：0→100％)；检测波长为203nm。：应用HPLC色谱法建立了生脉注射液(红参、麦冬、五味子)的指纹图谱。并应用LC-MS/MS法，以Waters symmetryshield TMRP-RP18(4.6mm×250mm；5.0μm)色谱柱为分析柱，以乙腈-水为流动相，梯度洗脱；检测波长为203nm。离子阱质谱。对生脉注射液20个特征峰进行确认，使其中的10个特征峰得到了确认。目前该技术已经应用于生脉的质量控制。

2004年1月1日至2011年9月30日，国家药品不良反应监测中心病例报告数据库共收到生脉注射液严重不良反应/事件病例报告508例。严重不良反应/事件病例报告中，过敏反应问题较为突出，临床主要表现为：过敏性休克、严重过敏样反应、呼吸困难、喉水肿、剥脱性皮炎等。其中表现为过敏性休克的90例，表现为严重过敏样反应的89例，过敏性休克和严重过敏样反应共计179例，约占严重病例的35.2％。基于以上情况，国家食品药品监督管理局建议中强调了要完善生产工艺、提高产品质量标准，并开展相应的安全性研究。本发明对于提高产品质量及为进行相应的安全性研究奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种多指标成分定性定量控制生脉注射液质量的方法。该方法简便易行，可以直接对生脉注射液进行6种成分进行定性和定量分析，且方法具有良好的精密度、稳定性和重复性。

为实现本发明，提供如下技术方案：

A.供试液样品的制备方法：取生脉注射液，过0.45μ微孔滤膜后备用；

B.对照溶液的制备：取人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd和五味子醇甲对照品适量，精密称定，加甲醇制成混合溶液，即得；

C.液相检测条件：固定相采用C18；柱温30℃，以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，按梯度洗脱；检测波长为203nm。

液相色谱法中梯度洗脱条件为：0～10分钟，26％乙腈；10～45分钟，26％→32％乙腈；45～60分钟，32％→40％乙腈；60～70分钟，40％→60％乙腈；70～72分钟，60％→100％乙腈；72～90分钟，100％乙腈。

上述方法优选的技术方案为：

B.对照品溶液的制备方法：取人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd和五味子醇甲对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含0.05mg、0.20mg、0.10mg、0.10mg、0.10mg和0.02mg的混合溶液；

C.液相检测条件：固定相采用C18柱；柱温30℃，以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，按梯度洗脱；检测波长为203nm。

流动相流速1.0ml/min，紫外检测器检测，进样量20μl，运行90min。

上述固定相采用的C18柱为Waters symmetry shieldTM RP18色谱柱，4.6mm×250mm；5.0μm。

从色谱图中得到色谱峰分别为：人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd和五味子醇甲。见附图1。

本发明生脉注射液的质量控制方法有益之处：与现有的标准相比具有测定条件较简单、测定成分较多、方法的精密度、重复性等均较好的优点。本发明的供试品制备简便，对峰的定性和定量较为准确。本测定方法简便易行，为生脉的质量控制检测节省时间与步骤，为企业检测化验降低成本。

附图说明

图1生脉注射液6种成分含量测定色谱图

图2不同的流动相梯度对峰的影响

图3不同的流速对峰的影响

图4生脉注射液中6个峰及其保留时间

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。

实施例1：10批生脉注射液质量控制方法确定

1.1仪器与试剂

仪器：Agilent 1100高效液相色谱，G1322A DEGASSER，G1311A QUAT PUMP，G1313A ALS

检测器：G1314A VWD检测器

工作站：LC系统化学工作站

柱温箱：HCT-360 HPLC COLUMN COOLER/HEATER

色谱柱：Waters symmetry shieldTM RP18色谱柱(4.6mm×250mm；5.0μm)

检测波长：203nm；流速为1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl。

试剂：乙腈为色谱纯(product of Tedia，USA)，其它试剂均为分析纯，水为饮用纯净水。

对照品：

人参皂苷Rb1：四川维克奇生物科技有限公司，HPLC≥98％，批号：110323；

人参皂苷Rb2：四川维克奇生物科技有限公司，HPLC≥98％，批号：101114；

人参皂苷Rc：四川维克奇生物科技有限公司，HPLC≥98％，批号：110604；

人参皂苷Rd：四川维克奇生物科技有限公司，HPLC≥98％，批号：110801；

人参皂苷Rf：四川维克奇生物科技有限公司，HPLC≥98％，批号：110904；

五味子醇甲：中国药品生物制品检定所，批号：110857-201010。

供试品：

生脉注射液：江苏苏中药业集团股份有限公司，批号：10070504、10030304、10062504、09031904、11031205、10043003、10051909、10040805、10121503、10102804。

1.2色谱条件优化

1.2.1检测波长的选择

据有关文献及《生脉注射液修订标准(草案)》中的含量测定方法，测定人参中所含特征成分人参皂苷的波长均为203nm。在对生脉注射液的指纹图谱研究中发现随着波长的增加，色谱峰减少且峰面积变小，在203nm波长处色谱峰数最多且峰响应值最高，故选择人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd和五味子醇甲的检测波长为203nm。

1.2.2流动相筛选

《生脉注射液修订标准(草案)》中的含量测定方法中以乙腈-水为流动相。而文献中报道流动相为乙腈-水相和乙腈-0.05％磷酸水。为了考查两个流动相对本含量测定方法的影响，进行了这2个流动相体系的考查。

(1)乙腈-0.05％磷酸水梯度，

0～15min，乙腈23％；15～30min，乙腈23→29％；30～50min，乙腈29％；50～65min，乙腈29→34％；71→66min，乙腈65～70％；34→100min，乙腈66→0％100min，乙腈0％。

(2)乙腈-0.05％磷酸水梯度

0～15min，乙腈23％；15～30min，乙腈23→30％；30～50min，乙腈30％；50～60min，乙腈30→34％；60～70min，乙腈34→100％；70～80min，乙腈100％

(3)乙腈-0.05％磷酸水梯度

0～15min，乙腈23％；15～30min，乙腈23→29％；30～55min，乙腈29％；55～70min，乙腈29→34％；70～80min，乙腈34→100％；80～90min，乙腈100％。

(4)乙腈-0.05％磷酸水梯度

0～10min，乙腈26％；10～45min，乙腈26→32％；45～60min，乙腈32→100％；60～70min，乙腈100％。

(5)乙腈-0.05％磷酸水梯度

0～10min，乙腈25％；10～45min，乙腈25→32％；45～55min，乙腈32→60％；55～65min，乙腈60→100％；65～80min，乙腈100％。

(6)乙腈-0.05％磷酸水梯度

0～10min，乙腈26％；10～45min，乙腈26→32％；45～60min，乙腈32→40％；60～70min，乙腈40→60％；70～72min，乙腈60→100％；72～90min，乙腈100％。

(7)乙腈-水梯度

0～10min，乙腈26％；10～45 min，乙腈26→32％；45～60min，乙腈32→40％；60～70min，乙腈40→60％；70～72min，乙腈60→100％；72～90min，乙腈100。

结果显示乙腈-0.05％磷酸水体系中的梯度6的色谱峰较好，其分离度均各个峰符合要求。相对于乙腈-水流动相体系相比峰较好，并且色谱柱的平衡时间较短。见附图2。

1.2.3柱温的选择

在25℃、30℃、35℃柱温下分析样品，结果：每个条件下各测试两次。主峰的拖尾因子不大于2.0，主峰与杂质峰达到基线分离；各条件下的含量数据(n＝6)的相对标准差应不大于3.0％。但柱温过高，对色谱柱中填料会有不利影响，引起样品中不稳定成分的变化，综合考虑各方面因素，色谱分析柱温选择30℃。

1.2.4流速的选择

考查流速为0.8ml/min，1.0ml/min，1.2ml/min时仪器色谱行为的变化，其结果是流速对于峰的分离度有重要影响，流速为0.8ml/min和1.2ml/min时峰的分离度不好。结果见附图3

1.2.5图谱峰的指认

根据前期的实验结果，对单个的对照品进行进样，根据保留时间，确定其特征峰。结果见附图4。

实施例2 生脉注射液质量控制方法论证

1.1系统适用性实验

取6份供试品溶液按照高效液相色谱法进行测定，考查6个待测成分峰的峰面积、保留时间、峰的拖尾因子及理论塔板数等。结果6个峰的峰面积的相对标准差均不大于2.0％，6个峰保留时间的相对标准差均不大于1.0％。各峰的拖尾因子不得大于2.0，6个峰达到基线分离，主峰的理论塔板数均大于20000。具体结果见表1、表2。

表1 生脉注射液含量测定系统适用性结果(峰面积)

表2 生脉注射液含量测定系统适用性结果(保留时间)

1.2专属性实验

取不含被测成分的麦冬提取液(江苏苏中药业股份有限公司，批号：11031507)、混合对照品及生脉注射液，按照高效液相色谱法进行测定，结果空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离。

1.3线性

取对照品人参皂苷R_f14.32.mg、Rb₁25.62mg、Rc16.92mg、R_b2 9.56mg、R_d10.88mg、五味子醇甲9.96mg置20ml量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，摇匀，作为对照品混合储备溶液，精密吸取0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0ml置10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，精密取不同浓度的混合对照品溶液各20ul注入液相色谱仪，记录各个峰的峰面积，以浓度C(ug/ml)为横坐标，以峰面积A为纵坐标，进行回归，得线性方程。结果见表3。

表3 生脉注射液含量测定线性关系结果

1.4准确度实验

取生脉注射液样品5ml置10ml量瓶中，按照各个成分含量的1∶1加入人参皂苷Rf、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rd和五味子醇甲对照品混合储备溶液(浓度分别为：56.17μg/ml、234.80μg/ml、123.94μg/ml、127.27μg/ml、106.60μg/ml、26.77μg/ml)5ml，摇匀(制备6份)，滤过，取续滤液20μl，按照含量测定项下操作，计算回收量和回收率。结果见表4。

表4 生脉注射液含量测定准确度实验结果

1.5重复性试验

取人参皂苷Rf、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rd和五味子醇甲的混合对照品溶液，连续进样5次，在相同的条件下进行测试。其峰面积测量值的相对标准差应不大于2.0％。结果见表5。

表5 生脉注射液含量测定重复性结果

1.6稳定性试验

取生脉注射液的供试品溶液，分别于0、2、5、6、9h注入液相色谱仪，计算各峰面积在不同时间点的RSD。RSD均小于2.0％。说明供试品溶液在9h内稳定性良好。结果见表6。

表6 生脉注射液含量测定(μg/ml)稳定性结果

取生脉注射液的混合对照品溶液，分别于0、3、7、10、38天注入液相色谱仪，计算各峰面积在不同时间点的RSD。RSD均小于4.0％。说明对照品溶液在38天内稳定性良好。结果见表7。

表7 生脉注射液的混合对照品的稳定性考查结果

1.7定量限，检测限

分别取人参皂苷Rf、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rd和五味子醇甲的对照品储备液，用流动相稀释，当信噪比为10∶1时，人参皂苷Rf、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rd和五味子醇甲的的在203nm的定量限分别为2.330μg/ml、4.060μg/ml、5.820μg/ml、2.950μg/ml、1.461μg/ml、0.2262μg/ml。信噪比为3∶1时，人参皂苷Rf、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rd和五味子醇甲在203nm的定量限分别为0.233μg/ml、1.62μg/ml、2.91μg/ml、1.476μg/ml、0.730μg/ml、0.1131μg/ml。

1.8中间精密度实验

取6份相同浓度的生脉注射液，分别由两个分析人员使用不同的仪器(安捷伦和岛津液相)进行测试，所得12个含量数据的相对标准差不大于3.0％。说明本方法的中间精密度良好，结果见表8。

实施例3 10批生脉注射液样品(江苏苏中药业集团股份有限公司；批号：10070504、10030304、10062504、09031904、11031205、10043003、10051909、10040805、10121503、10102804)进行人参皂苷Rf、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rd和五味子醇甲得含量测定结果见表10。

表10 10批生脉注射液中含量测定结果(μg/ml)

结果说明，通过上述质量控制方法的建立，确保了生脉注射液有效成分的含量，保证了成品的质量。

Claims

1.一种生脉注射液的质量控制方法，其特征在于包括如下步骤：

C.液相检测条件：固定相采用C18；柱温30℃，以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，按梯度洗脱，检测波长为203nm。

2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于C18色谱柱是Waterssymmetry shieldTM RP18色谱柱。

3.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于梯度洗脱条件是：0～10分钟，26％乙腈；10～45分钟，26％→32％乙腈；45～60分钟，32％→40％乙腈；60～70分钟，40％→60％乙腈；70～72分钟，60％→100％乙腈；72～90分钟，100％乙腈。

4.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于测定有6个特征峰，图谱总长度为90min。

5.根据权利要求6所述的质量控制方法，其特征在于图谱中特征峰分别为：人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd和五味子醇甲。