CN108362807B - 一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用 - Google Patents

一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108362807B
CN108362807B CN201810036694.2A CN201810036694A CN108362807B CN 108362807 B CN108362807 B CN 108362807B CN 201810036694 A CN201810036694 A CN 201810036694A CN 108362807 B CN108362807 B CN 108362807B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
concentration
ginsenoside
hemodialysis
dialysate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810036694.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108362807A (zh
Inventor
詹淑玉
邵青
丁宝月
阮钰尔
黄嬛
黄雄
刘国强
吕晓庆
姜宁华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiaxing University
Original Assignee
Jiaxing University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiaxing University filed Critical Jiaxing University
Priority to CN201810036694.2A priority Critical patent/CN108362807B/zh
Publication of CN108362807A publication Critical patent/CN108362807A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108362807B publication Critical patent/CN108362807B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学‑药效学中的应用，包括制备清醒大鼠在体微透析取样装置采集血液透析液，采用高效液相色谱‑三重四级杆质谱方法分析血液透析液中活性成分的药物浓度，并采用高效液相色谱‑荧光检测技术测定血液透析液中药效指标NO。本发明采用清醒大鼠在体微透析技术，克服了动物麻醉和血液量损失对药动学和药效学行为的影响，成功地运用于生脉注射液抗大鼠心肌缺血的血药浓度‑时间和药效‑时间关系研究，并建立了药动学‑药效学结合模型。本发明研究表明，当选择合适的血液内源性生物标记物作为药效指标，清醒动物在体微透析采样技术将成为药动学‑药效学结合研究的理想工具。

Description

一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学 中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种清醒大鼠在体微透析采样技术结合透析液检测方法，用于研究异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌缺血大鼠给药生脉注射液后的药动学-药效学相关性。
背景技术
生脉注射液是由红参、麦冬、五味子三味中药组成的复方制剂，在临床上广泛用于治疗心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等症，是一种确有疗效的中药注射剂。药理研究表明，生脉注射液具有对心肌氧化损伤的抗氧化保护活性，增加冠脉血流量，降低心肌耗氧量，改善心肌能量代谢，增加心肌收缩力，降低外周阻力，提高机体抗缺氧能力等药理作用。生脉注射液虽然临床应用广泛，但是关于其体内药代动力学以及药动学-药效学结合研究还非常薄弱，因此以生脉注射液多种活性成分为药代标记物，选择合适的生物标记物作为药效指标，分析血药浓度-时间和药效-时间关系并建立药动学-药效学结合模型，对于指导药物的二次开发以及生脉注射液的临床合理用药十分必要。
微透析技术能够实时、在线对实验动物进行连续采样，其活体微创、动态观察、定量分析、采样量小的特点特别适合于研究生物体内源性物质和外源性药物的动态变化过程，所以在过去的几十年里，微透析采样技术在临床前和临床药动学、药效学和药动学-药效学结合研究领域得到了广泛的应用。但是纵观文献，目前微透析采样技术用于药动学-药效学结合研究还存在着一些明显的技术局限。其中，最主要的问题包括：微透析技术用于药动学-药效学结合研究大多基于动物麻醉状态；另外，大多研究采用的是微透析采样与血液采集相结合的方法分别用于开展药动学和(或)药效学研究。有研究表明动物麻醉以及动物血液量的损失会显著地影响药物的药动学和药效学行为。
发明内容
为了解决以上问题，本发明建立了一种清醒大鼠在体微透析采样技术用于采集异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌缺血大鼠给药生脉注射液后的血液透析液，并建立了高效液相色谱-三重四级杆质谱方法(HPLC-MS/MS)和高效液相色谱-荧光检测技术(HPLC-FLU)分别用于测定透析液中的多成分药物浓度和药效指标NO的变化。所建立的方法无需采取大鼠血液，只采集大鼠血液透析液，同时用于测定药物浓度和药效指标的变化。
本发明的第一方面，提供一种清醒大鼠在体微透析采样技术，具体步骤如下：手术前，大鼠腹腔注射5％水合氯醛生理盐水溶液(0.25g/kg体重)，保持在整个手术过程大鼠处于麻醉状态。手术过程采用体温维持仪控制大鼠体温为37℃。施行静脉分离手术，暴露右侧外颈静脉，在外颈静脉与腋静脉交叉处上游约10mm处用手术剪在血管上表面剪出一小口，迅速将事先浸润肝素钠溶液的同轴型探针向心房方向插入血管中，用丝线将探针与血管固定在一起，防止探针滑脱(见图1)。在大鼠颈背部开一小口，将探针的进出口端导管在穿刺针引导下沿皮下从颈背部引出，再用医用手术缝合针线缝合各伤口，并擦上医用碘酒消毒。最后将大鼠置于清醒装置中，并联接上微透析系统各导管，开通微量注射泵以2μL/min流速灌流生理盐水溶液。恢复约12h后，大鼠可自由活动。
本发明的第二方面，提供一种血液微透析技术用于生脉注射液药动学-药效学结合研究的方法，其采用微透析取样技术结合高效液相色谱-三重四级杆质谱分析方法和高效液相色谱-荧光检测技术。具体包括以下步骤：模型大鼠颈静脉埋植微透析探针后，置于清醒动物装置中；尾静脉注射给药生脉注射液后，收集0～12h内不同时间点的透析液；将上述透析液分别采用高效液相色谱-三重四级杆质谱方法分析多成分药物浓度；并采用高效液相色谱-荧光检测技术测定透析液中药效指标NO；绘制模型大鼠给药生脉注射液后活性成分血药浓度-时间曲线图和药效-时间曲线图；根据血药浓度-时间关系和药效-时间关系建立药动学-药效学结合模型。
本发明的第三方面，提供一种给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，包括以下步骤：采用HPLC-MS/MS方法分析血液透析液中的活性成分血药浓度，同时采用HPLC-FLU测定血液透析液中药效指标NO；
所述的活性成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rc；
所述的药效指标NO通过测定透析液中NO2 －和NO3 －总含量获得。
进一步的，所述的血液透析液为异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌缺血模型大鼠给药生脉注射液后，通过微透析采样得到的血液透析液。
进一步的，所述的模型大鼠的造模方法包括以下步骤：实验第一天，雄性SD大鼠大鼠皮下注射ISO生理盐水溶液50mg/kg造模，造模后约12h，进行手术埋植微透析探针。手术前，大鼠腹腔注射5％水合氯醛生理盐水溶液(0.25g/kg体重)，保持在整个手术过程大鼠处于麻醉状态。手术过程采用体温维持仪控制大鼠体温为37℃。施行静脉分离手术，暴露右侧外颈静脉，在外颈静脉与腋静脉交叉处上游约10mm处用手术剪在血管上表面剪出一小口，迅速将事先浸润肝素钠溶液的同轴型探针向心房方向插入血管中，用丝线将探针与血管固定在一起，防止探针滑脱(见图1)。在大鼠颈背部开一小口，将探针的进出口端导管在穿刺针引导下沿皮下从颈背部引出，再用医用手术缝合针线缝合各伤口，并擦上医用碘酒消毒。最后将大鼠置于清醒装置中，并联接上微透析系统各导管，开通微量注射泵以2μL/min流速灌流生理盐水溶液。恢复约12h后，大鼠可自由活动，在实验第二天再次皮下注射ISO生理盐水溶液50mg/kg造模。
进一步的，造模后0.5h，在不间断灌流下按10.8mL/kg剂量尾静脉给药生脉注射液。
进一步的，所述的血液透析液于给药生脉注射液后5min(去除出液管中的死体积)开始，按每15min收集一份透析液，每份30μL，收集至12h止。
进一步的，绘制模型大鼠给药生脉注射液后活性成分血药浓度-时间曲线图和药效-时间曲线图；根据血药浓度-时间关系和药效-时间关系建立药动学-药效学结合模型。
进一步的，所述的血液透析液通过CMA微透析仪和MAB 7同轴型微透析探针收集。
进一步的，所述的血液透析液中的活性成分的血药浓度时，采用Agilent1200液相色谱仪，和API4000三重四级杆质谱联用仪。
具体方法包括：精密量取透析液15μL于微量衬管中，加入15μL地高辛内标溶液(浓度为500ng/mL的地高辛甲醇溶液)，涡旋混合10sec后直接进样分析。
色谱条件：色谱柱Waters Xbridge C18柱(2.1mm×50mm，3.5μm)，流动相：0.05％醋酸水溶液(A相)-0.05％醋酸乙腈(B相)，线性洗脱梯度：0min 20％B，6min 30％B，10min50％B，14min 62％B，15min 20％B，21min 20％B。流速0.5mL·min-1，柱温40℃，进样量20μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，多重反应离子监测(MRM)模式，采样间隔200.0msec，碰撞气(CAD)：10psi，气帘气(CUR)：10psi，雾化气(GS1)：40psi，辅助气(GS2)：50psi，离子源温度(TEM)：650℃，正离子模式离子源电压：4500V。
进一步的，所述的质谱条件中，人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd、Rc和内标(IS)的参数去簇电压(DP)分别为120、140、140、120、140、140、140和60V，入口电压(EP)分别为15、15、9、15、9、9、13和7V，碰撞能量(CE)分别为50、70、70、70、90、70、70和50V，出口电压(CXP)分别为10、20、20、20、20、20、20和10V。
进一步的，所述的测定血液透析液中药效指标NO时采用Waters2695 HPLC液相色谱仪，和Waters2475荧光检测器。
进一步的，所述的血液透析液中NO2 －和NO3 －总含量测定方法包括：精密量取透析液10μL于0.6mL聚丙烯管中，分别加入10μL浓度为1mM的NADPH溶液、10μL浓度为1mM的FAD溶液和40μL浓度为1U/mL的硝酸盐还原酶溶液。涡旋混匀5s后放置于室温下避光孵育40min，再加入20μL浓度为50U/mL的LDH溶液，再涡旋混匀5s后于室温下避光孵育20min，目的是去除体系中未反应完的NADPH，随后在反应完的样品中加入150μL去离子水，涡旋混匀5s后，加入20μL浓度为316μM的DAN溶液，在25℃条件下孵育30min后加入20μL浓度为1.4M的NaOH溶液，混匀后10,000rpm离心5min，取上清液直接进样分析。
进一步的，所述的血液透析液中NO2 －和NO3 －总含量测定的色谱条件：Waters2695HPLC液相色谱仪，配Waters2475荧光检测器。色谱柱为Waters XBridge C18柱(2.1×50mm,3.5μm；Waters,Ireland)。流动相：为20mM Na2HPO4水溶液(pH 10)-乙腈(85:15，v/v)。流速：0.3mL/min，柱温30℃，进样量10μL。荧光检测激发波长355nm，发射波长460nm。
本发明优点在于：
本发明创建了一种清醒大鼠在体微透析取样技术，通过采集血液透析液同时分析血药浓度和药效指标的变化，成功地运用于生脉注射液抗大鼠心肌缺血的血药浓度-时间和药效-时间关系研究，并建立了药动学-药效学结合模型。本发明研究表明，当选择合适的血液内源性生物标记物作为药效指标，清醒动物在体微透析采样技术将成为药动学-药效学结合研究的理想工具。
附图说明
图1.大鼠颈静脉埋植微透析探针示意图。
图2.微透析采样技术用于PK-PD结合研究基本原理图。
图3.质谱参数DP优化结果。
图4.质谱参数EP优化结果。
图5.质谱参数CE优化结果。
图6.质谱参数CXP优化结果。
图7.离子源参数CAD优化结果。
图8.离子源参数CUR优化结果。
图9.离子源参数GS1优化结果。
图10.离子源参数GS2优化结果。
图11.离子源参数TEM优化结果。
图12.离子源参数IS优化结果。
图13.空白透析液的选择离子色谱图。
图14.人参皂苷混合标准品和内标生理盐水溶液的选择离子色谱图。
图15.静脉注射给药27.5min后所取透析液样品的选择离子色谱图。
图16.人参皂苷Rg1和Re透析液浓度-时间曲线(n＝6)。
图17.人参皂苷Rg2和Rf透析液浓度-时间曲线(n＝6)。
图18.人参皂苷Rb1、Rd和Rc透析液浓度-时间曲线(n＝6)。
图19.给药生脉注射液后NO效应指标-时间曲线。
图20.人参皂苷Rg1、Re、Rg2和Rf的NO药效指标和血药浓度(C)关系曲线。
图21.人参皂苷Rb1、Rd和Rc的NO药效指标和血药浓度(C)关系曲线。
图22.人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1的NO药效指标和效应室浓度(Ce)的关系曲线。
图23.人参皂苷Rc和Rd的NO药效指标和效应室浓度(Ce)的关系曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、试剂与仪器
1.药品与试剂
对照品人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rc购于上海融禾医药科技发展有限公司。生脉注射液(经含量测定人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc的浓度分别为140.8、22.5、79.8、38.3、140.0、25.4和79.4μg/mL)由常熟雷允上制药有限公司提供。异丙肾上腺素(Isoproterenol，ISO)购于Sigma公司。内标物地高辛(digoxin)购于中国食品药品检定研究院。注射用生理盐水购于浙江大学附属医院。甲醇和乙腈为色谱纯(Merck公司)，醋酸为色谱纯(Tedia公司)，去离子水由Milli-Q超纯水系统制备(Milipore，Bedford，MA，USA)。其余试剂均为分析纯。
2.分析仪器
Agilent1200液相色谱仪(德国Agilent公司)，API4000三重四级杆质谱联用仪(美国Applied Biosystems公司)。Waters2695 HPLC液相色谱仪，配Waters2475荧光检测器。SDP121P型离心浓缩仪(美国Thermo公司)；Mini span离心机(德国Eppendorf公司)；涡旋震荡器(德国IKA公司)；分析天平(瑞士Mettler公司)。
3.微透析采样系统
CMA微透析仪(瑞士CMA公司)，配微量泵、高精度流速控制器及注射器；Univentor820型微量收集器；大鼠体温维持仪(型号：69001，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；CMA/120型微透析清醒动物实验装置(瑞士CMA公司)；MAB 7同轴型微透析探针(Microbiotech,Stockholm,Sweden)，型号：7.15.10，截留分子量为15kD。
二、溶液配制
对照品储备液：称取人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc对照品适量，精密称定，分别用甲醇溶解配制成质量浓度为3.35、1.35、1.25、1.44、6.13、1.48和1.83mg/mL的对照品储备液，4℃保存。
质量控制(QC)储备液：精密量取各对照品储备液适量混合，用甲醇定容配制成高、中、低三种浓度的QC储备液，Rg1浓度分别为200、20、4ng/mL，Rg2浓度分别为40、20、4ng/mL，Re浓度分别为200、20、4ng/mL，Rf浓度分别为100、20、4ng/mL，Rb1浓度分别为100、20、4ng/mL，Rd浓度分别为100、20、4ng/mL，Rc浓度分别为100、20、4ng/mL。
内标溶液：精密称取地高辛对照品适量，用甲醇溶解配制成浓度为1mg/mL的内标储备液。使用时，用甲醇稀释成地高辛浓度为500ng/mL。
含药灌流液：精密吸取人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc对照品储备液各适量混合，离心浓缩蒸干甲醇后，加入注射用生理盐水复溶，配成含人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc高、中、低质量浓度分别为200、100、20；50、25、5；200、100、20；100、50、20；100、20、10；40、5、2和40、5、2ng/mL的灌流液，用于反向透析法测定体内回收率。
三、动物实验
雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重250±20g，由浙江省实验动物中心提供。
许可证号：SCXK(浙)2008-0033。所有大鼠饲养于大鼠笼(48×29×18cm3)内，室温为22±2℃，湿度为50±10％。于12h光照和12h黑暗环境下适应性饲养7天，自由饮食饮水。给药之前禁食12h，全程不禁水。
实验第一天，大鼠皮下注射ISO生理盐水溶液50mg/kg造模，造模后约12h，进行手术埋植微透析探针。手术前，大鼠腹腔注射5％水合氯醛生理盐水溶液(0.25g/kg体重)，保持在整个手术过程大鼠处于麻醉状态。手术过程采用体温维持仪控制大鼠体温为37℃。施行静脉分离手术，暴露右侧外颈静脉，在外颈静脉与腋静脉交叉处上游约10mm处用手术剪在血管上表面剪出一小口，迅速将事先浸润肝素钠溶液的同轴型探针向心房方向插入血管中，用丝线将探针与血管固定在一起，防止探针滑脱(见图1)。在大鼠颈背部开一小口，将探针的进出口端导管在穿刺针引导下沿皮下从颈背部引出，再用医用手术缝合针线缝合各伤口，并擦上医用碘酒消毒。最后将大鼠置于清醒装置中，并联接上微透析系统各导管，开通微量注射泵以2μL/min流速灌流生理盐水溶液。恢复约12h后，大鼠可自由活动，在实验第二天再次皮下注射ISO生理盐水溶液50mg/kg造模。造模后0.5h，在不间断灌流下按10.8mL/kg剂量尾静脉给药生脉注射液。给药后5min(去除出液管中的死体积)开始，按每15min收集一份透析液，每份30μL，收集至12h止。在实验第二天整个过程大鼠可自由活动，禁食可自由饮水。收集的透析液于4℃保存备用于测定药物浓度及NO2 －和NO3 －总含量，24h内分析完。微透析采样技术用于PK-PD结合研究的基本原理见图2。
四、样本处理方法
1.透析液药物浓度测定
精密量取透析液15μL于微量衬管中，加入15μL地高辛内标溶液，涡旋混合10sec后直接进样分析。
2.透析液NO2 －和NO3 －总含量测定
精密量取透析液10μL于0.6mL聚丙烯管中，分别加入10μL浓度为1mM的NADPH溶液、10μL浓度为1mM的FAD溶液和40μL浓度为1U/mL的硝酸盐还原酶溶液。涡旋混匀5s后放置于室温下避光孵育40min，再加入20μL浓度为50U/mL的LDH溶液，再涡旋混匀5s后于室温下避光孵育20min，目的是去除体系中未反应完的NADPH，随后在反应完的样品中加入150μL去离子水，涡旋混匀5s后，加入20μL浓度为316μM的DAN溶液，在25℃条件下孵育30min后加入20μL浓度为1.4M的NaOH溶液，混匀后10,000rpm离心5min，取上清液直接进样分析。
五、分析方法
1.透析液药物浓度测定
色谱条件：色谱柱为Waters Xbridge C18柱(2.1mm×50mm，3.5μm)，流动相：0.05％醋酸水溶液(A相)-0.05％醋酸乙腈(B相)，线性洗脱梯度：0min 20％B，6min 30％B，10min50％B，14min 62％B，15min 20％B，21min 20％B。流速0.5mL·min-1，柱温40℃，进样量20μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，多重反应离子监测(MRM)模式，采样间隔200.0msec，碰撞气(CAD)：10psi，气帘气(CUR)：10psi，雾化气(GS1)：40psi，辅助气(GS2)：50psi，离子源温度(TEM)：650℃，正离子模式离子源电压：4500V。通过正负离子模式母离子、子离子扫描确定标准品与内标的母离子和子离子，各标准品与内标其他质谱参数详见表1。
表1标准品与内标质谱参数
Figure GDA0002829842060000091
2.透析液NO2 -和NO3 -总含量测定
色谱条件：Waters 2695HPLC液相色谱仪，配Waters2475荧光检测器。色谱柱为Waters XBridge C18柱(2.1×50mm,3.5μm；Waters,Ireland)。流动相：为20mM Na2HPO4水溶液(pH 10)-乙腈(85:15，v/v)。流速：0.3mL/min，柱温30℃，进样量10μL。荧光检测激发波长355nm，发射波长460nm。
六、数据处理
采用WinNonlin 5.3软件(Pharsight Corporation,Mountain View,CA)的相关程序建立药动学模型和PK-PD结合模型，计算相应的药动学参数和药效学参数。数据表示为Mean±SD。
实施例2药动学研究结果与讨论
一、方法学验证
1.质谱条件优化
质谱参数优化：用生理盐水配制人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd、Rc和内标(IS)的混合标准品溶液，分别进行质谱参数去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞能量(CE)、出口电压(CXP)的优化，主要根据质谱响应大小(intensity)选择最优参数，优化结果分别如图3、图4、图5和图6所示。
根据优化结果，最后确定人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd、Rc和内标(IS)的DP分别为120、140、140、120、140、140、140和60V，EP分别为15、15、9、15、9、9、13和7V，CE分别为50、70、70、70、90、70、70和50V，CXP分别为10、20、20、20、20、20、20和10V。
质谱离子源参数优化：用生理盐水配制人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd、Rc和内标(IS)的混合标准品溶液，分别进行质谱离子源参数碰撞气(CAD)、气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、辅助气(GS2)、离子源温度(TEM)、离子源电压(IS)的优化，主要根据质谱响应大小(intensity)选择最优参数，优化结果分别如图7、图8、图9、图10、图11和图12所示。
根据优化结果，综合考虑各人参皂苷的响应大小，最后选择CAD为10psi，CUR为10psi，GS1为40psi，GS2为50psi，TEM为650℃，IS为4500V。
2.专属性
取空白透析液、生理盐水溶液添加混标(Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc浓度分别为200、40、200、100、100、100和100ng/mL)和内标(500ng/mL)、静脉注射给药27.5min后所取的透析液(第二份透析液)加内标(500ng/mL)，进样分析，获得LC-MS/MS提取离子色谱图(分别如图13、图14和图15)，结果显示空白透析液中内源性物质不干扰人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd、Rc和内标的测定，方法专属性良好。
3.线性、定量限和检测限
精密量取各对照品储备液适量，加甲醇制成混合对照品储备液，再用甲醇稀释混标储备液制成系列浓度混标溶液，分别精密量取各浓度混标溶液15μL于微量进样衬管中，离心浓缩干燥后，加入生理盐水15μL，超声5min溶解，再加入15μL内标溶液，混匀后进样分析。以人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc的浓度(x ng/mL)为横坐标，相应对照品峰面积与内标峰面积的比值(y)为纵坐标进行线性回归，得各人参皂苷的标准曲线，结果见表2。
分别按信噪比为10:1和3:1计，人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc的定量下限(LLOQ)和检测下限(LLOD)结果见表2。
表2七种人参皂苷的标准曲线、线性范围、定量下限和检测下限
Figure GDA0002829842060000101
表2结果表明，所建立的方法用于血液透析液中七种人参皂苷成分的测定，线性良好，灵敏度高。
4.基质效应
精密量取低、中、高三种浓度QC储备液各两份，离心浓缩蒸干甲醇后，一份加入生理盐水复溶，再加入等体积的内标溶液混匀，离心后进样分析，求得混标与内标的峰面积比，记为A；另一份加入等量的空白透析液复溶，再加入等体积的内标溶液混匀，离心后进样分析，求得混标与内标的峰面积比，记为B。计算基质效应＝(B/A)×100％，每个浓度各平行6份，结果见表3。
表3七种人参皂苷的基质效应(n＝6)
Figure GDA0002829842060000111
数据结果显示方法的基质效应在82.76～108.91％之间，表明血液透析液基质对七种人参皂苷的定量分析结果影响不大。
5.回收率实验
分别精密量取低、中、高三种浓度QC储备液各15μL于微量进样衬管中，离心浓缩干燥后，加入空白透析液15μL，超声5min溶解，再加入15μL内标溶液，混匀后进样分析，每个浓度各平行6份。随行标准曲线求得浓度测定值，计算回收率(％)＝浓度测定值/实际浓度值×100％，结果见表4。
表4七种人参皂苷的回收率(n＝6)
Figure GDA0002829842060000112
Figure GDA0002829842060000121
上表数据结果显示七种人参皂苷回收率在82.68～102.29％之间，表明该方法的准确度良好。
6.精密度实验
分别精密量取低、中、高三种浓度QC储备液各15μL于微量进样衬管中，离心浓缩干燥后，各加入生理盐水溶液15μL，超声5min溶解，再加入15μL内标溶液，混匀后进样分析，每种浓度各平行6份，随行标准曲线求浓度，用于计算日内精密度。分别在6天中量取6份低、中、高三种QC浓度标准品储备液按上述方法处理、分析，以当天随行标准曲线求浓度，计算日间精密度。低、中、高三种质量浓度标准品的日内精密度和日间精密度结果见表5。
表5低、中、高浓度人参皂苷标准品的日内和日间精密度(n＝6)
Figure GDA0002829842060000122
数据结果表明人参皂苷日内精密度RSD(％)≤16.44％，日间精密度RSD(％)≤14.70％，方法精密度符合要求。
7.稳定性试验
分别量取低、中、高三种浓度QC标准品储备液于微量进样衬管中，离心浓缩干燥后，各加入空白透析液复溶，再各加入等体积的内标溶液混匀后，分别在室温条件下于0、1.0、2.0、6.0、12.0h进样分析，分别求得三个浓度各成分人参皂苷与内标峰面积比值的RSD(％)，用于考察室温下12h内样品的稳定性，以同样方法处理三种浓度QC标准品储备液后放置于4℃冰箱保存，并分别于0，1.0，2.0，6.0，12.0和24.0h后进样分析，考察4℃条件下保存24h的稳定性，稳定性考察结果见表6。
表6低、中、高三种浓度样品中人参皂苷的稳定性
Figure GDA0002829842060000131
表6数据结果表明，样品在室温下放置12h基本稳定，样品在4℃条件下保存24h也基本稳定。
二、微透析探针回收率
1.回收率稳定性考察
微透析探针长时间埋植于体内，可能由于蛋白吸附等作用使探针透析膜对待测物的通透性发生改变，从而影响待测物的回收率，为了真实准确反映组织中待测物的浓度，在实验过程中探针的回收率必须保持稳定。本研究为了考察探针回收率的稳定性，先于探针埋植前测定其对人参皂苷的体外回收率，再将探针埋植于大鼠体内，24小时后取出再次测定其体外回收率，比较前后回收率的差异用于考察回收率的稳定性。回收率稳定性考察结果见表7。
表7人参皂苷体外回收率(Re％)测定结果(mean±SD，n＝6)
Figure GDA0002829842060000141
经过t检验结果表明：探针在埋植前和埋植24h后，对人参皂苷的体外回收率没有显著性差异(P>0.05)，说明探针在体内埋植24h后，探针透析膜对人参皂苷的通透性没有改变，其回收率基本稳定。
2.体内回收率
采用体内反向透析法测定微透析探针对人参皂苷的回收率。将大鼠按实施例1中第三部分动物实验方法埋植微透析探针后，以2μL/min流速分别灌注高、中、低三种浓度的人参皂苷混合生理盐水溶液，平衡1h后，连续收集6份透析液样品，灌流液和透析液分别加入等体积内标溶液混匀后采用上述HPLC-MS/MS法测定灌流液(Cin)和透析液(Cout)浓度，计算体内回收率Re％＝(1-Cout/Cin)×100％。结果见表8。
表8人参皂苷体内回收率(Re％)测定结果(Mean±SD，n＝6)
Figure GDA0002829842060000142
三、生脉注射液药动学研究结果与讨论
以微透析技术采取大鼠血液透析液后，按实施例1第四部分第1项下方法处理样品后，再按实施例1第五部分第1项下方法测定透析液中各成分浓度(Cout)，根据各成分体内回收率(Re％)大小，求得各成分实际浓度C＝Cout/Re％。结果药代标示物人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc的浓度(C)-时间(Time)关系曲线见图16、图17和图18。
采用WinNonlin5.3软件进行药动学隔室模型拟合，以Akaike’s信息标准AIC值、残差平方和(SSR)、拟合度(CORR)为指标确定最佳房室模型。根据AIC值越小、残差平方和值越小以及拟合度值越大，则模型拟合越好的判断原则，综合考虑兼顾各个指标以及模型的简单性，最后确定人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc的最佳房室模型为二室模型，计算药动学参数包括：分布相的半衰期(t1/2α)、消除相的半衰期(t1/2β)，药物从中央室消除的一级速率常数(K10)，药物从中央室向周边室转运和从周边室向中央室转运的一级速率常数(K12和K21)，血药浓度-时间曲线下面积(AUC)，表观分布容积(Vc)、清除率(Cl)和平均滞留时间(MRT)。求得药动学参数见表9和表10。
表9人参皂苷Rg1、Rg2、Re和Rf的药动学参数(Mean±SD，n＝6)
Figure GDA0002829842060000151
表10人参皂苷Rb1、Rd和Rc的药动学参数(Mean±SD，n＝6)
Figure GDA0002829842060000152
由表9和表10数据可知，三醇型人参皂苷Rg1、Rg2、Re和Rf具有较短的半衰期，在体内消除较迅速，二醇型人参皂苷Rb1、Rd和Rc的半衰期较长，在体内消除缓慢，该结果与人参皂苷的基本药动学特征相符。
实施例3药效动力学研究结果与讨论
一、方法学验证
1.线性
精密吸取一定量的NO3 －标准贮备液，用生理盐水稀释成一系列浓度分别为0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0和40.0μM的NO3 －标准溶液，按上述实施例1第四部分第2项下方法处理后进行HPLC-FLU分析。将NO3 －各标准溶液浓度(x)与各反应产物NAT的峰面积(y)进行线性回归，得标准曲线为：y＝240377.82x+123099.47，R2＝0.9981，NO3 －生理盐水溶液在0－40.0μM浓度范围内呈良好线性关系。
2.精密度和加样回收率
精密称取透析液样品10μL按实施例1第四部分第2项下方法处理后，取上清液进行HPLC-FLU分析，平行6份，随行标准曲线，测定透析液中NO2 －和NO3 －的总含量，计算日内精密度，结果日内RSD(％)为5.27％。按同样方法对同一份透析液样品重复测定6天，随行标准曲线，以当日的标准曲线计算透析液中NO2 －和NO3 －的总含量，考察日间精密度，结果日间RSD(％)为8.01％。
加样回收率的考察：分别取40μL低、中、高浓度为25、50、100μM的NO3 －标准生理盐水溶液加入到160μL透析液中(折算成加样浓度分别为5.0、10.0、20.0μM)，混匀后各取10μL并按上述实施例1第四部分第2项下方法处理，取上清液进行HPLC-FLU分析，随行标准曲线测得透析液中NO2 －和NO3 －的总浓度，每个浓度点平行6份，求得加样回收率＝(测得量－透析液含量)/加入量×100％，测定结果低、中、高浓度的加样回收率分别为(107.3±6.2)％、(95.0±1.7)％和(107.1±3.1)％。
上述结果表明测定透析液中NO2 －和NO3 －总含量的方法精密度和加样回收率符合要求。
3.稳定性
NAT产物稳定性：配制低、中、高分别为5.0、10.0、20.0μM的三份NO3 －标准生理盐水溶液，按上述实施例1第四部分第2项下方法处理后，将上清液室温放置于进样盘上，分别于0，1.0，2.0，6.0，12.0和24.0h后进行HPLC-FLU分析，考察产物在室温下放置24h的稳定性，结果低、中、高浓度产物NAT峰面积RSD(％)分别为1.65％、1.38％和1.31％，表明产物在室温下放置24h稳定。
透析液NO2 －和NO3 －总含量室温稳定性：取新鲜透析液一份，在室温条件下放置0，1.0，2.0，6.0，12.0和24.0h后，分别按上述实施例1第四部分第2项下方法处理，测定透析液NO2 －和NO3 －总含量，考察透析液样品室温放置24h后NO2 －和NO3 －总含量的稳定性，结果总含量RSD(％)为0.84％，表明透析液在室温下放置24h稳定。
二、生脉注射液药效动力学研究结果与讨论
以微透析技术采取大鼠血液透析液后，按实施例1第四部分第2项下方法处理样品后，再按实施例1第五部分第2项下方法测定透析液中NO2 －和NO3 －总含量，间接反映样品中NO含量，以各个时间点NO含量与基础含量(即给药前0时间点的含量)的比值作为最终的NO药效指标用于药效动力学研究。NO药效指标-时间关系曲线如图19所示。
从图19看出，给心肌缺血大鼠静脉注射生脉注射液后，在30～300min内表现出明显的诱导NO释放的效应，NO药效指标达峰时间约为3h，最大效应比基础值提高约200％。
实施例3PK-PD结合模型的建立
给心肌缺血大鼠静脉注射给药生脉注射液后，除人参皂苷Rd外，其他各主要成分血药浓度均立即达到峰值(图16和图17)，而NO药效指标的达峰时间约为给药后的3h(图19)，药物效应与血药浓度之间存在着明显的滞后现象，即药物效应与血药浓度间存在逆时针滞后环(counterclockwise hysteresis)，效应并不与人参皂苷血药浓度直接相关，如图20和图21所示。
本节分别以人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc为生脉注射液药代标示物，以NO为药效指标，运用WinNonlin5.3软件中的PK-PD Link程序模块，运用二房室药动学模型与经典的效应室模型相结合，以Akaike’s信息标准AIC值、残差平方和(SSR)、拟合度(CORR)为指标确定最优的PK-PD结合模型。根据AIC值越小、残差平方和值越小以及拟合度值越大，则模型拟合越好的判断原则，综合考虑兼顾各个指标以及模型的简单性，最后选择Sigmoid-Emax模型为人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd和Rc的最佳PD模型，建立PK-PD结合模型并求得药效学参数见表11。
表11人参皂苷PK-PD结合模型药效学参数(Mean±SD，n＝6)
Figure GDA0002829842060000181
根据拟合的PK-PD结合模型，得到效应室浓度Ce，采用Sheiner效应室模型，可以将效应-血药浓度的滞后关系转化为效应-效应室浓度Ce的正变关系，如图22和图23所示。药物效应与效应室浓度Ce呈良好的相关性，效应和Ce之间的关系符合Sigmoid-Emax模型。
结论
常规血药浓度法研究药动学需要定时对动物取血以测定血药浓度，频繁的取血过程使动物体内的总血容量不断减少，这对于药动学分析是不利的，尤其对于小动物的影响非常明显。此外，利用血药浓度法采集的血样，需要经过分层、离心、萃取、过滤等繁琐的操作后方可进样进行分析，因此可能会导致结果差异较大。血液微透析技术通过将探针直接放置到血流中来监测血药浓度和效应指标的动态变化，在长时间取样过程中，动物的血容量并不减少。因此，血液微透析可在一只小动物身上实现完整的药物体内过程研究，既可节约动物资源，又可长时间取样分析，能够获得不含蛋白质等生物大分子的样品，而且结果更接近于真实情况。本发明以中药复方生脉注射液为研究载体，通过血液微透析技术实现了对清醒的、自由活动大鼠体内多成分血药浓度和效应指标的同时动态监测，结合透析液中多成分药物的HPLC-MS/MS分析技术和透析液中亚硝酸盐和硝酸盐定量分析方法，同步获取了多成分血药浓度和效应指标随时间的变化关系，并成功拟合建立了PK-PD结合模型，该研究结果表明了微透析采样技术用于中药复方PK-PD结合研究的可行性，为中药复方药代动力学研究提供了技术支持。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.一种给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，包括以下步骤：采用高效液相色谱-三重四级杆质谱方法分析血液透析液中的活性成分血药浓度，并采用高效液相色谱-荧光检测技术测定血液透析液中药效指标NO；
其中，所述的血液透析液为通过微透析采样得到的血液透析液，采集方法如下：模型大鼠颈静脉埋植微透析探针后，被置于清醒动物装置中；向清醒恢复的大鼠尾静脉注射给药生脉注射液后，自第5min开始，按每15min收集一份透析液，每份30μL，收集至12h止；
所述的活性成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rc；所述的药效指标NO通过测定透析液中NO2 －和NO3 －总含量获得；
检测所述的血液透析液中活性成分的血药浓度时，采用Agilent1200液相色谱仪，和API4000三重四级杆质谱联用仪；具体方法包括：精密量取透析液15μL于微量衬管中，加入15μL浓度为500ng/mL的地高辛甲醇内标溶液，涡旋混合10sec后直接进样分析；
色谱条件：色谱柱Waters Xbridge C18柱，2.1mm×50mm，3.5μm，流动相A相为0.05％醋酸水溶液，流动相B相为0.05％醋酸乙腈，线性洗脱梯度：0min 20％B，6min 30％B，10min50％B，14min 62％B，15min 20％B，21min 20％B；流速0.5mL·min-1，柱温40℃，进样量20μL；
质谱条件：电喷雾离子源，多重反应离子监测模式，采样间隔200.0msec，碰撞气：10psi，气帘气：10psi，雾化气：40psi，辅助气：50psi，离子源温度：650℃，正离子模式离子源电压：4500V；
所述的质谱条件中，人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd、Rc和内标的参数去簇电压分别为120、140、140、120、140、140、140和60V，入口电压分别为15、15、9、15、9、9、13和7V，碰撞能量分别为50、70、70、70、90、70、70和50V，出口电压分别为10、20、20、20、20、20、20和10V；
在检测得到所述的活性成分血药浓度和药效指标NO后，绘制给药生脉注射液后活性成分血药浓度-时间曲线图和药效-时间曲线图；根据血药浓度-时间关系和药效-时间关系建立药动学-药效学结合模型。
2.根据权利要求1所述的给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，所述的血液透析液为异丙肾上腺素诱导的心肌缺血模型大鼠给药生脉注射液后的血液透析液。
3.根据权利要求1所述的给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，所述的血液透析液通过CMA微透析仪和MAB 7同轴型微透析探针收集。
4.根据权利要求1所述的给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，所述的血液透析液中NO2 －和NO3 +总含量测定的色谱条件：
Waters2695HPLC液相色谱仪，配Waters2475荧光检测器；色谱柱为Waters XBridgeC18柱，2.1×50mm,3.5μm；流动相为体积比为85：15的20mM Na2HPO4水溶液-乙腈，所述的Na2HPO4水溶液的pH为10；流速：0.3mL/min，柱温30℃，进样量10μL；荧光检测激发波长355nm，发射波长460nm。
5.根据权利要求1所述的给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，所述的血液透析液中NO2 －和NO3 －总含量测定方法包括：精密量取透析液10μL于0.6mL聚丙烯管中，分别加入10μL浓度为1mM的NADPH溶液、10μL浓度为1mM的FAD溶液和40μL浓度为1U/mL的硝酸盐还原酶溶液；涡旋混匀5s后放置于室温下避光孵育40min，再加入20μL浓度为50U/mL的LDH溶液，再涡旋混匀5s后于室温下避光孵育20min，目的是去除体系中未反应完的NADPH，随后在反应完的样品中加入150μL去离子水，涡旋混匀5s后，加入20μL浓度为316μM的DAN溶液，在25℃条件下孵育30min后加入20μL浓度为1.4M的NaOH溶液，混匀后10,000rpm离心5min，取上清液直接进样分析。
CN201810036694.2A 2018-01-15 2018-01-15 一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用 Active CN108362807B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810036694.2A CN108362807B (zh) 2018-01-15 2018-01-15 一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810036694.2A CN108362807B (zh) 2018-01-15 2018-01-15 一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108362807A CN108362807A (zh) 2018-08-03
CN108362807B true CN108362807B (zh) 2021-02-19

Family

ID=63006263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810036694.2A Active CN108362807B (zh) 2018-01-15 2018-01-15 一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108362807B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109596817A (zh) * 2018-12-07 2019-04-09 上海浩港生物技术有限公司 一种lbp的质谱试剂盒lbp含量检测系统及方法
CN110223734A (zh) * 2019-07-22 2019-09-10 华中农业大学 一种抗菌药物头孢噻呋药动-药效同步模型的构建方法及其应用
CN111134894B (zh) * 2020-01-17 2022-02-22 上海长海医院 一种在体测定犬前列腺组织连续动态游离药物浓度的采样方法
CN114646691A (zh) * 2020-12-18 2022-06-21 中国科学院上海药物研究所 一种同时定量大鼠血浆中丹七通脉片15种人参皂苷类成分的分析方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1939348A (zh) * 2006-09-22 2007-04-04 中国药科大学 一种中药有效成分的筛选方法
CN102706998A (zh) * 2012-02-15 2012-10-03 江苏苏中药业集团股份有限公司 生脉注射液的质量控制方法
CN105606744A (zh) * 2015-11-19 2016-05-25 南京中医药大学 快速测定中药知母口服给药后活性成分药代动力学的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1939348A (zh) * 2006-09-22 2007-04-04 中国药科大学 一种中药有效成分的筛选方法
CN102706998A (zh) * 2012-02-15 2012-10-03 江苏苏中药业集团股份有限公司 生脉注射液的质量控制方法
CN105606744A (zh) * 2015-11-19 2016-05-25 南京中医药大学 快速测定中药知母口服给药后活性成分药代动力学的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
利用血液微透析技术进行青藤碱的药动学研究;凌家俊等;《广州中医药大学学报》;20050930;第22卷(第5期);第1.1节，第2.4节 *
微透析技术在中药药物动力学和药效学中的应用;曹岗等;《中药药理与临床》;20090415;第25卷(第2期);第131～133页 *
生脉注射液蛋白质组学与药效物质体内过程研究;詹淑玉;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20160815(第08期);第3.1节，第3.2.5节，图3.2，第5.1.1节，第5.2节，第5.3.1.1节，第5.3.1.2节，第5.3.2节，第5.1.1节 *
詹淑玉.生脉注射液蛋白质组学与药效物质体内过程研究.《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》.2016,(第08期),E057-84. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108362807A (zh) 2018-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108362807B (zh) 一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用
Ungerstedt Microdialysis—principles and applications for studies in animals and man
CN109239224B (zh) 酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法
CN113009027B (zh) 一种测定糖化血红蛋白方法
Sirolli et al. Toward personalized hemodialysis by low molecular weight amino-containing compounds: future perspective of patient metabolic fingerprint
CN111983244B (zh) 一种干血斑中四种维生素的检测方法及检测试剂盒
CN112415116B (zh) 一种大鼠血浆中芦荟苦素的lc-ms/ms测定方法
CN103837620A (zh) 一种同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法
CN108802221A (zh) 末梢血中维生素a和维生素e的微量检测方法
CN109884234A (zh) 一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法
CN115248272A (zh) 一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法
Dong et al. Development and evaluation of new methods for protein quantification in dissolving microneedles formulations
CN112129871A (zh) 复合磷脂脂质体中dope和m5两种磷脂含量的检测方法
CN115248263B (zh) 一种定量检测唾液中抗癫痫药物的hplc-ms/ms方法
CN103439444A (zh) 检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法
Sun et al. Pharmacokinetic study of zhebeirine in mouse blood by ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry
US20030176805A1 (en) Method for detecting alpha-oxoaldehydes in the whole blood, blood plasma and/or serum of a patient
CN108169370B (zh) 测定生物样品中丙酮酸乙酯及其代谢物丙酮酸的方法
Xiong et al. Determining concentrations of icotinib in plasma of rat by UPLC method with ultraviolet detection: Applications for pharmacokinetic studies
CN109470533A (zh) 一种用于便携式血糖仪的人源全血基质质控品的制备方法
CN115078568A (zh) 一种测定羟基酪醇含量及纯度的超高效液相色谱方法
CN103487539A (zh) 利用超快速液相色谱-串联三重四级杆质谱测定家蚕血淋巴中阿苯达唑及代谢物含量的方法
CN113092615A (zh) 一种液质联用检测头发中抗癫痫药物及其代谢物的方法
CN111579690A (zh) 一种利用霉酚酸-d3作为内标物测定生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其使用方法
CN105806985B (zh) 一种马钱子苷元生物样品的测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant