CN107576739B

CN107576739B - 一种龙牡壮骨颗粒的hplc指纹图谱检测方法

Info

Publication number: CN107576739B
Application number: CN201710817753.5A
Authority: CN
Inventors: 赵洋; 李霞; 黄志军; 吴木琴; 赵刚; 童懿; 杨颃; 蔡威
Original assignee: Jianmin Pharmaceutical Groups Corp Ltd
Current assignee: Jianmin Pharmaceutical Groups Corp Ltd
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2037-09-12
Also published as: CN107576739A

Abstract

本发明公开了一种龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，本发明通过对测定指纹图谱的仪器、色谱柱、流动相、检测波长等条件进行了筛选，建立了液相指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，根据多批大生产样品制定了龙牡壮骨颗粒标准指纹图谱。通过对龙牡壮骨颗粒进行HPLC指纹图谱检测，能够在生产过程中有效的指导投料、严格规范生产操作，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠，与其它检测方法相比具有操作方便、快捷等优点。

Description

一种龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明属于中药检测领域，涉及一种龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法。

背景技术

指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定中药材及中药制剂的手段，主要用于鉴别真伪和评价原药材、半成品及制剂质量的均一性和稳定性。与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。中药指纹图谱的检测方法有色谱法、光谱法、波谱法等。色谱法主要包括薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳等，其中高效液相色谱法具有高效、快速、灵敏、重现性好的特点，与紫外检测器(UV)、二甲管阵列检测器(DAD)、蒸发光散射检测器(ELSD)和质谱检测器(MS)等多种检测器联用，可用于中药中多种复杂成分的分析检测，现已成为中药指纹图谱研究的主流方法。

CN1466976A公开了一种防治佝偻病和骨质疏松症的药物及其制备方法，CN104147344A公开了一种龙牡壮骨颗粒的制备方法。龙牡壮骨颗粒属于中西药复方制剂，采用健脾补肾的中药进行配伍，从而发挥健脾和胃、强筋壮骨的功效，用于治疗和预防小儿佝偻病、软骨病等。该药物已有20多年的临床应用历史，是健民药业集团股份有限公司的独家品种，“龙牡”是中国驰名商标，龙牡壮骨颗粒是国家中药保护品种，质量标准收载于《中国药典》2015年版一部。

《中国药典》2015年版对龙牡壮骨颗粒中质控指标仅为钙含量测定，其它文献中也有检测黄芪甲苷、维生素D₂的报导，但总体来说，本品目前的质量检测仍缺乏完整地表征复方体系特征的方法，难以全面有效地控制产品质量，无法保证产品的质量均一性和复方疗效。

发明内容

本发明的目的在于针对目前龙牡壮骨颗粒质量检测方法不能全面控制中药复方质量的缺陷，建立一种龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，所述龙牡壮骨颗粒由党参、黄芪、麦冬、龟甲、白术、山药、五味子、龙骨、牡蛎、茯苓、大枣、甘草、乳酸钙、鸡内金、维生素D₂、葡萄糖酸钙16味制成，该检测方法包括供试品溶液的制备、HPLC指纹图谱的构建以及对HPLC指纹图谱进行相似度分析三个步骤，

所述HPLC指纹图谱的构建方法是：吸取供试品溶液，上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为210～300nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C₁₈色谱柱，流动相为乙腈与缓冲盐的混合溶液，采用梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～35℃，理论板数不低于10000。

优选地，所述紫外检测器的设定检测波长为287nm。

优选地，所述缓冲盐为0.1mo/L磷酸二氢钾溶液。

进一步优选地，所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中缓冲盐占流动相的体积比分别为：0～5min，缓冲盐占90％；5～18min，缓冲盐占90～65％；18～30min，缓冲盐占65～60％；30～80min，缓冲盐占60～15％；80～85min，缓冲盐占15～0％；85～87min，缓冲盐占0％。

优选地，所述供试品溶液的制备方法是：将待测龙牡壮骨颗粒研细，称取0.5～5重量份，以50～100体积份的石油醚为溶剂，索氏提取2～5h，残渣加甲醇10-20体积份，微热使其溶解，然后上大孔吸附树脂柱，先用水洗涤，再用体积分数40-80％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至量瓶中，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即为供试品溶液，

所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。

进一步优选地，所述大孔吸附树脂柱为D101型。

优选地，所述相似度分析方法是：记录供试品溶液0～87min的色谱图，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液的色谱图分别经过数据导入、多点矫正和数据匹配，即得指纹图谱并进行相似度分析。

优选地，所述供试品溶液的色谱图中有16个共有峰，以分离良好、峰位适中、峰面积相对较大、较稳定的5号峰为参比峰，以出峰时间集中、单峰面积占参比峰面积高于5％且能代表复方中主要活性成分的1、3、4、7、8、9、11、12号峰为特征峰。

进一步优选地，各峰的相对保留时间分别为：1号峰为0.72min，3号峰为0.94min，4号峰为0.96min，5号峰为1.00min，7号峰为1.38min，8号峰为1.46min，9号峰为1.55min，11号峰为1.64min，12号峰为1.78min。

本发明的有益效果是：

中药复方是在中医的理论指导下应用的，任何单一活性成分均不能反映中药所体现的整体疗效，尤其是复方制剂，是通过多成分、多靶点之间的相互协同作用发挥疗效，单一测定一个或几个指标性成分更不能全面反映中药复方的内在质量。而指纹图谱能比较全面的反映中药所包含的化学信息，在本发明中，建立了龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱，同时测定了11批龙牡壮骨颗粒，标出了16个共有峰和一个标准指纹图谱，所得到的色谱图相似度达到0.90以上；以其相对保留时间和相对峰面积来计算稳定性、重复性和精密度，相对保留时间的RSD值均小于3.0％，相对峰面积的RSD值均小于5.0％；

本发明提供的龙牡壮骨颗粒指纹图谱标准，在生产过程中可有效的指导投料、严格规范生产操作，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠，与其它检测方法相比具有操作方便、快捷等优点。

附图说明

图1是龙牡壮骨颗粒水超声提取后的HPLC图谱。

图2是龙牡壮骨颗粒水饱和正丁醇超声提取后的HPLC图谱。

图3是龙牡壮骨颗粒石油醚提取、上大孔树脂并用80％乙醇洗脱后的HPLC图谱。

图4是龙牡壮骨颗粒在230nm检测波长下的HPLC图谱。

图5是龙牡壮骨颗粒在254nm检测波长下的HPLC图谱。

图6是龙牡壮骨颗粒在300nm检测波长下的HPLC图谱。

图7是龙牡壮骨颗粒在流速0.8ml/min下的HPLC图谱。

图8是龙牡壮骨颗粒在流速1.2ml/min下的HPLC图谱。

图9是11批龙牡壮骨颗粒的指纹图谱。

图10是龙牡壮骨颗粒的标准指纹图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。

以下实施例中所用到的龙牡壮骨颗粒均按《中国药典》2015年版的方法制备，由健民药业集团股份有限公司提供。

1.仪器与试药

戴安P680高效液相色谱仪，四元泵，在线真空脱气系统，自动进样器，柱温箱，紫外检测器；ME-104E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

11个批次的龙牡壮骨颗粒(批号为1705125，1706290，1706271，1705211，1706286，1610773，1612741，1706262，1612911，1612738，1612915，共11批)；磷酸二氢钾为分析纯，乙腈为色谱级，水为纯化水。

2.方法步骤

(1)供试品溶液制备：取龙牡壮骨颗粒研细，精密称取5g，以100ml的石油醚为溶剂，索氏提取4h，残渣加甲醇15ml，微热使其溶解，然后上D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)，以水100ml洗涤，再用80％乙醇100ml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；

(2)色谱条件：Agilent ZORBAX SB C₁₈，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈-0.1mo/L磷酸二氢钾溶液为流动相，梯度洗脱：A相为0.1mo/L磷酸二氢钾溶液，B相为乙腈；0～5min，A相90％；5～18min，A相90～65％；18～30min，A相65～60％；30～80min，A相60～15％；80～85min，A相15～0％；85～87min，A相0％；流速：1ml/min；检测波长为287nm；柱温30℃；进样量5μl。理论板数按5号峰计算，应不低于10000；

(3)方法学考察：按照指纹图谱的要求进行精密度试验，稳定性试验，重复性试验；

(4)样品测定：取数批次龙牡壮骨颗粒，按照步骤(1)方法分别制备11份供试品溶液，各精密吸取20μl，采用步骤(2)的色谱条件进行测定，记录0-87min色谱图，色谱图中以保留时间为25.44min的5号峰为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积；

(5)指纹图谱的建立并进行峰归属分析：分别取数批次龙牡壮骨颗粒样品，按步骤(1)项下制备供试品溶液，按步骤(3)的色谱条件进行测定并记录87min色谱图，结果所有色谱峰集中在87min内，比较批次样品的色谱图，所述供试品溶液的色谱图中有16个共有特征峰，因5号峰分离良好、峰位适中、峰面积较大，且为君药黄芪、臣药甘草所共有，故以保留时间为25.55min的5号峰为参比峰，以出峰时间集中、单峰面积占参比峰面积高于5％且能代表复方中主要活性成分的1、3、4、7、8、9、11、12号峰为特征峰，各峰的相对保留时间分别为：1号峰为0.72min，3号峰为0.94min，4号峰为0.96min，5号峰为1.00min，7号峰为1.38min，8号峰为1.46min，9号峰为1.55min，11号峰为1.64min，12号峰为1.78min。在进行指纹图谱的相似度分析时，通过比对参比峰和特征峰能更加方便快捷、准确有效地控制产品质量。

(6)样品相似度计算：将所得的11批次龙牡壮骨颗粒色谱图导入国家药典委员颁布的2004版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，选取“时间窗”宽度为0.1min，采用样品1生成对照谱，经过多点矫正和数据匹配生成色谱指纹图谱共有模式，对11批样品的指纹图谱进行相似度分析。

3.供试品溶液制备：根据龙牡壮骨颗粒的处方和生产工艺，分别考察了水、饱和正丁醇、石油醚作为提取溶剂。经过综合比较分析，发现采用石油醚提取，上大孔树脂并用乙醇洗脱，不仅可以除去杂质峰的干扰，而且所得图谱能够较全面的反映中药中的主要成分，同时检测灵敏度高且重复性较好，指纹图谱基线平稳，所以最终确定供试品溶液的制备方法为：将待测龙牡壮骨颗粒研细，精密称取5g，以100ml的石油醚为溶剂，索氏提取4h，残渣加甲醇15ml，微热使其溶解，然后上D101型大孔吸附树脂柱，先用水100ml洗涤，再用体积分数80％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即为供试品溶液。三种供试品溶液制备方法得到的指纹图谱见图1-3。

4.检测方法的建立

4.1仪器、试剂和色谱条件

仪器：戴安P680高效液相色谱仪，四元泵，在线真空脱气系统，自动进样器，柱温箱，

试剂：乙腈为色谱纯，乙醇为分析纯，磷酸二氢钾为分析纯，水为纯化水。

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C₁₈，4.6×250mm，5μm；检测波长：230，254，287，300nm；进样量5μl；柱温：25～35℃；流速：1ml/min。

4.2流动相的选择

实验表明甲醇-水系统，乙腈-水系统的色谱图中，各峰无法分离且峰形较差，出峰较少。甲醇-磷酸、乙腈-磷酸系统，峰形较好，但峰较少，部分色谱峰无法分离。而以乙腈-缓冲盐系统的分离效果较佳，不仅峰形好，而且出峰时间适中。故选择乙腈-缓冲盐系统，尤其是以0.1mo/L磷酸二氢钾溶液为A相时，得到的色谱峰质量最佳。

4.3洗脱程序的优化：用乙腈-缓冲盐系统分别进行了等度洗脱和梯度洗脱的比较，结果表明，等度洗脱时图谱中色谱峰较少，出峰时间较长久，个别色谱峰无法分离，不适宜总体化学信息指纹图的采集。因此，为了保证色谱图能总体概括药材的化学信息，各化学成分尽可能出峰，且分析时间适宜，决定采用梯度洗脱程序。

在实验中，加入缓冲盐是为了改善色谱峰的分离程度及改善峰形，考察了0.05mo/L磷酸二氢钾溶液、0.1mo/L磷酸二氢钾溶液、0.2mo/L磷酸二氢钾溶液对色谱峰的分离度及峰形的影响，结果发现加入0.1mo/L磷酸二氢钾溶液对改善样品色谱峰分离度效果最好，图谱中各峰能较好地分离，基线相对较为平稳，出峰时间适宜，峰形匀称。

4.4最佳测定波长的确定：经液相色谱图谱的比较分析，发现230、254、300nm的图谱中出峰较少，各色谱峰之间的峰高和峰面积比例也不均衡，不能全面反映制剂的成分；在287nm下，图谱中出峰多，且各成分指纹峰分离度较好，综合考虑色谱峰的数目、基线及信号响应强弱，确定287nm为指纹图谱的最佳检测波长。230、254、300nm检测波长的指纹图谱见图4-6。

4.5最佳检测流速的确定：比较了0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三个不同流速，发现1.0ml/min条件下，各成分指纹峰分离度较好，因此确定1.0ml/min为指纹图谱的最佳检测流速。0.8ml/min、1.2ml/min流速的指纹图谱见图7-8。

4.6最佳检测柱温的确定：柱温是高效液相色谱的重要参数之一，柱温变化可导致色谱峰保留时间迁移，影响各成分分离效果和指纹图谱的相似度比较。本文分别对25℃，30℃，35℃，40℃不同的柱温进行了比较，在其它色谱条件相同情况下，以35℃条件下，各峰分离效果最好，因此确定柱温为35℃。

5.方法学考察

5.1稳定性试验：取供试品溶液按照上述色谱项下条件，在0、4、8、12h测定，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，各色谱峰的相对保留时间均小于2.0％，各色谱峰的相对峰面积均小于3.0％，符合指纹图谱技术要求。见表1-2。

表1 稳定性考察相对保留时间

表2 稳定性考察相对峰面积

5.2重复性试验：取同一批号样品6份，按照1项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，各色谱峰的相对保留时间均小于2.0％，各色谱峰的相对峰面积均小于3.0％，符合指纹图谱技术要求。见表3-4。

表3 重复性考察相对保留时间

表4 重复性考察相对峰面积

5.3精密度试验：取供试品溶液按照上述色谱项下条件，连续进样6次，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，各色谱峰的相对保留时间均小于2.0％，各色谱峰的相对峰面积均小于3.0％，符合指纹图谱技术要求。见表5和表6。

表5 精密度考察相对保留时间

表6 精密度考察相对峰面积

6.指纹图谱的建立：分别取11批龙牡壮骨颗粒样品，制备供试品溶液，测定并记录87min色谱图，结果所有色谱峰集中在87min内，比较了11批样品的色谱图，确定了16个共有峰。经过确认，选择保留时间为25.44min的5号峰为参比峰；

6.1样品相似度计算：将11批龙牡壮骨颗粒色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”，选取“时间窗”宽度为0.1min，采用样品1生成对照谱，经过多点矫正和数据匹配生成色谱指纹图谱共有模式，11批样品指纹图谱相似度计算结果见表7。指纹图谱见图9。

表7 11批样品相似度

6.2龙牡壮骨颗粒标准指纹图谱的制定

取多批龙牡壮骨颗粒，分别按所述供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，根据检测所得的多批检测数据，建立龙牡壮骨颗粒制剂的高效液相图谱，确立高效液相色谱峰保留时间和峰面积值，然后收集所有检测数据，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值以及标准差等，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相除，作为标准指纹图谱的相对峰保留时间和相对峰面积值，导出计算结果，制定标准指纹图谱数据，绘制标准指纹图谱。结果见表8，标准指纹图谱见图10。

表8 标准指纹图谱数据

6.3药材与成品指纹图谱之间的相关性

药材供试品溶液的制备：分别取处方中各味药材按照颗粒制剂工艺进行提取，制得浸膏，按照标准指纹图谱条件进行色谱峰归属。结果见表9。

表9 龙牡壮骨颗粒与药材相关性图谱

峰号	保留时间	药材来源
			1	18.32	茯苓
2	19.56	鸡内金、龟甲
			3	24.06	甘草
4	24.54	甘草、麦冬
			5(s)	25.55	甘草、黄芪
6	26.97	鸡内金
			7	35.23	甘草、黄芪
8	37.37	甘草、党参
			9	39.60	鸡内金
10	40.90	鸡内金
			11	41.83	甘草、黄芪、党参
12	45.59	鸡内金
			13	50.81	甘草
14	52.18	山药、黄芪
			15	66.64	甘草
16	68.51	白术、五味子

Claims

1.一种龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，所述龙牡壮骨颗粒由党参、黄芪、麦冬、龟甲、白术、山药、五味子、龙骨、牡蛎、茯苓、大枣、甘草、乳酸钙、鸡内金、维生素D₂、葡萄糖酸钙16味制成，其特征在于该检测方法包括供试品溶液的制备、HPLC指纹图谱的构建以及对HPLC指纹图谱进行相似度分析三个步骤，

所述HPLC指纹图谱的构建方法是：吸取供试品溶液，上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为287nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C₁₈色谱柱，流动相为乙腈与0.1mo/L磷酸二氢钾的混合溶液，采用梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～35℃，理论板数不低于10000；

所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中缓冲盐占流动相的体积比分别为：0～5min，缓冲盐占90％；5～18min，缓冲盐占90～65％；18～30min，缓冲盐占65～60％；30～80min，缓冲盐占60～15％；80～85min，缓冲盐占15～0％；85～87min，缓冲盐占0％；

所述供试品溶液的制备方法是：将待测龙牡壮骨颗粒研细，称取0.5～5重量份，以50～100体积份的石油醚为溶剂，索氏提取2～5h，残渣加甲醇10-20体积份，微热使其溶解，然后上大孔吸附树脂柱，先用水洗涤，再用体积分数40-80％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至量瓶中，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即为供试品溶液，

所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。

2.如权利要求1所述龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂柱为D101型。

3.如权利要求1所述龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述相似度分析方法是：记录供试品溶液0～87min的色谱图，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液的色谱图分别经过数据导入、多点矫正和数据匹配，即得指纹图谱并进行相似度分析。

4.如权利要求1所述龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述供试品溶液的色谱图中有16个共有峰，以分离良好、峰位适中、峰面积相对较大、较稳定的5号峰为参比峰，以出峰时间集中、单峰面积占参比峰面积高于5％且能代表复方中主要活性成分的1、3、4、7、8、9、11、12号峰为特征峰。

5.如权利要求4所述龙牡壮骨颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：各峰的相对保留时间分别为：1号峰为0.72min，3号峰为0.94min，4号峰为0.96min，5号峰为1.00min，7号峰为1.38min，8号峰为1.46min，9号峰为1.55min，11号峰为1.64min，12号峰为1.78min。