CN103837609B - 一种生脉注射液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生脉注射液，并提供一种检测方法对其物理化学特性进行全面地表征。采用HPLC测定了其指纹图谱，其中，单峰面积占总峰面积2%以上的有9个峰。该9个峰的平均保留时间为12.5-14.5分钟，以6#峰为参照取相对面积，平均相对峰---面积为0.55-0.75。

Description

一种生脉注射液及其制备方法
技术领域
本发明涉及中药领域，具体涉及一种生脉注射液，及其制备方法。
背景技术
生脉注射液是根据中医著名经典古方“生脉散”研制而成的可供静脉注射的中药注射液，由人参、麦冬、五味子三味中药配伍并采用现代科学技术提取精制而成。
古方“生脉散”历经上千年长期应用，安全有效，经久不衰。古代医家既用于抢救热伤元气、津液耗伤、脉微欲绝等重症，又用以作为气阴两虚病人的补益剂。关于生脉散方名的含义，吴琨在《医方考》中说：“名曰生脉者，以脉得气则充，失气则弱，故名之”。中医之脉者，主于心，而发源于肺，然肺中之气，所赖以生者，尤必资籍于肾阴。故《医方集解》曰：“盖心主脉，肺朝百脉，补肺清心，则气充而脉复，故曰生脉也。”可以说，生脉散是依据其功效而命名的。生脉亦可解之为复脉，“人有将死脉绝者，服此能复生之”。较形象地说明了生脉散的功效及其在急重症抢救中的作用。
目前，对于生脉注射液的质量控制手段无法表征其复杂的生物物质成分，实际上难以控制其内在品质。因此，如何有效地、特异性的控制生脉注射液的品质成为人们研究的热点。
发明内容
本发明目的在于提供一种生脉注射液，并提供一种检测方法对其物理化学特性进行全面地表征。
本发明另一目的在于提供上述生脉注射液的制备方法。
本发明通过以下技术方案进行实施。
本发明一种生脉注射液的制备方法如下：
按照下述重量份取药材：红参25份，五味子39份，麦冬78份；
红参提取：取红参加乙醇进行回流提取，浓缩滤液，加入活性炭，搅拌，过滤，滤液调节pH值，回收乙醇至无醇味，冷却至室温，加注射用水，冷藏，调节pH值，加活性炭煮沸，补加注射用水，待配制；
五味子蒸馏液：取五味子，粉碎后加水蒸馏，收集蒸馏液，过滤，待配制；
五味子提取液：蒸馏后的药渣加水煎煮，浓缩水煎液至清膏，调节醇含量，搅拌至澄清，冷藏，过滤一次醇液，滤液收至无醇，浓缩至稠膏，冷却至室温，调节醇含量，搅拌澄清，冷藏，过滤二次醇液，滤液调节pH值，冷藏。过滤，滤液收至无醇，冷至室温，补水，冷藏。过滤，滤液加入活性炭煮沸，钛棒过滤，待配制；
麦冬提取：取麦冬，加水煎煮，后同五味子提取液方法；
取上述红参提取液、麦冬提取液、五味子提取液，五味子蒸馏液，分别初滤后再超滤，混合滤液，加入聚山梨酯80，使其完全溶解，补水，搅匀，调pH值；精滤，灌封，灭菌，得生脉注射液。
优选地，本发明一种生脉注射液的制备方法如下：
按照下述重量份取药材：红参25份，五味子39份，麦冬78份；
红参提取：取红参片加入回流提取罐中，90%以上乙醇加热回流提取3-5次，每次1-2小时，过滤回流液，滤液减压回收乙醇至生药量0.3-0.4g，加入红参药材重量3%-6.5%的活性炭，搅拌，钛棒过滤。滤液调pH值6.8-7.5，回收乙醇至无醇味，冷至室温，加注射用水至药材量1~2倍（g→ml）的体积，冷藏。过滤，调pH值6.8-7.5，加活性炭煮沸10-50分钟，钛棒过滤，补加注射用水至药材量1~2倍（g→ml）的体积，待配制；
五味子蒸馏：五味子粉碎，加水，常压蒸馏30-50分钟，收集蒸馏液至药材量1~2倍（g→ml）的体积，过滤，待配制；
五味子提取：药渣分别加水煎煮1-2次，各30-50分钟。合并煎煮液，浓缩至清膏，调醇至75-82%，搅拌至澄清，冷藏。过滤一次醇液，滤液收至无醇，浓缩至稠膏，冷至室温，调醇至84-87%，搅拌澄清，冷藏；过滤二次醇液，滤液调pH6.8-7.5，冷藏；过滤，滤液收至无醇，冷至室温，补水至药材量1~2倍（g→ml）的体积，冷藏；过滤，滤液加入活性炭煮沸30-50分钟，钛棒过滤，待配制；
麦冬提取：取麦冬，加水煎煮，后同五味子提取液方法；
取红参提取液、麦冬提取液、五味子提取液，五味子蒸馏液，分别初滤后再超滤（5KD-10KD），混合滤液，加入聚山梨酯80（0.05-0.5%），使其完全溶解，补水至药材三味药材总量1.5~2.0倍（g→ml）的体积，搅匀，调pH值7.5；精滤，灌封，灭菌。
本发明一种生脉注射液具有以下理化参数：HPLC指纹图谱中单峰面积占总峰面积2%以上的有9个峰，该9个峰的平均保留时间为12.5-14.5分钟，以6#峰为参照取相对面积，平均相对峰---面积为0.55-0.75。
上述理化参数的测定条件如下：
（1）高效液相色谱条件：色谱柱极性乙酰氨基嵌入的十八烷基硅烷键合硅胶为填料（WatersSymmetryshiedldTMRP18（4.6×250mm；5.0μm））；以乙腈（B）和0.03%磷酸水溶液（A）为流动相，按表1进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温：25-40℃。理论踏板数按五羟甲基糠醛（5-HMF）峰计算应不低于20000；
（2）对照品溶液的制备：精密称取5-HMF适量，加5%甲醇配成10ug/ml的对照品溶液；
（3）测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
表1、高效液相色谱法测定指纹图谱洗脱梯度
时间（min） A（%） B（%） 流速（ml/min）
0 100 0 1
17 96 4 1
30 60 40 1
37 40 60 1
38 0 100 1
49 0 100 12 -->
50 100 0 1
60 100 0 1
本发明一种生脉注射液的理化参数如下：按以上所述色谱方法进行检测，对大于总峰面积2%的峰进行积分，表现出生脉注射液表现出9个特征峰，以6号峰5-HMF为参照峰，各峰的相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RA）见表2。
表2相对保留时间相对峰面积表
峰号 相对保留时间 相对峰面积
1 0.1~0.2 0.2~0.3
2 0.1~0.2 0.2~0.3
3 0.2~0.3 0.6~0.8
4 0.4~0.5 0.9~1.0
5 0.5~0.6 0.9~1.0
6 1.000 1.000
7 1.0~2.0 0.3~0.4
8 1.0~2.0 1.0~1.1
9 2.8~3.0 0.1~0.2
在上述指纹图谱中，已知峰3为莽草酸，峰6为五羟甲基糠醛，峰9为五味子醇甲。
优选的，本发明一种生脉注射液的理化参数如下：按以上所述色谱方法进行检测，对大于总峰面积2%的峰进行积分，表现出生脉注射液表现出9个特征峰，以6号峰5-HMF为参照峰，各峰的相对保留时间和相对峰面积见表3。
表3相对保留时间相对峰面积表
峰号 相对保留时间 相对峰面积
1 0.119 0.283
2 0.137 0.278
3 0.232 0.745
4 0.487 0.946
5 0.532 0.911
6 1.000 1.000
7 1.354 0.324
8 1.802 1.023
9 2.920 0.168
通过采用本发明特定的提取和分析方法，以指纹图谱的方式全面的表征了本发明一种生脉注射液。与仅用一两成分来表征中药制剂中复杂的生物活性成分的现有技术相比较，更加容易、客观地控制中药制剂内在质量。
通过特定的分离、鉴定方法，对本发明一种生脉注射液中活性成分进行了鉴定。按照前述指纹图谱标实的成分进行了鉴定。对于化合物的鉴定主要基于LC-MSn数据的解析以及与文件数据的比较而进行。最终，通过比较使大部分成分得到了确认。由此可见，采用本发明特定LC-MSn方法，对于本发明一种生脉注射液进行化学成分分析，可以得到丰富的生物活性成分的结构信息，由此表征的中药制剂具有准确性、特异性等特点，大大优于现有技术的方法。
峰3化学成分分离纯化：取100ml生脉注射液，用5%的盐酸调pH到2.0-3.0，用乙酸乙酯萃取，每次100ml，萃取3次，合并乙酸乙酯溶液，减压蒸干，用100ml注射用水溶解残渣，用5%的盐酸调pH≈2.0，上强阴离子交换树脂柱吸附（315型阴离子交换树脂10g，径高比1:10，5BV/h流速动态吸附4h），弃去流出液。用100ml去离子水洗脱（流速3BV/h），弃去1BV的前流出液，收集后段洗脱液。减压浓缩至浸膏，用适量甲醇溶解，重结晶即得。
利用现代波谱技术（NMR、LC-MSn、UV、IR）技术，对该成分进行鉴定，得出分离出的化学成分为莽草酸。利用LC-DAD技术，对峰3进行指认，确定峰3为莽草酸。
通过分析和鉴定，可知上述指纹图谱中峰3为莽草酸。
莽草酸具有如下化学结构：
英文名称：shikimicacid
分子式：C7H10O5相对分子质量：174.15
莽草酸是植物代谢途径中一个重要的中间产物，在八角茴香中含量比较高。在五味子药材、生脉注射液中，还未见有人报道该化合物。
本发明生脉注射液中以莽草酸计，含量不得低于1.2mg/ml。
莽草酸为无色针晶，分子量（mp.）189-190℃。ESI-Msm／z(M-)：l73.11。分子式：C7H1005;
红外光谱IR（KBr）cm-1：3480，3385，3220，1680，l645，1450，1300，1280;
核磁1H-NMR(D2O)δ：6.69(1H，m，2-H)，4.31(1H，t，3-H)，3.90（1H，t，4-H），3.69（1H，q，5-H），2.61（1H，m，6-H）;
核磁13C-NMR(D2O)δ：137.1（C-1），129.7（C-2），70.9（C-3），66.5（C-4），65.6（C-5），30.2（C-6），170.1（C-7）。
以下通过本发明一种生脉注射液对于心肌缺血犬血流动力学的影响
目的通过结扎犬冠状动脉导致心肌缺血模型，观察本发明生脉注射液对心肌缺血犬血流动力学的影响；
方法将杂种犬随机分为5组，每组6只，分别为模型组（5%葡萄糖生理盐水10ml/kg）、阳性对照药组（丹参注射液0.62ml/kg），生脉注射液大（4.375ml/kg）、中（1.75ml/kg）、小（0.875ml/kg）剂量组。其中丹参组相当于1倍临床用量，生脉注射液各剂量组分别相当于2.5倍、1倍和0.5倍临床用量。结扎犬心脏冠状动脉左前降支，记录收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均动脉压（MAP）、冠脉流量（CBF）、心输出量（CO）、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压（LVEDP）、左室等容期最大上升和下降速率（±dp/dtmax），根据公式分别计算心肌耗氧量（VO2）、外周阻力（TPR）、心脏做功（MW）。
结果冠脉结扎后，模型组HR加快、SBP略有升高、DBP稍有降低、LVSP和±dp/dtmax明显下降、LVEDP升高、CBF和CO减少、TPR和MW增加；与模型组比，各用药组明显使冠脉结扎后的犬HR减慢（P<0.05~0.01），对SBP、MAP、LVSP、±dp/dtmax的作用为先降低（P<0.05~0.01）后回升，并使DBP持续降低，其中大剂量在180min时降低DBP作用明显（P<0.05），同时对抗LVEDP的升高，增加CBF和CO（P<0.05），降低TPR（P<0.05~0.01），减少MW（P<0.05~0.01）；与丹参组比，各剂量组SBP、DBP、MAP、LVSP降低作用强于丹参组（P<0.05~0.01），降低氧摄取率和降低耗氧量也强于丹参组，尤其在30min时最为明显，其余指标和丹参组无显著差异。生脉注射液各剂量间比，大、中剂量降低HR作用效果明显（P<0.05~0.01）；对SBP、DBP和MAP作用无明显差异；前期降低LVSP作用中剂量强于大、小剂量组（P<0.05~0.01），而后期回升LVSP作用无明显差异，同时中剂量降低TPR作用强于大、小剂量组（P<0.05~0.01）；大剂量在回升±dp/dtmax作用明显优于中、小剂量组（P<0.05~0.01）；各剂量对CBF、CO和MW的效果无明显差异。
结论生脉注射液显著改善缺血心肌犬血流动力学指标，有效维护缺血心脏功能。起到保护缺血心脏的功能。其中大剂量减慢HR，回升±dp/dtmax作用明显。
1材料与方法
1.1药品与试剂
生脉注射液：按照本发明实施例1的方法制备，黄色透明液体，50ml/瓶，批号：Z-090602，四川雅安三九药业有限公司生产；
丹参注射液：黄色透明液体，四川三精升和制药有限公司生产，批号：080112，10ml/支。
1.2动物与试验仪器
试验动物：杂种犬，体重10-14kg，雌雄兼用，由四川大学华西医学试验动物中心提供。
试验仪器：BL-420F生物信号采集与处理系统：成都泰盟科技有限责任公司生产并提供；电磁流量计（NIHONKOHDEN）：0.16mm，日本光电公司生产。
1.3试验方法
将杂种犬随机分为5组，每组6只（按实际有效统计数据的只数计算），分别为模型组（5%葡萄糖生理盐水10ml/kg）、阳性对照药组（丹参注射液0.62ml/kg），生脉注射液大（4.375ml/kg）、中（1.75ml/kg）、小（0.875ml/kg）剂量组。其中丹参组相当于1倍临床用量，生脉注射液各剂量组分别相当于2.5倍、1倍和0.5倍临床用量；
各组药液均用5%葡萄糖生理盐水稀释为100ml液体进行静脉滴注，模型组直接使用不含药物的5%葡萄糖生理盐水；
各组犬经后肢隐静脉注射3%戊巴比妥钠1ml/kg麻醉。固定于手术台，将心电图电极插入四肢皮下，以标准Ⅱ导联监测动物心电图；手术分离气管、右侧颈总动脉、右侧颈内静脉；行气管插管，连接呼吸机以保持呼吸通畅；行右侧颈总动脉插管，通过压力转换器与BL-420F生物信号采集与处理系统连接，记录收缩压（SBP）、舒张压（DBP）和平均动脉压（MAP）；于第4肋间隙开胸，扩胸器辅助打开视野，剪破心包膜，于左冠状动脉前降支第二个主要分支以下小心游离一段动脉，穿线备用，同时小心分离一段冠状动脉左旋支固定电磁流量计记录冠脉流量（CBF）；另分离升主动脉根部，固定电磁流量计记录心输出量（CO）；行左心室插管，通过压力转换器与BL-420F生物信号采集与处理系统连接，记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压（LVEDP）和左室等容期最大上升和下降速率（±dp/dtmax）等；分离右侧股静脉，建立静脉输液通道，备给药用；分离右侧股动脉，备取血用；待各血流动力学指标稳定后，结扎LAD，以心电图出现ST段明显改变或心律异常、以及±dp/dtmax明显改变作为结扎成功依据，分别记录结扎后5min、15min、30min、60min、90min、120min、180min各血流动力学指标、CBF及CO，结扎15分钟时各组经股静脉滴注相应药液。
根据公式分别计算外周阻力（TPR）、心脏做功（MW），计算公式如下：
外周阻力TPR=平均压（MAP）÷心输出量（CO）
心脏做功MW（每分做功）=（MAP-6）×CO×13.6/1000。
1.4数据处理
各组数据以均数±标准差的形式表示，各时间点数据与结扎前做差后用SPSS13.0统计软件统计后进行组间比较t检验，检验水平α=0.05。
2试验结果
2.1生脉注射液对心肌缺血犬心率（HR）的影响，见表4：
表4生脉注射液对心肌缺血犬心率（HR）的影响（次/分,±s,n=6）
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01；与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01.
表4显示，结扎冠脉后，模型组HR有所升高；与模型组比，生脉注射液各剂量组在结扎30min后、丹参组在结扎60min后HR显著降低（P<0.05~0.01）；与丹参组比，生脉注射液各用药组降低HR趋势更为明显，尤其是大、中剂量组降低HR作用显著（P<0.05）；生脉各剂量组比，大、中剂量降低心率作用更为明显（P<0.05~0.01）。
说明生脉注射液可显著减慢心肌缺血犬HR，其中，大、中剂量作用更为明显。
生脉注射液显著减慢缺血犬HR作用，有助于减少心肌缺血心脏做功，对保护缺血心脏功能有利。
2.2生脉注射液对心肌缺血犬收缩压（SBP）的影响，见表5：
表5生脉注射液对心肌缺血犬收缩压（SBP）的影响(mmHg,±s,n=6)
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01；与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01.
表5显示，冠脉结扎后，模型组SBP有所升高；与模型组比，生脉注射液各剂量组、丹参组在结扎30min后SBP显著降低（P<0.05~0.01）；与丹参组比，生脉注射液各用药组大多数时间点SBP与之比较无明显差异，仅见生脉注射液大、小剂量组在结扎30min时降低SBP幅度大于丹参组（P<0.05）；生脉注射液各剂量比，降低SBP作用无显著差异；
说明生脉注射液可显著降低冠脉结扎犬SBP，与丹参组作用相当。
2.3生脉注射液对心肌缺血犬舒张压（DBP）的影响，见表6：
表6生脉注射液对心肌缺血犬舒张压（DBP）的影响(mmHg,±s,n=6)
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01。与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01.
表6显示，冠脉结扎后，模型组DBP稍有下降；与模型组比，生脉注射液各剂量组和丹参组均显著降低DBP（P<0.05~0.01）；与丹参组比，生脉注射液各用药组大多数时间段对DBP作用与之比较无明显差异，但生脉注射液大剂量组在结扎30min-120min时，中剂量在30min时，小剂量组在30min时降低DBP幅度明显大于丹参组（P<0.05~0.01）；生脉注射液各剂量比，生脉注射液小剂量组在30min时降低DBP作用不如大剂量组明显（P<0.05）；其余无明显差异；
说明生脉注射液可显著降低冠脉结扎犬的外周阻力，此作用可降低心脏负荷，降低心脏做功，有利于保护缺血心脏。
2.4生脉注射液对心肌缺血犬平均动脉压（MAP）的影响，见表7：
表7生脉注射液对心肌缺血犬平均动脉压（MAP）的影响(mmHg,±s,n=6)
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01。与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01.
表7显示，冠脉结扎后，模型组MAP稍有下降，与模型组相比，生脉注射液各剂量组和丹参组在各时间点均显著降低MAP（P<0.05~0.01）；与丹参组相比，各剂量在结扎后15min开始即显著降低MAP（P<0.05），生脉注射液各剂量组在药后30min时，降低MAP最为明显，60min后逐渐有所回升。各剂量组之间比较，各剂量对MAP作用无明显差异；
说明生脉注射液可显著降低冠脉结扎犬的MAP，其作用表现为先降低后逐渐回升。
2.5生脉注射液对心肌缺血犬左心室收缩压（LVSP）的影响，见表8：
表8生脉注射液对心肌缺血犬左心室收缩压（LVSP）的影响(mmHg,±s,n=6)
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01。与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01.
表8显示，冠脉结扎后，模型组LVSP逐渐降低；与模型组比，生脉注射液大剂量在结扎30~120min时、中、小剂量组、丹参组在结扎30~90min时LVSP降低作用明显（P<0.01），但其后逐渐回升；与丹参组比，生脉注射液各剂量组在结扎30min时降低LVSP作用明显较强（P<0.01），其余各时间段LVSP无明显差异；生脉注射液各剂量组间比，生脉注射液中剂量组在结扎后5min时降低LVSP作用明显强于大、中剂量组（P<0.05），其余无明显差异；
生脉注射液在初期降低左室内压作用对保护心肌缺血时的心脏极为有利，因可使心脏做功减少，由此降低心肌氧耗而避免心肌细胞代谢紊乱而致严重后果。此后通过调节或适应，左室收缩压逐渐增强，此对维持心脏后期的供血作用也十分有利。其中，中剂量组前期降低LVSP作用明显。
2.6生脉注射液对心肌缺血犬左室舒张末压（LVEDP）的影响，见表9：
表9生脉注射液对心肌缺血犬左室舒张末压（LVEDP）的影响(mmHg,±s,n=6)
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01；与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01.
表9显示，冠脉结扎后，模型组LVEDP逐渐升高；与模型组比，各给药组均有对抗LVEDP升高趋势，其中，生脉注射液大剂量组在冠脉结扎后180min时LVEDP明显降低（P<0.05）；与丹参组比，生脉注射液各剂量组降低LVEDP作用与之比较无显著差异；生脉注射液各剂量组之间比，大剂量组在180min时降低LVEDP作用明显强于大、中剂量组（P<0.05）；
说明生脉注射液可有效降低冠脉结扎后的LVEDP升高，尤其是大剂量组作用明显，由此显现明显改善心功能作用。
2.7生脉注射液对心肌缺血犬左心室等容收缩期压力最大上升速率（+dp/dtmax）的影响，见表10：
表10生脉注射液对心肌缺血犬左心室等容收缩期压力最大上升速率（+dp/dtmax）的影响(mmHg/s,±s,n=6)
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01；与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01.
表10显示，冠脉结扎后，模型组+dp/dtmax逐渐减慢；与模型组比，各给药组均能先显著减慢+dp/dtmax，30min后逐渐加快之（P<0.05~0.01），生脉注射液各剂量组在30min时明显低于模型组（P<0.01），各剂量组在180min时明显高于模型组（P<0.05~0.01）；与丹参组比，生脉注射液大、中剂量组在30min时对+dp/dtmax作用明显低于丹参组（P<0.05~0.01）、中剂量组在90min是明显高于丹参组（P<0.05），其余无显著差异；生脉注射液各剂量组间比，生脉注射液大剂量组在60min时加快心肌缺血后心脏的+dp/dtmax作用明显不如中剂量（P<0.05），以降低为主，而在180min时大剂量组回升+dp/dtmax明显强于小剂量组（P<0.05），其余无明显差异；
说明生脉注射液先显著减慢冠脉结扎后的+dp/dtmax，后逐渐使之加快。其中，大剂量组加快+dp/dtmax作用较为明显；
生脉注射液表现出的初期+dp/dtmax短暂降低作用，可能与该药在用药初期为保护心脏而降低心脏做功有关。
2.8生脉注射液对心肌缺血犬左心室等容舒张期压力最大下降速率（-dp/dtmax）的影响，见表11：
表11生脉注射液对心肌缺血犬左心室等容舒张期压力最大下降速率（-dp/dtmax）的影响(±s,n=6)
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01；与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01.
表11显示，冠脉结扎后，模型组-dp/dtmax明显减慢；与模型组比，各给药组在结扎30min后减慢明显（P<0.05~0.01），之后有所回升；与丹参组比，生脉注射液中剂量组在结扎5-15min时、小剂量在5min时减慢-dp/dtmax幅度明显大于丹参组（P<0.05）；与大剂量组比，生脉注射液中剂量在90min、180min时、小剂量在90min时回升-dp/dtmax作用显著（P<0.05~0.01），其余无明显差异；
说明生脉注射液可先显著减慢冠脉结扎后的-dp/dtmax，后逐渐回升之，其中，中、小剂量组回升-dp/dtmax作用明显。生脉注射液降低-dp/dtmax的作用表现可能与该药降低心脏做功有关，尤其是大剂量此作用尤为明显，而中、小剂量随剂量降低而降低心脏做功作用逐渐减弱，主要表现稳定心功能为主。
2.9生脉注射液对心肌缺血犬冠脉流量（CBF）的影响：见表12：
表12生脉注射液对心肌缺血犬冠脉血流量（CBF）的影响(ml/min,±s,n=6)
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01；与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01.
表12显示，冠脉结扎后，模型组CBF先稍有升高后逐渐下降；与模型组比，生脉注射液大、中剂量组和丹参组在180min时CBF明显升高（P<0.05），生脉注射液大剂量和小剂量组在30min时CBF明显低于模型组（P<0.05）；与丹参组比，生脉注射液各剂量组升高CBF作用与丹参组相当；生脉注射液各剂量组比，各剂量间无明显差异；
说明生脉注射液可增加心肌缺血犬CBF，效果与丹参注射液效果相当。
2.10生脉注射液对心肌缺血犬心输出量（CO）的影响：结果见表13：
表13生脉注射液心肌缺血犬心输出量（CO）的影响(#/min,±s,n=6)
与模型组比：*：P<0.05，**：P<0.01；与丹参组比:▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
与生脉注射液大剂量组比：#：P<0.05，##：P<0.01；与生脉注射液中剂量组比:●：P<0.05，●●：P<0.01。
表13显示，冠脉结扎后，模型组CO先稍有升高后逐渐下降；与模型组比，生脉注射液大、中剂量组和丹参组在180min时升高CO作用明显（P<0.05）；与丹参组比，生脉注射液各剂量组升高CBF的作用与丹参组相当；生脉注射液各剂量组比，各组间大多数时间段对CO作用无明显差异；
说明生脉注射液可显著增加冠脉结扎后的CO，效果与丹参注射液作用相当。
综合本试验结果，我们认为生脉注射液对心肌缺血血流动力学有良好的改善作用，首先，该药通过减慢缺血心脏心率、降低舒张压，在用药前期降低收缩压、LVSP、+dp/dtmax，而后使之提高，升高LVEDP、-dp/dtmax而后使之下降，同时，减低TPR和MW，增加心输出量和冠脉流量，由此表现出对缺血心脏既降低心脏做功、降低心脏负荷，又适当提高心功能，对心肌缺血的治疗起到了极为有利的作用。
生脉注射液可有效改善心肌缺血后的血流动力学指标，改善心肌缺血心脏功能，并有效降低外周阻力，降低心脏做功而降低心肌耗氧量。
生脉注射液的心血管药效作用提示该药对临床心肌缺血患者具有良好的治疗应用价值。
说明书附图
图1为本发明生脉注射液的HPLC指纹图谱
图2为生脉注射液中莽草酸二级质谱
实施例
下面列举实施例对于本发明技术方案进行进一步说明，该实施例对于本发明不构成任何限制。
实施例1（制备例）
100g红参切片
取红参片加入回流提取罐中，90%以上乙醇加热回流提取3-5次，每次1-2小时，过滤回流液，滤液减压回收乙醇至0.3-0.4g，加入3-6.5g活性炭，搅拌，钛棒过滤。滤液调pH值6.8-7.5，回收乙醇至无醇味，冷至室温，加注射用水至100-200ml，冷藏。过滤，调pH值6.8-7.5，加活性炭煮沸10-50分钟，钛棒过滤，补加注射用水至100-200ml，待配制；
156g五味子粉碎，加水，收集常压蒸馏液150-160ml，过滤，待配制。水液过滤浓缩，药渣分别加水煎煮1-2次，各30-50分钟。合并蒸馏后水浓缩液和煎煮液，浓缩至清膏，调醇至75-82%，搅拌至澄清，冷藏。过滤一次醇液，滤液收至无醇，浓缩至稠膏，冷至室温，调醇至84-87%，搅拌澄清，冷藏。过滤二次醇液，滤液调PH6.8-7.5，冷藏。过滤，滤液收至无醇，冷至室温，补水至150-180ml，冷藏。过滤，滤液加入活性炭煮沸30-50分钟，钛棒过滤，待配制；
312g麦冬同五味子制法（不粉碎、不收集蒸馏液），制成200ml，冷藏待配制；
取红参提取液、麦冬提取液、五味子提取液，五味子蒸馏液，分别初滤后再超滤，混合滤液，加入聚山梨酯80，使其完全溶解，补水至1000ml，搅匀，调pH值7.5；精滤，灌封，灭菌。
实施例2（指纹图谱测定）
供试品制备取生脉注射液成品作供试品；
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VID）测定；
色谱条件与系统适用性试验：用极性乙酰氨基嵌入的十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；以乙腈（B）-0.03%磷酸水（A）溶液为流动相，按表14进行梯度洗脱；检测波长为260nm。理论板数按五羟甲基糠醛（5-HMF）峰计算应不低于20000；
表14生脉注射液指纹图谱洗脱梯度
时间（min） A（%） B（%） 流速（ml/min）
0 100 0 1
17 96 4 1
30 60 40 1
37 40 60 1
38 0 100 1
49 0 100 1
50 100 0 1
60 100 0 1
对照品溶液的制备精密称取5-HMF适量，加5%甲醇配成10ug/ml的对照品溶液。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
供试品指纹图谱在2～42分钟范围内，应呈现9个与对照指纹图谱（图1）相对应的特征峰。以上标定的9个特征峰，以6号峰5-HMF为参照峰，各峰的相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RA）见表15：
表15相对保留时间和相对峰面积表
Num. RRT RA
1 0.119 0.283
2 0.137 0.278
3 0.232 0.745
4 0.487 0.946
5 0.532 0.911
6 1.000 1.000
7 1.354 0.324
8 1.802 1.023
9 2.920 0.168
实施例3（五味子药材中莽草酸含量测定）
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定
色谱条件与系统适应性固定相采用PhenomenexSynergi4μmHydro-RP80A250*4.60mm4micron色谱柱；柱温为25℃；单泵，流动相：20mMKH2PO4（H3PO4调pH到2.5±）（流动相：pH=2.5±0.4的甲酸溶液，检测波长：200-250nm）；检测波长：200-250nm，柱温：30℃，流速：0.6+0.4ml/mim，进样量：10μL，对照品含量：约80μg/ml，塔板数：15000以上。
供试品的制备：取五味子药材粉末（过3号筛）1g，置于具塞三角瓶中，再加入50-100ml水，密塞，称重，超声提取30-60min，取出放冷，用水补重，过滤，取续滤液，用0.22μm或0.45μm微膜过滤，作供试品。
对照溶液制备：取莽草酸对照品适量，配成约80ug/ml的对照品溶液，待用。
测定：分别取五味子药材供试品液和莽草酸对照液进样，单点校正计算莽草酸含量。药材中以莽草酸计，含量不得低于1.4%。
实施例4（生脉注射液中莽草酸含量测定）
样品液制备：取生脉注射液成品，稀释10-20倍，待用；
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定
色谱条件与系统适应性固定相采用PhenomenexSynergi4μmHydro-RP80A250*4.60mm4micron色谱柱；柱温为25℃；单泵，流动相：20mMKH2PO4（H3PO4调pH到2.5±0.4）（流动相：pH=2.5±0.4的甲酸溶液，检测波长：200-250nm）；检测波长：200-250nm，柱温：30℃，流速：0.6+0.4ml/mim，进样量：10μL，对照品含量：约80μg/ml，塔板数：15000以上；
对照溶液制备：取莽草酸对照品适量，配成约80ug/ml的对照品溶液，待用；
测定：分别取生脉注射液和莽草酸对照液进样，单点校正计算莽草酸含量。生脉注射液中以莽草酸计，含量不得低于1.2mg/ml。

Claims (6)

1.一种生脉注射液，其特征在于其含有莽草酸，其具有如下理化参数：HPLC图谱中单峰面积占总峰面积的百分比超过2%的有9个峰，#6峰为五羟甲基糠醛，以#6峰参照峰，该9个峰的相对保留时间为0.1~0.2，0.1~0.2，0.2~0.3，0.4~0.5，0.5~0.6，1.000，1.0~2.0，1.0~2.0，2.8~3.0；以#6峰为参照峰，该9个峰的相对峰面积为0.2~0.3，0.2~0.3，0.6~0.8，0.9~1.0，1.000，0.3~0.4，1.0~1.1，0.1~0.2；上述理化参数的测定条件如下：高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流速1.000ml/min，检测波长260nm，洗脱条件：流动相A为0.03%磷酸水溶液，流动相B为乙腈，从0~17分钟，流动相A从100%均匀变为96%；从17~30分钟，流动相A从96%均匀变为60%；从30~37分钟，流动相A从60%均匀变为40%；从37~38分钟，流动相A从40%均匀变为0%；从38~49分钟，流动相A保持0%不变；从49~50分钟，流动相A从0%均匀变为100%；从50~60分钟，流动相A保持100%不变；对照品溶液配制和测定：精密称取五羟甲基糠醛适量，加5%甲醇配成10ug/ml的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得高效液相图谱。
2.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，其具有如下理化参数：高效液相图谱中单峰面积占总峰面积的百分比超过2%的有9个峰，#6峰为五羟甲基糠醛，以#6峰参照峰，该9个峰的相对保留时间为0.119，0.137，0.232，0.487，0.532，1.000，1.354，1.802，2.920；以#6峰为参照峰，该9个峰的相对峰面积为0.283，0.278，0.745，0.946，1.000，0.324，1.023，0.168；上述理化参数的测定条件如下：高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流速1.000ml/min，检测波长260nm，洗脱条件：流动相A为0.03%磷酸水溶液，流动相B为乙腈，从0~17分钟，流动相A从100%均匀变为96%；从17~30分钟，流动相A从96%均匀变为60%；从30~37分钟，流动相A从60%均匀变为40%；从37~38分钟，流动相A从40%均匀变为0%；从38~49分钟，流动相A保持0%不变；从49~50分钟，流动相A从0%均匀变为100%；从50~60分钟，流动相A保持100%不变；对照品溶液配制和测定：精密称取五羟甲基糠醛适量，加5%甲醇配成10ug/ml的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得高效液相图谱。
3.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，以莽草酸计含量不得低于1.2mg/ml。
4.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，#3峰为莽草酸，#9峰为五味子醇甲。
5.权利要求1所述生脉注射液的制备方法，由下述步骤组成：
a.按照下述重量份取药材：红参25份，五味子39份，麦冬78份；
b.红参提取：取红参加乙醇进行回流提取，浓缩滤液，加入活性炭，搅拌，过滤，滤液调节pH值，回收乙醇至无醇味，冷却至室温，加注射用水，冷藏，调节pH值，加活性炭煮沸，补加注射用水，待配制；
c.五味子蒸馏液：取五味子，粉碎后加水蒸馏，收集蒸馏液，过滤，待配制；
d.五味子提取液：蒸馏后的药渣加水煎煮，浓缩水煎液至清膏，调节醇含量，搅拌至澄清，冷藏，过滤一次醇液，滤液收至无醇，浓缩至稠膏，冷却至室温，调节醇含量，搅拌澄清，冷藏，过滤二次醇液，滤液调节pH值，冷藏，过滤，滤液收至无醇，冷至室温，补水，冷藏，过滤，滤液加入活性炭煮沸，钛棒过滤，待配制；
e.麦冬提取：取麦冬，加水煎煮，后同五味子提取液的方法;
f.取上述红参提取液、麦冬提取液、五味子提取液，五味子蒸馏液，分别初滤后再超滤，混合滤液，加入聚山梨酯80，使其完全溶解，补水，搅匀，调pH值，精滤，灌封，灭菌，得生脉注射液。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，由下述步骤组成：
a.按照下述重量份取药材：红参25份，五味子39份，麦冬78份；
b.红参提取：取红参片加入回流提取罐中，90%以上乙醇加热回流提取3-5次，每次1-2小时，过滤回流液，滤液减压回收乙醇至生药量0.3-0.4g，加入红参药材重量3%-6.5%的活性炭，搅拌，钛棒过滤，滤液调pH值6.8-7.5，回收乙醇至无醇味，冷至室温，加注射用水至药材量1~2倍的体积，冷藏，过滤，调pH值6.8-7.5，加活性炭煮沸10-50分钟，钛棒过滤，补加注射用水至药材量1~2倍的体积，待配制；
c.五味子蒸馏：五味子粉碎，加水，常压蒸馏30-50分钟，收集蒸馏液至药材量1~2倍的体积，过滤，待配制；
d.五味子提取：药渣分别加水煎煮1-2次，各30-50分钟，合并煎煮液，浓缩至清膏，调醇至75-82%，搅拌至澄清，冷藏，过滤一次醇液，滤液收至无醇，浓缩至稠膏，冷至室温，调醇至84-87%，搅拌澄清，冷藏，过滤二次醇液，滤液调pH6.8-7.5，冷藏，过滤，滤液收至无醇，冷至室温，补水至药材量1~2倍的体积，冷藏，过滤，滤液加入活性炭煮沸30-50分钟，钛棒过滤，待配制；
e.麦冬提取：取麦冬，加水煎煮，后同五味子提取液方法；
f.取红参提取液、麦冬提取液、五味子提取液，五味子蒸馏液，分别初滤后再超滤，混合滤液，加入0.05-0.5%聚山梨酯80，使其完全溶解，补水至药材三味药材总量1.5~2.0倍的体积，搅匀，调pH值7.5，精滤，灌封，灭菌。
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