CN110274978B - 一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分含量测定方法 - Google Patents

一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种中药成分检测方法，特别涉及一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分含量测定方法。本发明所述的检测方法，包括以下步骤：A对照品溶液制备:取人参皂苷Rg1对照品，配制成对照品溶液；B供试品溶液制备:取芪参益气滴丸，加氨水溶液超声至溶解，过C18柱，用水洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；C测定：分别吸取步骤A所得对照品溶液及步骤B所得供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图计算得出芪参益气滴丸中人参皂苷Rg1，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量。

Description

一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种中药成分检测方法，特别涉及一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分含量测定方法。
背景技术：
芪参益气滴丸为天士力心血管疾病用药市场布局的重要产品，常用于气虚血瘀型胸痹、症见胸闷胸痛，气短乏力，心悸、面色少华、自汗、舌体胖有齿痕、舌质暗或紫暗有瘀斑，脉沉或沉弦，适用于冠心病心绞痛见上述证候者，与我公司复方丹参滴丸起到相互补充作用。
芪参益气滴丸处方由丹参、三七、黄芪、降香四味组成，其中三七中皂苷成分起到重要作用。三七总皂苷主要包括三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等皂苷类成分，文献研究表明，三七总皂苷在治疗心肌缺血、心律失常、动脉硬化等疾病方面有显著疗效，是芪参益气滴丸中主要有效成分之一。
通过文献及专利查阅，与芪参益气滴丸相关专利包括药理作用、制剂工艺、药材提取和成分测定等四个方面，其中涉及有效成分测定的共有2篇，分别为《一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法》(CN103926366B)、《快速检测滴丸剂有效成分含量的近红外漫反射光谱法》(CN1982874B)。以上两专利均以丹参中丹参素为含量测定指标，对三七中皂苷类成分并无定量控制；另有文献《芪参益气滴丸多维指纹图谱研究》(陈慧贞，浙江大学硕士学位论文)中曾对芪参益气滴丸中三七成分进行指纹图谱研究，完成了三七指纹图谱测定的建立，但它们分析效率低，也并未对人参皂苷Rd进行检测，而人参皂苷Rd是芪参益气滴丸活血化瘀作用的有效成分之一，还具有镇痛作用。相比以上专利及相关文献中方法，本发明的分析方法其特点主要在于在同一次分析中可以将芪参益气滴丸三七中的成分同时进行定性及定量的测定，在定量的过程中仅使用一种对照品即可实现4种成分的同时测定，较之以往发表论文及申请专利的分析方法，本方法具有提高分析效率、降低人力物力等成本的优势。
本发明采用UPLC技术，开发芪参益气滴丸三七指纹图谱，指纹图谱对三七总皂苷中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1四种成分进行定位，并结合含量测定(一测多评)技术，以人参皂苷Rg1为参照，利用随行线性试验计算校正因子，并以校正因子对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1四种成分进行含量测定，建立三七多皂苷指纹图谱和利用单一对照品同时定量多种皂苷成分的(一测多评)含量测定检测方法，以达到全面控制产品质量的目的。
发明内容：
本发明提供一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分检测方法，所述方法包括以下步骤
A对照品溶液制备:取人参皂苷Rg1对照品，配制成对照品溶液；
B供试品溶液制备:取芪参益气滴丸，精密称定，加氨水溶液超声至溶解，通过C18小柱，用纯化水洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱至容量瓶中，定容，摇匀，过滤即得；
C测定：分别精密吸取步骤A所得的对照品溶液及步骤B供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图计算得出芪参益气滴丸中人参皂苷Rg1，使用相对校正因子计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量。
其中，超高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表梯度进行洗脱，
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000021
或
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000022
优选
A对照品溶液制备:取人参皂苷Rg1，配制成对照品溶液；
B供试品溶液制备:取芪参益气滴丸，精密称定，加氨水溶液超声至溶解，通过C18小柱，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过滤即得；
C测定：分别精密吸取步骤A所得的对照品溶液及步骤B供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图计算得出芪参益气滴丸中人参皂苷Rg1，使用相对校正因子计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，
其中，超高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表梯度进行洗脱，
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000031
或
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000032
优选的，本发明的测定方法，其中，
步骤A对照品溶液制备，方法如下：人参皂苷Rg1适量，精密称定，加甲醇制成含人参皂苷Rg1 0.105～0.195mg/ml对照溶液。
步骤B供试品溶液制备，方法如下：芪参益气滴丸的取样量为0.3g-0.6g。
步骤C测定中，流速0.38～0.42ml/min，检测波长203nm，柱温24～26℃，进样量为3μl-5μl。更有选的，步骤C测定中使用相对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时分别为0.8092～0.8944，0.9747～1.077，1.211～1.339。
进一步优选的，步骤C测定中使用相对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，三七皂苷R1对校正因子为1.250±0.011，人参皂苷Re相对校正因子为1.812±0.020，人参皂苷Rb1相对校正因子为1.426±0.023。更进一步优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
对照品溶液制备：人参皂苷Rg1适量，精密称定，加甲醇制成含三七皂苷人参皂苷Rg10.15mg/ml、对照溶液。
供试品溶液制备：取本品约0.5g，精密称定，置于15ml离心管中，加4％氨水溶液5ml，超声至溶解，通过C18小柱(优选内径1.0cm，80-100目，1.0g，预先用甲醇20ml，水20ml活化)，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得。
步骤C的色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表梯度进行洗脱，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃。
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000041
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各4μl，注入超高效液相色谱仪，记录25分钟内色谱图，使用相对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时分别为0.8092～0.8944，0.9747～1.077，1.211～1.339；三七皂苷R1对校正因子为1.250±0.011，人参皂苷Re相对校正因子为1.812±0.020，人参皂苷Rb1相对校正因子为1.426±0.023。本发明进一步提供一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分指纹图谱建立方法，所述方法，包括以下步骤
A对照品溶液制备，方法如下：
取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，精密称定，加甲醇制成含三七皂苷R10.028～0.048mg/ml、人参皂苷Rg1 0.105～0.195mg/ml、人参皂苷Re0.014～0.026mg/ml、人参皂苷Rb1 0.07～0.13mg/ml的混合对照溶液。
B供试品溶液制备:取多批次合格的芪参益气滴丸0.3g-0.6g，精密称定，加氨水溶液超声至溶解，通过C18小柱，用纯化水(优选用50ml体积)洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇(优选10ml体积)洗脱至(优选用10ml容量瓶)容量瓶中，定容，摇匀，过滤即得；
C测定：分别吸取步骤A所得的对照品溶液及步骤B供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱，其中，在测定中，超高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表梯度进行洗脱，流速0.38～0.42ml/min，检测波长203nm，柱温24～26℃，进样量为3μl-5μl。
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000042
Figure GDA0003811334010000051
或
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000052
更优选的，本发明的上述方法，步骤如下：
对照品溶液制备：取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，精密称定，加甲醇制成含三七皂苷R10.028～0.048mg/ml、人参皂苷Rg1 0.105～0.195mg/ml、人参皂苷Re0.014～0.026mg/ml、人参皂苷Rb1 0.07～0.13mg/ml的混合对照溶液，
供试品溶液制备：取多批次合格的芪参益气滴丸0.5g，精密称定，置于15ml离心管中，加4％氨水溶液5ml，超声至溶解，通过C18小柱(优选内径1.0cm，80-100目，1.0g，预先用甲醇20ml，水20ml活化)，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得。
步骤C的色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表梯度进行洗脱，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃。
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000053
Figure GDA0003811334010000061
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各4μl，注入超高效液相色谱仪，记录25分钟内色谱图，并以人参皂苷Rg1对照品峰面积为参照，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱。
本发明还提供一种芪参益气滴丸指纹图谱检测方法，所述方法，步骤如下：
供试品溶液制备:取芪参益气滴丸0.3g-0.6g，精密称定，加氨水溶液超声至溶解，通过C18小柱，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过滤即得；
测定：吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
和芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。
最优选的，本发明的上述方法，其中，
供试品溶液制备：取芪参益气滴丸0.5g，精密称定，置于15ml离心管中，加4％氨水溶液5ml，超声至溶解，通过C18小柱(优选内径1.0cm，80-100目，1.0g，预先用甲醇20ml，水20ml活化)，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得。
步骤C的色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表梯度进行洗脱，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃。
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000062
吸取供试品溶液4μl，注入超高效液相色谱仪，记录25分钟内色谱图，根据所得色谱图和芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
一种检测芪参益气滴丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量的方法，所述方法步骤如下：
【供试品溶液制备】取本品约0.5g，精密称定，置于15ml离心管中，加4％氨水溶液5ml，超声至溶解，通过YWG C18小柱(内径1.0cm，80-100目，1.0g，预先用甲醇20ml，水20ml活化)，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得。
【对照品溶液制备】取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，精密称定，加甲醇制呈含三七皂苷R10.04mg/ml、人参皂苷Rg10.15mg/ml、人参皂苷Re0.02mg/ml、人参皂苷Rb10.10 mg/ml的混合对照溶液。
【色谱条件】以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表梯度进行洗脱，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃。
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000071
【测定法】分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各4μl，注入超高效液相色谱仪，记录25分钟内色谱图，与标准图谱比对；并以人参皂苷Rg1对照品峰面积为参照，以其相应色谱峰为S峰，分别计算三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量；三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时间应在规定值的±5％范围之内。标准图谱及相对保留时间、相对校正因子见图1、下表：
相对保留时间及校正因子
待测组分 相对保留时间r<sub>i/s</sub> 校正因子f<sub>i/s</sub>
三七皂苷R<sub>1</sub> 0.8518 1.250
人参皂苷Rg<sub>1</sub> 1.000 1.000
人参皂苷Re 1.026 1.812
人参皂苷Rb<sub>1</sub> 1.275 1.426
计算公式：
Figure GDA0003811334010000072
Figure GDA0003811334010000073
人参皂苷Re含量＝f人参皂苷Re/人参皂苷Rg1×A供试品峰面积人参皂苷Re×C人参皂苷Rg1×10
A人参皂苷Rg1×称样量
Figure GDA0003811334010000081
对现将以上方法建立情况进行如下说明。
3.0研究过程
本次研究主要在复方丹参滴丸三七指纹图谱与含量测定方法基础上开展，研究内容包括：(1)开发UPLC色谱条件，同时考察指纹图谱共有峰确定及不同成分定位；(2)考察色谱条件不同仪器和不同色谱柱耐用性；(3)供试品取样量、进样量考察；(4)含量测定(一测多评法)相对保留时间和校正因子的确定；(5)指纹图谱和含量测定方法学验证。
具体研究过程如下：
3.1 UPLC色谱条件开发
3.1.1流动相洗脱程序开发
在尝试约百种梯度后，意外发现洗脱程序如下表效果最好，典型色谱图见图2。
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000082
3.1.2指纹图谱色谱峰归属及成分定位
典型色谱图中能够检测到17个色谱峰，通过采用单一组分和阴性样品确定色谱峰归属如下：17个色谱峰中1、4、6、7、9、10、13号峰来自于三七中成分；2、3、4、5、8、10、11、12号峰来自于黄芪中成分；14、15、16、17号峰来自降香中成分；16号峰来自于丹参中成分(4、10、16号峰可能存在多色谱峰重叠现象)。同时通过对照品定位分析，成功指认了三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd等色谱峰，具体见图3,4。
结合指纹图谱共有峰情况，对梯度洗脱程序进行调整，舍弃降香中色谱峰，以节约分析时间，并通过10批样品拟合，得到11个共有峰。最终确定色谱条件如下：以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表梯度进行洗脱，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃，梯度洗脱程序见下表，典型色谱图见图5，标准图谱见图6。
梯度洗脱程序
Figure GDA0003811334010000091
3.2色谱条件耐用性考察
3.2.1不同仪器耐用性
研究中分别考察了该色谱条件在Waters ACQUITY UPLC、Waters H-Class两种不同型号超高效液相色谱仪上的色谱行为，结果表明该色谱条件能够在此两种型号仪器上重现，耐用性满足需求，见图7。
3.2.2不同色谱柱耐用性
研究中分别考察了该色谱条件在不同型号色谱柱的色谱行为，结果表明该色谱条件在Waters BEH C18、Thermo Hypersil GOLD和在Phenonmenexkinetex XB-C18三种色谱柱上能够重现，耐用性满足需求，见图8。
3.3供试品取样量和进样量考察
3.3.1取样量确定
本次研究中鉴于芪参益气滴丸化学成分复杂，研究中考察了0.3g、0.5g、0.6g三种不同取样量，结果表明采用0.5g取样量时分离度较好、峰面积适中，且与装量相符合，便于操作，因此选择取样量为0.5g。
3.3.2进样量的确定
按3.1项下色谱条件，考察进样量，分别取供试品溶液3μl、4μl、5μl进样分析，结果表明进样量为4μl时，色谱峰分离度和理论塔板数最佳，故确定进样量为5μl。
3.4相对保留时间和校正因子的确定
3.4.1相对保留时间的确定
取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，于不同天配制一系列浓度的混合对照溶液，照3.1项下色谱条件进行随行线性试验，以人参皂苷Rg1色谱峰为参照峰，计算三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时间，并以每种成分的平均相对保留时间作为该成分色谱峰的相对保留时间，见下表。
相对保留时间的确定
Figure GDA0003811334010000092
3.4.2校正因子的确定
据文献资料，可采用多点法、斜率法、过原点的曲线斜率法对一测多评的校正因子进行计算，具体方法如下：
(1)多点法(MP)：即以多个浓度点计算所得校正因子的平均值作为相对校正因子fi/s，可配制不同浓度的混合对照品溶液分别测定，或精密吸取不同体积的同一混合对照品溶液进样分析，分别计算不同体积下的fi/s，计算公式为：
Figure GDA0003811334010000101
注：fi/s为相对校正因子；Cs为参照物浓度；As为参照物峰面积；Ci为待测物质浓度；Ai为待测物质浓度
(2)斜率法(CC)：通过一系列浓度的混合对照品溶液，分别测定各对照品的标准曲线，在标准曲线y＝kx+b中，在k/b值大于100时，相对校正因子fi/s可用二者的斜率k之比直接计算，计算公式为:
Figure GDA0003811334010000102
注：fi/s为相对校正因子；ki为待测成分标准曲线斜率；ks为参照物标准曲线斜率；
(3)过原点的曲线斜率法(SC):通过一系列浓度的混合对照品溶液，分别测定各对照品的标准曲线，将标准曲线的截距校正为0后，用两条标准曲线斜率k的比值求得待测成分相对校正因子fi/s，计算公式同斜率法。
取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，分别于不同天配制一系列浓度的混合对照溶液，照3.2项下色谱条件进行随行线性试验，以人参皂苷Rg1色谱峰为参照，分别按照多点法、斜率法、过原点的曲线斜率法计算校正因子。另取同一批样品进行测试，对比一测多评法与外标一点法计算所得三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量结果差异。
计算结果表明，三种计算方法计算相对校正因子算结果无显著差异，但采用多点法计算时所得校正因子RSD较大，故不予采用；斜率法与过原点的曲线斜率法无显著差别，由于斜率法计算步骤比较简单，最终选择斜率法计算结果为作为校正因子，具体数据见下表。
多点法校正因子数值比较表
Figure GDA0003811334010000103
Figure GDA0003811334010000111
斜率法与过原点曲线法校正因子数值比较表
Figure GDA0003811334010000112
一测多评(CC)与外标法比对
Figure GDA0003811334010000113
一测多评(SC)与外标法比对
Figure GDA0003811334010000114
Figure GDA0003811334010000121
4.0方法学验证
4.1指纹图谱方法学验证
4.1.1稳定性
取本品1份，按2.0项方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、12、16、20、24h进样分析，记录不同时间点下各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，并与0时数据进行比较，计算RAD％，具体见下表。
相对保留时间稳定性测试结果
Figure GDA0003811334010000122
相对峰面积稳定性测试结果
Figure GDA0003811334010000123
Figure GDA0003811334010000131
结果显示，供试品溶液中各色谱峰在24小时内各时间点相对保留时间和相对峰面积与0时数据RAD均不大于2.0％，各时间点峰面积RSD不大于3.0％，供试品溶液在24小时内稳定性符合规定。
4.1.2重复性
取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平平行制备3份，按2.0项下色谱条件进样分析，计算各共有峰各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，计算9份样品中各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值，结果见下表。
相对保留时间重复性测试结果
Figure GDA0003811334010000132
相对峰面积重复性测试结果
Figure GDA0003811334010000133
Figure GDA0003811334010000141
结果显示，3种浓度的各自3份平行样各色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD均不超过3.0％；9份供试品含量结果的RSD均不得超过3.0％，重复性测试符合规定。
4.1.3精密度
取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，按2.0项下色谱条件，分别于不同时间、由不同人员、采用不同仪器进样分析，计算各共有峰各共有峰的相对保留时间及相对峰面积和各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值，结果见下表。
相对保留时间精密度测试结果
Figure GDA0003811334010000142
相对峰面积精密度测试结果
Figure GDA0003811334010000143
Figure GDA0003811334010000151
结果显示，经测试，与不同天由不同人员进行测试，各浓度水平下，各色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD均不超过3.0％，15组数据总RSD均不超过3.0％，中间精密度测试符合规定。
4.2含量测定(外标一点法)方法学验证
4.2.1专属性
丹参阴性样品：按处方取丹参、黄芪、降香油三味，照工艺制成不含三七的阴性样品备用；取芪参益气滴丸样品、三七阴性样品，照供试品处理方法制备供试品溶液，另取混合对照溶液和空白溶剂按2.0项下色谱条件进样分析，记录各色谱峰保留时间和分离度，见下表。
专属性测试
Figure GDA0003811334010000152
结果表明，空白溶剂和阴性样品在待测成分保留时间处均未检测到色谱峰，供试品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1分离度分别为4.06、2.43、2.80、21.94，均大于1.5，本方法专属性测试结果符合规定
4.2.2线性
线性对照品溶液的制备：以供试品溶液所含待测成分的浓度为100％，分别制备6个不同浓度的混合对照品溶液，其浓度范围应至少为70％～130％；
分别取上述对照品溶液，按照2.0项下分析方法进行色谱分析，绘制“浓度-峰面积”标准曲线，结果见下表。
线性测试结果
Figure GDA0003811334010000161
结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1四种成分标准曲线相关系数r在0.9990～0.9993之间，均不小于0.999；b/k值在0.00008614～0.0008581之间，小于1％。线性测试结果符合方法学验证要求。
4.2.3稳定性
取本品1份，按2.0项方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、12、16、20、24h进样分析，记录不同时间点下三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1色谱峰面积，并与0时数据进行比较，计算RAD％，具体见下表
溶液稳定性测试结果
Figure GDA0003811334010000162
Figure GDA0003811334010000171
结果显示，供试品溶液中各组分在24小时内各时间点峰面积与0时数据RAD均不大于2.0％，各时间点峰面积RSD不大于3.0％，供试品溶液、对照品溶液在24小时内稳定性符合规定。
4.2.4重复性
取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平平行制备3份，按2.0项下色谱条件进样分析，计算各待测成分含量、每个浓度水平下3份
样品中各待测成分RSD和9份样品中各待测成分RSD值，结果见下表。
重复性测试结果(含量均以mg/g计)
Figure GDA0003811334010000172
结果显示，各待测成分三种不同浓度水平测定结果RSD均不超过3.0％，9份样品测定结果RSD均不超过3.0％，重复性测试符合规定。
4.2.5中间精密度
取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平制备1份，按2.0项下色谱条件，分别于不同时间、由不同人员、采用不同仪器进样分析，计算各待测成分含量及所有含量结果RSD值，结果见下表。
中间精密度测试结果(含量均以mg/g计)
Figure GDA0003811334010000173
Figure GDA0003811334010000181
结果显示，四种组分测试条件下RSD均未超过3.0％，15份样品总RSD均未超过3.0％，中间精密度符合规定。
4.2.6准确度
取本品1批，分别称取相当于取样量50％供试品，分别加入三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照溶液，使各待测组分达到70％、100％、130％浓度水平，每个浓度水平制备3份，按2.0项下色谱条件，计算各待测成分回收率及回收率RSD值，结果见下表。
准确度测试结果
Figure GDA0003811334010000182
结果显示，各待测成分中，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量在0.1％水平，回收率均在90％～108％范围内，人参皂苷Re含量在0.01％水平，其回收率在85％～110％范围内，各待测组分回收率RSD均不超过3.0％，准确度符合规定。
4.3含量测定(一测多评法)方法学再验证
结合以上研究结果，利用一测多评法对含量测定方法进行关键项目再验证，以确定该方法的可行性。本次验证主要针对方法的重复性、中间精密度、准确度等项目展开，计算结果与外标法进行对比，其它项目(专属性、线性、稳定性等)结果同4.2.1、4.2.2、4.2.3项下。
4.3.1重复性
取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平平行制备3份，按2.0项下色谱条件进样分析，按一测多评法计算各待测成分相对保留时间成分含量、每个浓度水平下3份样品中各待测成分含量RSD和9份样品中各待测成分含量RSD值，结果见下表。
相对保留时间
Figure GDA0003811334010000191
重复性测试结果(含量均以mg/g计)
Figure GDA0003811334010000192
结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时均在：0.8092～0.8944，0.9747～1.077，1.211～1.339范围，满足不大于±5％要求；且各待测成分三种不同浓度水平测定结果RSD均不超过2.0％，9份样品测定结果RSD均不超过3.0％，重复性测试符合规定。
4.3.2中间精密度
取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平制备1份，按2.0项下色谱条件，分别于不同时间、由不同人员、采用不同仪器进样分析，按一测多评法计算各待测成分相对保留时间、成分含量及所有含量结果RSD值，结果见下表。
相对保留时间
Figure GDA0003811334010000201
中间精密度测试结果(含量均以mg/g计)
Figure GDA0003811334010000202
结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时均在：0.8092～0.8944，0.9747～1.077，1.211～1.339范围，满足不大于±5％要求，四种组分测试条件下RSD均未超过2.0％，15份样品总RSD均未超过3.0％，中间精密度符合规定。
4.3.3准确度
取本品1批，分别称取相当于取样量50％供试品，分别加入三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照溶液，使各待测组分达到70％、100％、130％浓度水平，每个浓度水平制备3份，按2.0项下色谱条件，计算各待测成分保留时间，并按一测多评法计算回收率及回收率RSD值，结果见下表。
相对保留时间
Figure GDA0003811334010000211
准确度测试结果
Figure GDA0003811334010000212
结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时均在：0.8092～0.8944，0.9747～1.077，1.211～1.339范围，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量在0.1％水平，回收率均在90％～108％范围内，人参皂苷Re含量在0.01％水平，其回收率在85％～110％范围内，各待测组分回收率RSD均不超过3.0％，准确度符合规定。
综合以上结果，一测多评法与方法学验证结果符合规定，能够用于待测成分含量测定。
附图说明
图1标准指纹图谱
图2典型色谱图
图3色谱峰归属
图4色谱峰成分指认
图5典型色谱图
图6标准图谱
图7不同仪器耐用性色谱图
图8不同色谱柱耐用性色谱图
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
一种检测芪参益气滴丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量的方法，所述方法步骤如下：
对照品溶液制备：取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，精密称定，加甲醇制呈含三七皂苷R10.04mg/ml、人参皂苷Rg10.15mg/ml、人参皂苷Re0.02mg/ml、人参皂苷Rb10.10 mg/ml的混合对照溶液。
供试品溶液制备：取本品约0.5g，精密称定，置于15ml离心管中，加4％氨水溶液5ml，超声至溶解，通过YWG C18小柱(内径1.0cm，80-100目，1.0g，预先用甲醇20ml，水20ml活化)，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得。
步骤C的色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表梯度进行洗脱，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃。
流动相梯度洗脱表
Figure GDA0003811334010000221
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各4μl，注入超高效液相色谱仪，记录25分钟内色谱图，并以人参皂苷Rg1对照品峰面积为参照，以其相应色谱峰为S峰，根据色谱图用归一法计算芪参益气滴丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量。
实施例2
步骤A对照品溶液制备，方法如下：
取人参皂苷Rg1、加甲醇制成含人参皂苷Rg1 0.195mg/ml的对照溶液；
步骤B供试品溶液制备中，方法如下：取芪参益气滴丸0.6g，加5％氨水溶液6ml超声至溶解，过C18柱，用水60ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇15ml洗脱至容量瓶中，收集甲醇洗脱液。
步骤C测定中，流速0.42ml/min，检测波长203nm，柱温26℃，进样量为5μl。
步骤C测定中使用相对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时分别为0.8092～0.8944，0.9747～1.077，1.211～1.339。
按以下条件进行梯度洗脱，
Figure GDA0003811334010000231
或
Figure GDA0003811334010000232
实施例3
步骤A对照品溶液制备，方法如下：
取人参皂苷Rg1、加甲醇制成含人参皂苷Rg1 0.105mg/ml的对照溶液；
步骤B供试品溶液制备中，方法如下：取芪参益气滴丸0.3g，加3％氨水溶液4ml超声至溶解，过C18柱，用水40ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇5ml洗脱至容量瓶中，收集甲醇洗脱液。
步骤C测定中，流速0.38ml/min，检测波长203nm，柱温24℃，进样量为3μl。
按以下条件进行梯度洗脱，
Figure GDA0003811334010000233
Figure GDA0003811334010000241
或
Figure GDA0003811334010000242
步骤C测定中使用相对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时分别为0.8092～0.8944，0.9747～1.077，1.211～1.339。
步骤C测定中使用相对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，其中，三七皂苷R1相对校正因子为1.250±0.011，人参皂苷Re相对校正因子为1.812±0.020，人参皂苷Rb1相对校正因子为1.426±0.023。
实施例4
一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分指纹图谱建立方法，
A对照品溶液制备，方法如下：
取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，精密称定，加甲醇制成混合对照溶液，
B供试品溶液制备:取多批次合格的芪参益气滴丸0.3g-0.6g，加氨水溶液超声至溶解，通过C18柱，用纯化水洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液；
C测定：分别吸取步骤A所得的对照品溶液及步骤B所得供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱，其中，超高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，流速0.38～0.42ml/min，检测波长203nm，柱温24～26℃，进样量为3μl-5μl，按以下条件进行梯度洗脱，
Figure GDA0003811334010000243
Figure GDA0003811334010000251
或
Figure GDA0003811334010000252
实施例5
一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分指纹图谱建立方法，
对照品溶液制备：取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，精密称定，加甲醇制成含三七皂苷R10.028～0.048mg/ml、人参皂苷Rg1 0.105～0.195mg/ml、人参皂苷Re0.014～0.026mg/ml、人参皂苷Rb1 0.07～0.13mg/ml的混合对照溶液；
供试品溶液制备：取多批次合格的芪参益气滴丸0.3g-0.6g，加3-5％氨水溶液4-6ml超声至溶解，过C18柱，用水40-60ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇5-15ml洗脱至容量瓶中，收集甲醇洗脱液；
测定分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各4μl，注入超高效液相色谱仪，记录25分钟内色谱图，并以人参皂苷Rg1对照品峰面积为参照，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱；其中色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃，按以下条件进行梯度洗脱，
Figure GDA0003811334010000253
Figure GDA0003811334010000261
实施例6
一种芪参益气滴丸指纹图谱检测方法，
供试品溶液制备:取芪参益气滴丸0.3g，精密称定，加氨水溶液超声至溶解，通过C18小柱，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过滤即得；
测定：吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
和芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品；其中色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃，按以下条件进行梯度洗脱，
Figure GDA0003811334010000262
实施例7
一种芪参益气滴丸指纹图谱检测方法，
供试品溶液制备:取芪参益气滴丸0.6g，精密称定，加氨水溶液超声至溶解，通过C18小柱，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过滤即得；
测定：吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
和芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品；其中色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃，按以下条件进行梯度洗脱，
Figure GDA0003811334010000263
Figure GDA0003811334010000271
实施例8
供试品溶液制备：取芪参益气滴丸0.5g，精密称定，置于15ml离心管中，加4％氨水溶液5ml，超声至溶解，通过C18小柱，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得，
测定：吸取供试品溶液4μl，注入超高效液相色谱仪，记录25分钟内色谱图，根据所得色谱图和芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。
其中色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃，按以下条件进行梯度洗脱，
Figure GDA0003811334010000272

Claims (5)

1.一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分检测方法，其特征在于，包括以下步骤A对照品溶液制备：取人参皂苷Rg1、加甲醇制成含人参皂苷Rg10.105～0.195mg/ml的对照溶液；
B供试品溶液制备：取芪参益气滴丸0.3g-0.6g，加3-5％氨水溶液4-6ml超声至溶解，过C18柱，用水40-60ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇5-15ml洗脱至容量瓶中，收集甲醇洗脱液；
C测定：分别吸取步骤A所得对照品溶液及步骤B所得供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图计算得出芪参益气滴丸中人参皂苷Rg1，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量；
步骤C测定中，流速0.38～0.42ml/min，检测波长203nm，柱温24～26℃，进样量为4μl，
步骤C测定中使用相对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对保留时分别为0.8092～0.8944，0.9747～1.077，1.211～1.339，
步骤C测定中使用相对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，其中，三七皂苷R1相对校正因子为1.250±0.011，人参皂苷Re相对校正因子为1.812±0.020，人参皂苷Rb1相对校正因子为1.426±0.023，
其中，超高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，按以下条件进行梯度洗脱，
Figure FDA0003748385190000011
Figure FDA0003748385190000021
或
Figure FDA0003748385190000022
2.一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分指纹图谱建立方法，其特征在于，包括以下步骤
A对照品溶液制备，方法如下：
取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，精密称定，加甲醇制成混合对照溶液，
B供试品溶液制备:取多批次合格的芪参益气滴丸0.3g-0.6g，加氨水溶液超声至溶解，通过C18柱，用纯化水洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液；C测定：分别吸取步骤A所得的对照品溶液及步骤B所得供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱，
其中，超高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，流速0.38～0.42ml/min，检测波长203nm，柱温24～26℃，进样量为3μl-5μl，按以下条件进行梯度洗脱，
Figure FDA0003748385190000023
Figure FDA0003748385190000031
或
Figure FDA0003748385190000032
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，步骤如下：
对照品溶液制备：取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，精密称定，加甲醇制成含三七皂苷R10.028～0.048mg/ml、人参皂苷Rg10.105～0.195mg/ml、人参皂苷Re0.014～0.026mg/ml、人参皂苷Rb1 0.07～0.13mg/ml的混合对照溶液；
供试品溶液制备：取多批次合格的芪参益气滴丸0.3g-0.6g，加3-5％氨水溶液4-6ml超声至溶解，过C18柱，用水40-60ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇5-15ml洗脱至容量瓶中，收集甲醇洗脱液；
测定分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各4μl，注入超高效液相色谱仪，记录25分钟内色谱图，并以人参皂苷Rg1对照品峰面积为参照，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱；其中色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃，按以下条件进行梯度洗脱，
Figure FDA0003748385190000033
Figure FDA0003748385190000041
4.一种芪参益气滴丸指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤如下：
供试品溶液制备:取芪参益气滴丸0.3g-0.6g，精密称定，加氨水溶液超声至溶解，通过C18小柱，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过滤即得；
测定：吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，
和芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品；其中色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，水为流动相B，流速0.4ml/min，检测波长203nm，柱温25℃，按以下条件进行梯度洗脱，
Figure FDA0003748385190000042
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤如下：
供试品溶液制备：取芪参益气滴丸0.5g，精密称定，置于15ml离心管中，加4％氨水溶液5ml，超声至溶解，通过C18小柱，用纯化水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇10ml洗脱至10ml容量瓶中，定容，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得，测定：吸取供试品溶液4μl，注入超高效液相色谱仪，记录25分钟内色谱图，根据所得色谱图和芪参益气滴丸中三七多皂苷成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。
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