CN112326861A - 一种生脉饮的质量标准检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生脉饮的质量标准检测方法，属于质量检测技术领域。本发明提供了一种生脉饮的质量标准检测方法，以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲为参照品制备形成参照物溶液，通过对比人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲的特征峰与待测生脉饮的液相色谱图，从而确认待检测生脉饮中含有的有效成分，进而判断待测生脉饮是否符合生脉饮的质量检测标准。

Description

一种生脉饮的质量标准检测方法

技术领域

本发明属于质量检测技术领域，具体涉及一种生脉饮的质量标准检测方法。

背景技术

现有生脉饮为《中国药典》2015年版一部及2020年版一部收载，由红参、麦冬、五味子共3味中药组成，具有益气复脉、养阴生津的功效。《中国药典》2015年版及2020年版均采用人参二醇、人参三醇对照品、麦冬对照药材、五味子对照药材、五味子醇甲对照品，对处方中红参，麦冬、五味子分别进行了薄层色谱鉴别，对处方中五味子采用高效液相色谱法测定五味子醇甲(C₂₂H₃₂O₇)含量。

中药特征图谱具有整体性、特征性及可量化等特点，为保证制剂质量和临床疗效，完善生脉饮质量标准，对其有效成分进行质量控制，评价生脉饮的一致性与稳定性，通过建立生脉饮中人参皂苷类与五味子醇甲、五味子酯甲的特征图谱，以期能够更有效的对生脉饮的质量进行更准确的控制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生脉饮的质量标准检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种生脉饮的质量标准检测方法，其特征在于，所述质量标准检测方法包括如下步骤：

(1)将待检测生脉饮作为供试品，配制形成供试品溶液，进行液相色谱检测得到液相色谱图I；

(2)将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲作为参照品，将其配制形成参照物溶液，按照步骤(1)中所述液相色谱检测的方法检测得到相应的液相色谱图Ⅱ，从而得到人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲的保留时间；

(3)将步骤(1)中液相色谱图I与步骤(2)检测得到的液相色谱图Ⅱ进行对比，在所述液相色谱图I中呈现与液相色谱图Ⅱ中9个参照品的色谱峰保留时间相同的9个特征峰，即可判断待检测生脉饮符合生脉饮的质量标准。

优选的，所述液相色谱检测按照以下方式进行：精密吸取待测溶液10μl，注入液相色谱仪进行液相色谱检测，得到液相色谱图；

所述液相色谱检测的条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂、柱温为30℃、流速为1.0ml/min、乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为203nm，理论板数按人参皂苷Rb1峰计算应不低于40000；

梯度洗脱时，所述流动相A和流动相B的梯度如下：

优选的，所述供试品溶液的制备方法为：将待检测生脉饮通过0.45μm的微孔滤膜过滤即可得到供试品溶液。

优选的，所述参照物溶液的制备方法为：所述参照物溶液的制备方法为：先取五味子醇甲、五味子酯甲，精密称定后加入甲醇使其完全溶解，用甲醇定容形成储备液；

然后取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd，精密称定后加入甲醇使其完全溶解，再加入精密量的所述储备液，加入甲醇稀释后定容，形成参照物溶液。

进一步优选的，所述参照物溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd的浓度为0.4g/L；

所述参照物溶液中五味子醇甲和五味子酯甲的浓度为0.08g/L。

进一步优选的，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm×5.0μm。

进一步优选的，所述色谱柱为Waters SymmetryShield^TM RP18。

优选的，所述质量标准检测方法还包括以下检测项目：

(1)性状：检测所述生脉饮具有以下形状：黄棕色至红棕色的澄清液体、气香、味酸甜、微苦；

(2)检查：相对密度不低于1.04；pH为4.5～7.0；

(3)鉴别：通过薄层色谱检测所述生脉饮具有与人参二醇、人参三醇对照品相应的斑点、与麦冬对照药材相应的斑点、与五味子对照药材、五味子醇甲对照品相应的斑点；

(4)微生物限度：所述生脉饮满足以下条件：细菌总数不超过10²cfu/ml、霉菌数不超过10¹cfu/ml、酵母菌数不超过10¹cfu/ml、不得检出大肠埃希菌；

(5)含量测定：将所述生脉饮中五味子醇甲的含量不得小于0.075g/L。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种生脉饮的质量标准检测方法，主要以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲为参照品制备形成参照物溶液，经过液相色谱检测得到液相色谱图，通过对比人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲的特征峰与待测生脉饮的液相色谱图，从而确认待检测生脉饮中含有的有效成分，进而判断待测生脉饮是否符合生脉饮的质量检测标准。本发明的质量标准检测方法相比于现有的检测标准具有以下方面的优点：通过建立生脉饮的特征图谱的检测方法，完善生脉饮质量标准，对复杂的药物成分进行质量控制，可更好的评价生脉饮的一致性与稳定性，保证临床用药的安全性和有效性。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为以人参二醇和人参三醇为对照进行薄层色谱检测的结果，其中a为对照品溶液I、b为供试品溶液I；

图2为以麦冬为对照进行薄层色谱检测的结果，其中a为供试品溶液Ⅱ、b为对照药材溶液Ⅱ；

图3为以五味子、五味子醇甲为对照进行薄层色谱检测的结果，其中a为供试品溶液Ⅲ、b为对照药材溶液Ⅲ、c为对照品溶液Ⅲ；

图4为以实施例1中制备的生脉饮为供试品后得到的液相色谱图I；

图5为参照物溶液的液相色谱图Ⅱ。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

制备一种不含有蔗糖和防腐剂的生脉饮，其中具体的制备方法包括如下步骤：、

(1)制备渗漉液：将200g麦冬、红参100g(用破碎机经10mm的筛板破碎)和100g五味子(经万能粉碎机处理)混合后加入65％的乙醇，搅拌使其完全溶解，浸渍24h后进行渗漉处理，收集渗漉液并浓缩；

(2)渗漉液处理：将步骤(1)中浓缩得到的渗漉液(按每分钟以每kg药材1-3ml的速度进行)自然冷却后加水稀释，过滤后继续加水稀释并调节pH值为7，加入0.6g甜菊素，加水搅拌使其完全溶解；

(3)后处理：将步骤(2)中完全溶解的溶液继续加水调节，并经过搅拌、静置(至少2h)、过滤、灌封和灭菌(灭菌条件：温度为100℃、灭菌过程的时间为40min)处理即可得到一种不含有蔗糖和防腐剂的生脉饮1000ml。

实施例2

对实施例1中制备的生脉饮进行质量标准检测，具体的检测项目如下所示：

1、性状：检测实施例1中制备的生脉饮具有以下性状：黄棕色至红棕色的澄清液体、气香、味酸甜、微苦，因此实施例1中制备的生脉饮符合生脉饮质量标准检测中对性状的要求(黄棕色至红棕色的澄清液体、气香、味酸甜、微苦)。

2、检查：检测实施例1中制备的生脉饮的相对密度为1.06、pH为6.4，因此实施例1中制备的生脉饮符合生脉饮质量标准检测中对相对密度(不低于1.04)和pH(4.5～7.0)的要求；

3、鉴别：通过薄层色谱检测实施例1中制备的生脉饮能检出与人参二醇、人参三醇对照品相应的斑点、与麦冬对照药材相应的斑点、与五味子对照药材、五味子醇甲对照品相应的斑点；

具体的检测方法如下：

a、以人参二醇和人参三醇为对照进行薄层色谱检测：

(1)制备供试品溶液I：取20ml实施例1中制备的不含有蔗糖和防腐剂的生脉饮，用20ml正丁醇振摇提取，将正丁醇液蒸干，向残渣加入硫酸的45％乙醇溶液(7→100)(取7ml的硫酸，用45％的乙醇稀释至100ml即可得到硫酸的45％乙醇溶液)15ml，加热回流1h，挥去乙醇，用10ml三氯甲烷振摇提取，分出三氯甲烷液部分，用水洗至中性，用适量的无水硫酸钠脱水，滤过，将滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液I。

(2)制备对照品溶液I：另取对照品人参二醇、对照品人参三醇，加无水乙醇制成每1ml各含1mg人参二醇和1mg人参三醇的混合溶液，作为对照品溶液I。

(3)照薄层色谱法(通则0502)试验：吸取上述步骤(1)中制备的供试品溶液I和步骤(2)中制备的对照品溶液I各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已烷-丙酮(2:1)混合溶液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以硫酸甲醇溶液(1→2)(即取1ml硫酸，用甲醇稀释至2ml即可得到硫酸甲醇溶液(1→2))，在105℃下加热约10分钟，置于波长为365nm的紫外光灯下检视，供试品溶液I的色谱中，在与对照品溶液I色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，如图1所示，其中a为对照品溶液I、b为供试品溶液I。上述检测结果说明生脉饮符合质量标准中人参二醇、人参三醇薄层色谱鉴别的规定。

b、以麦冬为对照进行薄层色谱检测：

(1)制备供试品溶液Ⅱ：取10ml实施例1中制备的不含有蔗糖和防腐剂的生脉饮，加0.5ml盐酸、1ml水，加热煮沸5min，放冷，用三氯甲烷20ml振摇提取，分出三氯甲烷液，浓缩至1ml，作为供试品溶液Ⅱ。

(2)制备对照药材溶液Ⅱ：另取1g麦冬对照药材，加20ml水后煎煮10min，滤过，得到的滤液加0.5ml盐酸，同法(加热煮沸5min，放冷，用三氯甲烷20ml振摇提取，分出三氯甲烷液，浓缩至1ml)制成对照药材溶液Ⅱ。

(3)照薄层色谱法(通则0502)试验：吸取上述供试品溶液Ⅱ和对照药材溶液Ⅱ各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4:1的三氯甲烷和丙酮的混合溶液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液(80ml乙醇溶液中缓缓加入10ml硫酸，放冷后，加乙醇溶液至100ml得到10％的硫酸乙醇溶液)，在100℃下加热至斑点显色清晰。检测结果显示在供试品溶液Ⅱ的色谱中，在与对照药材溶液Ⅱ的色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，如图2所述，其中a为供试品溶液Ⅱ、b为对照药材溶液Ⅱ。上述检测结果说明生脉饮符合质量标准中麦冬的薄层色谱鉴别规定。

c、以五味子、五味子醇甲为对照进行薄层色谱检测：

(1)制备供试品溶液Ⅲ：取10ml实施例1中制备的不含有蔗糖和防腐剂的生脉饮，加水20ml后摇匀，用30ml乙醚振摇提取，重复3次，合并乙醚液并蒸干，向残渣中加入1ml乙醇使溶解，作为供试品溶液Ⅲ。

(2)制备五味子对照品溶液Ⅲ：另取1g五味子对照药材，加20ml三氯甲烷，超声处理30min，过滤后将滤液蒸干，向残渣中加1ml乙醇使溶解，作为对照药材溶液Ⅲ。

(3)制备五味子醇甲对照品溶液Ⅲ：再取五味子醇甲对照品，加三氯甲烷制成每1ml含1mg五味子醇甲的溶液，作为五味子醇甲对照品溶液Ⅲ。

(4)照薄层色谱法(通则0502)试验：吸取5～10μl上述步骤(1)中制备的供试品溶液Ⅲ，2～5μl五味子对照品溶液Ⅲ与2～5μl五味子醇甲对照品溶液Ⅲ，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，置于波长为254nm的紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与五味子对照药材溶液和五味子醇甲对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，如图3所述，其中a为供试品溶液Ⅲ、b为对照药材溶液Ⅲ、c为对照品溶液Ⅲ。上述检测结果说明生脉饮符合质量标准中五味子、五味子醇甲的薄层色谱鉴别规定。

4、微生物限度：检测实施例1中制备的生脉饮的细菌数量，其结果为：需氧菌总数为＜10cfu/ml、霉菌和酵母菌总数为＜10cfu/ml、未检出大肠埃希菌(1ml)；说明实施例1中制备得到的生脉饮满足口服液微生物限度的要求(需氧菌总数不得过10²cfu/ml、霉菌和酵母菌总数不超过10¹cfu/ml、不得检出大肠埃希菌(1ml))。

5、含量测定：将实施例1中制备的生脉饮进行五味子醇甲的含量检测，检测结果为1.36mg/支，符合质量标准中五味子醇甲含量不小于0.75mg/支的要求。

6、特征图谱：

(1)制备供试品溶液：取实施例1中制备的生脉饮，通过0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

(2)制备参照物溶液：分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲作为参照品，将其配制形成参照物溶液(先取五味子醇甲、五味子酯甲，精密称定后加入甲醇使其完全溶解，用甲醇定容形成储备液；然后取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd，精密称定后加入甲醇使其完全溶解，再加入精密量取的所述储备液，加入甲醇定容)，制备得到浓度分别为0.4g/L、0.4g/L、0.4g/L、0.4g/L、0.4g/L、0.4g/L、0.4g/L、0.08g/L、0.08g/L的参照物溶液。

(3)将上述供试品溶液和参照物溶液进行相同条件和操作过程的液相色谱检测，得到供试品溶液的液相色谱图I(如图4所示)和参照物溶液的液相色谱图Ⅱ(如图5所示)，其中液相色谱检测的具体过程如下：分别精密吸取10μL参照物溶液与10μL供试品溶液，注入液相色谱仪进行液相色谱检测；

其中在液相色谱检测过程中按照如下条件进行：色谱柱：WatersSymmetryShield^TM RP18(4.6mm×250mm×5.0μm)、柱温为30℃、流速为1.0ml/min、乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为203nm，理论板数按人参皂苷Rb1峰计算应不低于40000；

梯度洗脱时，所述流动相A和流动相B的梯度如下表1所示：

表1梯度洗脱时流动相A和流动相B的组成

“→”表示逐渐增加

(4)通过上述图5确认液相色谱检测过程中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲的保留时间，如下表2示。

(5)通过对比液相色谱图I(图4)中出现的特征峰的保留时间与图5中各个参照品的特征峰的保留时间，说明实施例1中制备得到的生脉饮符合生脉饮的质量标准(在所述液相色谱图I中呈现与液相色谱图Ⅱ中9个参照品的色谱峰保留时间相同的9个特征峰)。

表2不同参照品在液相色谱图的保留时间

本发明提供的质量检测是在原有的质量检测标准基础上进行的改进，主要区别如下表3示。

表3本发明和现有的质量检测标准的区别

综上所述，本发明提供了一种生脉饮的质量标准检测方法，主要以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲为参照品制备形成参照物溶液，经过液相色谱检测得到液相色谱图，通过对比人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲的特征峰与待测生脉饮的液相色谱图，从而确认待检测生脉饮中含有的有效成分，进而判断待测生脉饮是否符合生脉饮的质量检测标准。本发明的质量标准检测方法相比于现有的检测标准具有以下方面的优点：通过建立生脉饮的特征图谱的检测方法，完善生脉饮质量标准，对复杂的药物成分进行质量控制，可更好的评价生脉饮的一致性与稳定性，保证临床用药的安全性和有效性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种生脉饮的质量标准检测方法，其特征在于，所述质量标准检测方法包括如下步骤：

(1)将待检测生脉饮作为供试品，配制形成供试品溶液，进行液相色谱检测得到液相色谱图I；

(2)将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲作为参照品，将其配制形成参照物溶液，按照步骤(1)中所述液相色谱检测的方法检测得到相应的液相色谱图Ⅱ，从而得到人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲的保留时间；

(3)将步骤(1)中液相色谱图I与步骤(2)检测得到的液相色谱图Ⅱ进行对比，在所述液相色谱图I中呈现与液相色谱图Ⅱ中9个参照品的色谱峰保留时间相同的9个特征峰，即可判断待检测生脉饮符合生脉饮的质量标准。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测按照以下方式进行：精密吸取待测溶液10μl，注入液相色谱仪进行液相色谱检测，得到液相色谱图；

所述液相色谱检测的条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂、柱温为30℃、流速为1.0ml/min、乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为203nm，理论板数按人参皂苷Rb1峰计算应不低于40000；

梯度洗脱时，所述流动相A和流动相B的梯度如下：

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：将待检测生脉饮通过0.45μm的微孔滤膜过滤即可得到供试品溶液。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述参照物溶液的制备方法为：先取五味子醇甲、五味子酯甲，精密称定后加入甲醇使其完全溶解，用甲醇定容形成储备液；

然后取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd，精密称定后加入甲醇使其完全溶解，再加入精密量取的所述储备液，加入甲醇稀释后定容，形成参照物溶液。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述参照物溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd的浓度为0.4g/L；

所述参照物溶液中五味子醇甲和五味子酯甲的浓度为0.08g/L。

6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm×5.0μm。

7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为WatersSymmetryShield^TMRP18。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质量标准检测方法还包括以下检测项目：

(1)性状：检测所述生脉饮具有以下形状：黄棕色至红棕色的澄清液体、气香、味酸甜、微苦；

(2)检查：相对密度不低于1.04；pH为4.5～7.0；

(3)鉴别：通过薄层色谱检测所述生脉饮具有与人参二醇、人参三醇对照品相应的斑点、与麦冬对照药材相应的斑点、与五味子对照药材、五味子醇甲对照品相应的斑点；

(4)微生物限度：所述生脉饮满足以下条件：细菌总数不超过10²cfu/ml、霉菌数不超过10¹cfu/ml、酵母菌数不超过10¹cfu/ml、不得检出大肠埃希菌；

(5)含量测定：将所述生脉饮中五味子醇甲的含量不得小于0.075g/L。

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