CN109596817A - 一种lbp的质谱试剂盒lbp含量检测系统及方法 - Google Patents

一种lbp的质谱试剂盒lbp含量检测系统及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109596817A
CN109596817A CN201811496506.0A CN201811496506A CN109596817A CN 109596817 A CN109596817 A CN 109596817A CN 201811496506 A CN201811496506 A CN 201811496506A CN 109596817 A CN109596817 A CN 109596817A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lbp
fitc
sample
mass concentration
mass
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811496506.0A
Other languages
English (en)
Inventor
董学渊
蒋林彬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Bogang Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Shanghai Haogang Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Haogang Biotechnology Co Ltd filed Critical Shanghai Haogang Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201811496506.0A priority Critical patent/CN109596817A/zh
Publication of CN109596817A publication Critical patent/CN109596817A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种LBP的质谱试剂盒LBP含量检测系统及方法，利用所述LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法的肾病LBP的质谱试剂盒；利用所述LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法的肝病LBP的质谱试剂盒。本发明利用质谱技术设计制造用于检测人类LBP的质谱检测试剂盒，运用质谱技术检测LBP含量；本发明比现有市售的LBP试剂盒灵敏度检出率高10％，可对应其他方法检测肝病、肾病指标，确定LBP的人体检测标准值。

Description

一种LBP的质谱试剂盒LBP含量检测系统及方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种LBP的质谱试剂盒LBP含量检测系统及方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
对于LBP的检测主要有定量方法和定性检测方法，定量检测方法有双抗夹心法、放射免疫分析法、免疫层析法等，其中放射免疫分析法在临床中有一定的限制。
目前通常使用ELISA方法检测，检测范围为0.312-20pg/mL，可检测重组或天然的待测物质，且与其他相关蛋白无交叉反应，ELISA的灵敏度还可以，但操作复杂，检测耗时长，定量检测偏差较大，对样品的稀释度不好控制，免疫层析法主要用于定性，可以快速给出结果，但是不能给出定量数据，误差较大。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)ELISA试剂盒的操作复杂，检测耗时长，定量检测偏差较大，对样品的稀释度不好控制。
(2)免疫层析法不能给出定量数据，误差较大。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种LBP的质谱试剂盒LBP含量检测系统及方法，
本发明是这样实现的，一种LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法，包括：
利用药代动力学WinNonlin软件，采用非房室模型拟合大鼠单次口服LBP-FITC的经时血药质量浓度数据，最大峰质量浓度Cmax及达峰时间tmax为实测值；药时曲线下面积AUC、半衰期t1/2、总清除率CL、表观分布容积Vd、平均滞留时间MRT用统计矩参数；AUC反映药物进入血循环的总量；t1/2表示药物在体内分布达到平衡后，血浆药物质量浓度消除一半所需的时间，是表达药物在体内消除快慢的重要参数；CL表示单位时间内有多少分布容积中的药物被清除，是估算药物从体内消除速度的参数；MRT是指药物分子滞留在体内的平均时间；Vd值表征药物在体内被组织摄取的能力，表观容积大的药物体内存留时间较长；
血药质量浓度标准曲线的线性回归方程为y＝1378.7x－14.98(R2＝0.9989)。
进一步，血浆中LBP-FITC质量浓度0.05～10μg/mL。
本发明的另一目的在于提供一种质谱试剂盒LBP含量检测系统包括：
LBP-FITC标准贮备液配制设备：用于称取LBP-FITC样品，置于容量瓶中，加入磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，配制成LBP-FITC标准贮备液，于4℃条件下保存；
LBP-FITC标准系列溶液配制设备：临用时精密量取贮备液适量，用磷酸盐缓冲溶液配制成质量浓度0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50μg/mL的LBP-FITC标准系列溶液。
本发明的另一目的在于提供一种验证所述BP的质谱试剂盒LBP含量检测方法检测效果的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法包括：
1)实验前质量200～250gSD雄性大鼠自由摄食和饮水，在适应环境3d后进行实验；血样放入EDTA处理过的管中，在4℃、3000r/min离心10min，取上清液获得空白血浆，置于EP管中可立即使用或置于－70℃冰箱中保存备用；
2)样品测定LBP-FITC的测定采用多功能酶标仪，在荧光激发波长495nm、发射波长520nm条件下测定荧光强度；取大鼠血浆150μL至黑色酶标板中测定荧光强度；
3)标准曲线的绘制：
取大鼠空白血浆120μL，精密加入30μL不同质量浓度的LBP-FITC标准系列溶液，配制成相当于质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg/mL的血浆样品，同时制备同体积的磷酸缓冲液代替LBP-FITC标准溶液用以测定空白血浆样品；以血浆中待测样品LBP-FITC的质量浓度为横坐标，测定的荧光强度扣除空白血浆的荧光强度为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得的直线回归方程即为标准曲线。
进一步，实验前需进行：多糖的提取与荧光标记：
采用膜分离技术提取，Sevag法脱蛋白，纯化得到多糖；将制备的LBP溶于水中，0.5mol/mLNaHCO3溶液调节pH值至8.0，加入FITC，室温避光搅拌反应24h；反应结束后，将反应液采用中速定性滤纸过滤，向滤液中加入无水乙醇至乙醇终体积分数为80％；
沉淀析出，离心弃去上清液；沉淀加水复溶，无水乙醇再沉淀，反复3次；再将沉淀用无水乙醇反复洗涤，直至上清液无荧光吸收后，冻干沉淀得LBP-FITC。
进一步，标准曲线的绘制后需进行：精密度分析：取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低0.1μg/mL、中1μg/mL、高10μg/mL3个质量浓度的质量控制QC样品，每一质量浓度进行5样本分析；将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，与配制的质量浓度进行对照求得方法的精密度；在同一天内重复测定5次，连续测定5d，以计算日内和日间相对标准偏差RSD。
进一步，标准曲线的绘制后需进行：回收率分析：取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低(0.1μg/mL)、中(1μg/mL)、高(10μg/mL)3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行5样本分析；每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，与配制的质量浓度对照求得方法的回收率；相对回收率的计算见以下公式：
进一步，标准曲线的绘制后需进行：稳定性分析：取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低0.1μg/mL、中1μg/mL、高10μg/mL3个质量浓度的QC样品，－20～25℃反复冻融3次，每一质量浓度进行5样本分析，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，计算RSD；
另取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低0.1μg/mL、中1μg/mL、高10μg/mL3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行5样本分析，于室温25℃条件下放置24h，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，计算RSD。
进一步，标准曲线的绘制后需进行：单次口服LBP-FITC的大鼠代谢动力学分析：
健康雄性SD大鼠200～250g6只，在适应环境3d后进行实验；给药前禁食12h，自由饮水，经口服灌胃给予LBP-FITC，给药剂量200mg/kg，给药容量1mL/100g；分别于灌胃给药前及给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48h尾静脉取血0.5mL；将血样采集到抗凝离心管中，3000r/min离心10min，取上清液得到血浆，测定荧光强度。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法的肾病LBP的质谱试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法的肝病LBP的质谱试剂盒。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明利用质谱技术设计制造用于检测LBP的质谱检测试剂盒，运用质谱技术检测LBP含量。本发明比现有市售的LBP试剂盒灵敏度检出率高10％，可对应其他方法检测肝病、肾病指标，确定LBP的人体检测标准值。
本发明LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法中，线性方程为y＝1378.7x－14.98(R2＝0.9989)，血浆中LBP-FITC质量浓度在0.05～10μg/mL范围内与荧光强度呈良好的线性关系。方法的精密度、回收率以及稳定性考察分析证明该方法符合生物样品体内定量分析的要求。单次灌胃给予大鼠LBP-FITC后，以药代动力学WinNonlin软件采用非房室模型拟合大鼠单次口服LBP-FITC的经时血药质量浓度数据，计算主要的药代动力学参数为最大峰质量浓度(Cmax)(2.39±0.71)μg/mL、达峰时间(tmax)(1.17±0.41)h；药时曲线下面积AUC0-t为(45.85±7.12)(μg·h)/mL，AUC0-∞为(127.31±39.00)(μg·h)/mL；半衰期(t1/2)为(80.32±32.70)h；清除率为(1693.96±492.47)mL/kg；平均滞留时间为(20.64±1.36)h。
附图说明
图1是本发明实施例提供的动物模型构建方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
ELISA试剂盒的操作复杂，检测耗时长，定量检测偏差较大，对样品的稀释度不好控制。
免疫层析法不能给出定量数据，误差较大。
下面结合具体分析对本发明的应用做进一步描述。
本发明实施例提供的LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法，包括：
利用药代动力学WinNonlin软件，采用非房室模型拟合大鼠单次口服LBP-FITC的经时血药质量浓度数据，最大峰质量浓度Cmax及达峰时间tmax为实测值；药时曲线下面积AUC、半衰期t1/2、总清除率CL、表观分布容积Vd、平均滞留时间MRT用统计矩参数；AUC反映药物进入血循环的总量；t1/2表示药物在体内分布达到平衡后，血浆药物质量浓度消除一半所需的时间，是表达药物在体内消除快慢的重要参数；CL表示单位时间内有多少分布容积中的药物被清除，是估算药物从体内消除速度的参数；MRT是指药物分子滞留在体内的平均时间；Vd值表征药物在体内被组织摄取的能力，表观容积大的药物体内存留时间较长；
血药质量浓度标准曲线的线性回归方程为y＝1378.7x－14.98(R2＝0.9989)。
血浆中LBP-FITC质量浓度0.05～10μg/mL。
本发明提供一种质谱试剂盒LBP含量检测系统包括：
LBP-FITC标准贮备液配制设备：用于称取LBP-FITC样品，置于容量瓶中，加入磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，配制成LBP-FITC标准贮备液，于4℃条件下保存；
LBP-FITC标准系列溶液配制设备：临用时精密量取贮备液适量，用磷酸盐缓冲溶液配制成质量浓度0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50μg/mL的LBP-FITC标准系列溶液。
如图1，本发明提供一种验证所述BP的质谱试剂盒LBP含量检测方法检测效果的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法包括：
S101:实验前取质量200～250gSD雄性大鼠自由摄食和饮水，在适应环境3d后进行实验；血样放入EDTA处理过的管中，在4℃、3000r/min离心10min，取上清液获得空白血浆，置于EP管中可立即使用或置于－70℃冰箱中保存备用；
S102:样品测定LBP-FITC的测定采用多功能酶标仪，在荧光激发波长495nm、发射波长520nm条件下测定荧光强度；取大鼠血浆150μL至黑色酶标板中测定荧光强度；
S103:标准曲线的绘制：取大鼠空白血浆120μL，精密加入30μL不同质量浓度的LBP-FITC标准系列溶液，配制成相当于质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg/mL的血浆样品，同时制备同体积的磷酸缓冲液代替LBP-FITC标准溶液用以测定空白血浆样品；以血浆中待测样品LBP-FITC的质量浓度为横坐标，测定的荧光强度扣除空白血浆的荧光强度为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得的直线回归方程即为标准曲线。
实验前需进行：多糖的提取与荧光标记：
采用膜分离技术提取，Sevag法脱蛋白，纯化得到多糖；将制备的LBP溶于水中，0.5mol/mLNaHCO3溶液调节pH值至8.0，加入FITC，室温避光搅拌反应24h；反应结束后，将反应液采用中速定性滤纸过滤，向滤液中加入无水乙醇至乙醇终体积分数为80％；
沉淀析出，离心弃去上清液；沉淀加水复溶，无水乙醇再沉淀，反复3次；再将沉淀用无水乙醇反复洗涤，直至上清液无荧光吸收后，冻干沉淀得LBP-FITC。
标准曲线的绘制后需进行：精密度分析：取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低0.1μg/mL、中1μg/mL、高10μg/mL3个质量浓度的质量控制QC样品，每一质量浓度进行5样本分析；将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，与配制的质量浓度进行对照求得方法的精密度；在同一天内重复测定5次，连续测定5d，以计算日内和日间相对标准偏差RSD。
标准曲线的绘制后需进行：回收率分析：取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低(0.1μg/mL)、中(1μg/mL)、高(10μg/mL)3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行5样本分析；每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，与配制的质量浓度对照求得方法的回收率；相对回收率的计算见以下公式：
标准曲线的绘制后需进行：稳定性分析：取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低0.1μg/mL、中1μg/mL、高10μg/mL3个质量浓度的QC样品，－20～25℃反复冻融3次，每一质量浓度进行5样本分析，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，计算RSD；
另取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低0.1μg/mL、中1μg/mL、高10μg/mL3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行5样本分析，于室温25℃条件下放置24h，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，计算RSD。
标准曲线的绘制后需进行：单次口服LBP-FITC的大鼠代谢动力学分析：健康雄性SD大鼠200～250g6只，在适应环境3d后进行实验；给药前禁食12h，自由饮水，经口服灌胃给予LBP-FITC，给药剂量200mg/kg，给药容量1mL/100g；分别于灌胃给药前及给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48h尾静脉取血0.5mL；将血样采集到抗凝离心管中，3000r/min离心10min，取上清液得到血浆，测定荧光强度。本发明利用质谱技术设计制造用于检测LBP的质谱检测试剂盒，运用质谱技术检测LBP含量。本发明比现有市售的LBP试剂盒灵敏度检出率高10％，可对应其他方法检测肝病、肾病指标，确定LBP的人体检测标准值。
下面结合具体实施例、分析对本发明的应用作进一步描述。
1.材料、实验动物与试剂：
清洁级SD雄性大鼠(体质量200～250g，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0006)上海杰思捷实验动物有限公司。FITC美国Sigma公司；单糖标准品为分析纯。
1.2仪器与设备
L-550离心机湖南离心机仪器有限公司；电子分析天平瑞士MettlerToledo公司；MithrasLB940多功能酶标仪德国Berthold公司。
1.3方法
1.3.1多糖的提取与荧光标记：
本发明的LBP采用膜分离技术提取，Sevag法脱蛋白，纯化得到的多糖。紫外和红外光谱分析证明LBP是一种与蛋白结合的复合多糖，存在β-D型吡喃糖和α-异构体吡喃糖。离子色谱分析发现LBP中单糖含量最高的是葡萄糖，其次是阿拉伯糖和半乳糖。LBP荧光标记参照文献报道，主要过程为将制备的LBP溶于水中，0.5mol/mLNaHCO3溶液调节pH值至8.0，加入FITC，室温避光搅拌反应24h。反应结束后，将反应液采用中速定性滤纸过滤，向滤液中加入无水乙醇至乙醇终体积分数为80％。
沉淀析出，离心弃去上清液。沉淀加水复溶，无水乙醇再沉淀，反复3次。再将沉淀用无水乙醇反复洗涤，直至上清液无荧光吸收后，冻干沉淀得LBP-FITC。1.3.2实验动物体质量200～250gSD雄性大鼠饲养于东南大学公共卫生学院动物实验室，期间提供标准动物饲料，自由饮水进食。符合卫生部颁布的《卫生部医学实验动物管理实施细则》和《实验动物管理条例》的规定。
1.3.3实验设计
1.3.3.1LBP-FITC在大鼠血浆中的定量分析方法发明参考其他方法对血浆中LBP-FITC进行定量分析。LBP-FITC标准贮备液的配制：精确称取LBP-FITC样品100mg，置于100mL容量瓶中，加入磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，配制成1mg/mL的LBP-FITC标准贮备液，于4℃条件下保存。
LBP-FITC标准系列溶液的配制：临用时精密量取贮备液适量，用磷酸盐缓冲溶液配制成质量浓度0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50μg/mL的LBP-FITC标准系列溶液。
1.3.3.2实验动物处理
实验前大鼠自由摄食和饮水，在适应环境3d后进行实验。通过股动脉取血，血样放入EDTA处理过的管中，在4℃、3000r/min离心10min，取上清液获得空白血浆，置于EP管中可立即使用或置于－70℃冰箱中
保存备用。
1.3.3.3样品测定LBP-FITC的测定采用多功能酶标仪，在荧光激发波长495nm、发射波长520nm条件下测定其荧光强度。取大鼠血浆150μL至黑色酶标板中测定荧光强度。
1.3.3.4标准曲线的绘制
取大鼠空白血浆120μL，精密加入30μL不同质量浓度的LBP-FITC标准系列溶液，配制成相当于质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg/mL的血浆样品，同时制备同体积的磷酸缓冲液代替LBP-FITC标准溶液用以测定空白血浆样品，之后按照1.3.3.3节操作。以血浆中待测样品LBP-FITC的质量浓度为横坐标，测定的荧光强度扣除空白血浆的荧光强度为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得的直线回归方程即为标准曲线。
1.3.3.5方法的精密度考察
取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低(0.1μg/mL)、中(1μg/mL)、高(10μg/mL)3个质量浓度的质量控制(qualitycontrol，QC)样品，每一质量浓度进行5样本分析。按照1.3.3.3节操作，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，与配制的质量浓度进行对照求得方法的精密度。在同一天内重复测定5次，连续测定5d，以计算日内和日间相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)。
1.3.3.6方法的回收率考察
取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低(0.1μg/mL)、中(1μg/mL)、高(10μg/mL)3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行5样本分析。按照1.3.3.3节操作，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，与配制的质量浓度对照求得方法的回收率。相对回收率的计算见以下公式：
1.3.3.7方法的稳定性考察
取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低(0.1μg/mL)、中(1μg/mL)、高(10μg/mL)3个质量浓度的QC样品，反复冻融3次(－20～25℃)，每一质量浓度进行5样本分析，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，计算RSD，考察样品在反复冻融3次后的稳定性。
另取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低(0.1μg/mL)、中(1μg/mL)、高(10μg/mL)3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行5样本分析，于室温(25℃)条件下放置24h，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，计算RSD，考察样品在室温(25℃)情况下放置24h后的稳定性。取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低(0.1μg/mL)、中(1μg/mL)、高(10μg/mL)3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行5样本分析，于－20℃条件下贮存15d后取样，迅速融化，按照1.3.3.3节操作，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，计算RSD，考察样品在－20℃冷冻条件下贮存半个月后的稳定性。
1.3.3.8单次口服LBP-FITC的大鼠代谢动力学发明
健康雄性SD大鼠(200～250g)6只，在适应环境3d后进行实验。给药前禁食12h，自由饮水，经口服灌胃给予LBP-FITC，给药剂量200mg/kg(以体质量计)，给药容量1mL/100g。分别于灌胃给药前及给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48h尾静脉取血0.5mL。将血样采集到抗凝离心管中，3000r/min离心10min，取上清液得到血浆，按1.3.3.3节条件测定荧光强度。
1.4数据处理
利用药代动力学WinNonlin软件，采用非房室模型拟合大鼠单次口服LBP-FITC的经时血药质量浓度数据，最大峰质量浓度(Cmax)及达峰时间(tmax)为实测值；药时曲线下面积(areaunderthecurve，AUC)、半衰期(t1/2)、总清除率(clearance，CL)、表观分布容积(Vd)、平均滞留时间(meanresidencetime，MRT)等用统计矩参数。AUC反映药物进入血循环的总量；t1/2表示药物在体内分布达到平衡后，血浆药物质量浓度消除一半所需的时间，是表达药物在体内消除快慢的重要参数；CL表示单位时间内有多少分布容积中的药物被清除，是估算药物从体内消除速度的参数；MRT是指药物分子滞留在体内的平均时间；Vd值表征药物在体内被组织摄取的能力，表观容积大的药物体内存留时间较长。
2.血药质量浓度标准曲线
2.1所得线性回归方程为y＝1378.7x－14.98(R2＝0.9989)，血浆中LBP-FITC质量浓度在0.05～10μg/mL范围内与荧光强度线性关系良好，线性方程满足代谢动力学的发明要求。
2.2血浆精密度
大鼠血浆中LBP-FITC质量浓度为0.1μg/mL的5个样品日内RSD分别为5.28％、6.90％、3.17％、4.68％、4.90％，日间RSD为4.15％；质量浓度为1μg/mL的日内RSD分别为6.41％、5.01％、4.91％、2.67％、5.39％；日间RSD为3.13％；质量浓度为10μg/mL的日内RSD分别为3.86％、2.24％、3.28％、2.48％、1.97％，日间RSD为2.62％。组内和组间的RSD都较小，证明该方法具有较好的精密度。
回收率在93.37％～95.72％之间，RSD分别为3.44％～4.62％，表明该方法具有良好回收率。血浆稳定性样品在室温放置24h、反复冻融3次和冻存15d后的稳定性测定结果见表4，显示RSD均较小，不大于5％，故含药血浆在室温条件下存放24h、反复冻融3次以及－20℃条件下贮存15d的稳定性均良好。
大鼠单次灌胃给予200mg/kgLBP-FITC后，以测定的血浆药物质量浓度对所对应的采血点作图，获得血药质量浓度-时间曲线图。结果发现在灌胃后0.5h就可在大鼠血浆中检测出一定的荧光强度，表明0.5h时LBP已吸收进入血液，1～2h达到吸收高峰，之后随着时间的延长血药质量浓度逐渐减少，且速率逐渐减缓，直至48h时仍能在血浆中测到荧光强度。
2.3大鼠单次口服LBP-FITC的血浆药代动力学参数
利用药代动力学WinNonlin软件，采用非房室模型拟合大鼠单次口服LBP-FITC的经时血药质量浓度数据，计算得到主要药代动力学参数；
6只动物的最大血药质量浓度Cmax为(2.39±0.71)μg/mL；最大峰时间tmax为(1.17±0.41)h；AUC0-t为(45.85±7.12)(μg·h)/mL；AUC0-∞为(127.31±39.00)(μg·h)/mL；t1/2为(80.32±32.70)h；CL为(1693.96±492.47)mL/kg；MRT为(20.64±1.36)h。本发明中Cmax和t1/2值可说明LBP-FITC在大鼠体内的吸收迅速，但是消除缓慢，这可能与其高分子的性质有关。
本发明采用荧光酶标仪测定血浆中的LBP-FITC的荧光强度以计算其中的药物质量浓度。相比较于荧光分光光度计，荧光酶标仪检测方法对生物样品需求量少，仅需100～200μL即可进行测定，节省生物样品，且可同时测定多个样品，操作方便。
由于多糖没有准确灵敏的检测方法，所以与药效学相比，LBP等多糖类的代谢动力学发明鲜未报道。本发明利用已建立的检测方法对大鼠单次口服LBP-FITC后的血浆代谢动力学进行初步发明。结果发现，在大鼠灌胃给予LBP-FITC后0.5h就可在血浆中的检测出一定的荧光强度，说明LBP在大鼠体内吸收较快。1～2h达到吸收最大峰，之后随着时间的延长血药质量浓度逐渐减少，直至48h时仍能在血浆中测到荧光强度。本实验建立了一种准确、灵敏且快速简便的测定大鼠血浆中LBP-FITC的荧光检测法，并应用该方法对大鼠单次口服LBP-FITC的大鼠代谢动力学展开了发明，可为以后多糖的功效机制发明提供良好的依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法，其特征在于，所述LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法，包括：
利用药代动力学WinNonlin软件，采用非房室模型拟合大鼠单次口服LBP-FITC的经时血药质量浓度数据，最大峰质量浓度Cmax及达峰时间tmax为实测值；药时曲线下面积AUC、半衰期t1/2、总清除率CL、表观分布容积Vd、平均滞留时间MRT用统计矩参数；AUC反映药物进入血循环的总量；t1/2表示药物在体内分布达到平衡后，血浆药物质量浓度消除一半所需的时间，是表达药物在体内消除快慢的重要参数；CL表示单位时间内有多少分布容积中的药物被清除，是估算药物从体内消除速度的参数；MRT是指药物分子滞留在体内的平均时间；Vd值表征药物在体内被组织摄取的能力，表观容积大的药物体内存留时间较长；
血药质量浓度标准曲线的线性回归方程为y＝1378.7x－14.98(R2＝0.9989)。
2.如权利要求1所述的LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法，其特征在于，血浆中LBP-FITC质量浓度0.05～10μg/mL。
3.一种如权利要求1所述LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法的LBP的质谱试剂盒LBP含量检测系统，其特征在于，所述质谱试剂盒LBP含量检测系统包括：
LBP-FITC标准贮备液配制设备：用于称取LBP-FITC样品，置于容量瓶中，加入磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，配制成LBP-FITC标准贮备液，于4℃条件下保存；
LBP-FITC标准系列溶液配制设备：临用时精密量取贮备液适量，用磷酸盐缓冲溶液配制成质量浓度0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50μg/mL的LBP-FITC标准系列溶液。
4.一种验证权利要求1所述BP的质谱试剂盒LBP含量检测方法检测效果的动物模型构建方法，其特征在于，所述动物模型构建方法包括：
1)实验前质量200～250gSD雄性大鼠自由摄食和饮水，在适应环境3d后进行实验；血样放入EDTA处理过的管中，在4℃、3000r/min离心10min，取上清液获得空白血浆，置于EP管中可立即使用或置于－70℃冰箱中保存备用；
2)样品测定LBP-FITC的测定采用多功能酶标仪，在荧光激发波长495nm、发射波长520nm条件下测定荧光强度；取大鼠血浆150μL至黑色酶标板中测定荧光强度；
3)标准曲线的绘制：
取大鼠空白血浆120μL，精密加入30μL不同质量浓度的LBP-FITC标准系列溶液，配制成相当于质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg/mL的血浆样品，同时制备同体积的磷酸缓冲液代替LBP-FITC标准溶液用以测定空白血浆样品；以血浆中待测样品LBP-FITC的质量浓度为横坐标，测定的荧光强度扣除空白血浆的荧光强度为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得的直线回归方程即为标准曲线。
5.如权利要求4所述的动物模型构建方法，其特征在于，实验前需进行：多糖的提取与荧光标记：
采用膜分离技术提取，Sevag法脱蛋白，纯化得到多糖；将制备的LBP溶于水中，0.5mol/mLNaHCO3溶液调节pH值至8.0，加入FITC，室温避光搅拌反应24h；反应结束后，将反应液采用中速定性滤纸过滤，向滤液中加入无水乙醇至乙醇终体积分数为80％；
沉淀析出，离心弃去上清液；沉淀加水复溶，无水乙醇再沉淀，反复3次；再将沉淀用无水乙醇反复洗涤，直至上清液无荧光吸收后，冻干沉淀得LBP-FITC。
6.如权利要求3所述的动物模型构建方法，其特征在于，标准曲线的绘制后需进行：精密度分析：取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低0.1μg/mL、中1μg/mL、高10μg/mL3个质量浓度的质量控制QC样品，每一质量浓度进行5样本分析；将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，与配制的质量浓度进行对照求得方法的精密度；在同一天内重复测定5次，连续测定5d，以计算日内和日间相对标准偏差RSD。
7.如权利要求3所述的动物模型构建方法，其特征在于，标准曲线的绘制后需进行：回收率分析：取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低(0.1μg/mL)、中(1μg/mL)、高(10μg/mL)3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行5样本分析；每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，与配制的质量浓度对照求得方法的回收率；相对回收率的计算见以下公式：
8.如权利要求3所述的动物模型构建方法，其特征在于，标准曲线的绘制后需进行：稳定性分析：取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低0.1μg/mL、中1μg/mL、高10μg/mL3个质量浓度的QC样品，－20～25℃反复冻融3次，每一质量浓度进行5样本分析，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，计算RSD；
另取大鼠空白血浆120μL，精密加入不同质量浓度LBP-FITC标准溶液，分别制备低0.1μg/mL、中1μg/mL、高10μg/mL3个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行5样本分析，于室温25℃条件下放置24h，每个样品测定5次，将扣除空白血浆荧光强度后的值代入当天相应的标准曲线，分别计算QC样品测得的质量浓度，计算RSD。
9.如权利要求3所述的动物模型构建方法，其特征在于，标准曲线的绘制后需进行：单次口服LBP-FITC的大鼠代谢动力学分析：
健康雄性SD大鼠200～250g6只，在适应环境3d后进行实验；给药前禁食12h，自由饮水，经口服灌胃给予LBP-FITC，给药剂量200mg/kg，给药容量1mL/100g；分别于灌胃给药前及给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48h尾静脉取血0.5mL；将血样采集到抗凝离心管中，3000r/min离心10min，取上清液得到血浆，测定荧光强度。
10.一种利用权利要求1所述LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法的肾病LBP的质谱试剂盒。
11.一种利用权利要求1所述LBP的质谱试剂盒LBP含量检测方法的肝病LBP的质谱试剂盒。
CN201811496506.0A 2018-12-07 2018-12-07 一种lbp的质谱试剂盒lbp含量检测系统及方法 Pending CN109596817A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811496506.0A CN109596817A (zh) 2018-12-07 2018-12-07 一种lbp的质谱试剂盒lbp含量检测系统及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811496506.0A CN109596817A (zh) 2018-12-07 2018-12-07 一种lbp的质谱试剂盒lbp含量检测系统及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109596817A true CN109596817A (zh) 2019-04-09

Family

ID=65961509

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811496506.0A Pending CN109596817A (zh) 2018-12-07 2018-12-07 一种lbp的质谱试剂盒lbp含量检测系统及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109596817A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112730822A (zh) * 2020-12-21 2021-04-30 浙江九旭药业有限公司 一种血浆中银杏酮酯制剂有效成分的检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080318322A1 (en) * 2006-01-27 2008-12-25 Fatemeh Akhlaghi Analysis of mycophenolic acid in saliva using liquid chromatography tandem mass spectrometry
CN102662022A (zh) * 2012-05-10 2012-09-12 云南昊邦制药有限公司 大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法
CN102680620A (zh) * 2011-03-16 2012-09-19 复旦大学 一种定量检测血浆中益母草碱含量的方法
CN105535998A (zh) * 2016-02-04 2016-05-04 上海中华药业有限公司 龙虎人丹的中暑模型的构建方法
CN108362807A (zh) * 2018-01-15 2018-08-03 嘉兴学院 一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080318322A1 (en) * 2006-01-27 2008-12-25 Fatemeh Akhlaghi Analysis of mycophenolic acid in saliva using liquid chromatography tandem mass spectrometry
CN102680620A (zh) * 2011-03-16 2012-09-19 复旦大学 一种定量检测血浆中益母草碱含量的方法
CN102662022A (zh) * 2012-05-10 2012-09-12 云南昊邦制药有限公司 大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法
CN105535998A (zh) * 2016-02-04 2016-05-04 上海中华药业有限公司 龙虎人丹的中暑模型的构建方法
CN108362807A (zh) * 2018-01-15 2018-08-03 嘉兴学院 一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HSIAO-CHING NIEN等: "High Serum Lipopolysaccharide-Binding Protein Level in Chronic Hepatitis C Viral Infection Is Reduced by Anti-Viral Treatments", 《PLOS ONE》 *
覃光炯等: "同步荧光法测定大鼠血浆中牛血清白蛋白的研究", 《影像科学与光化学》 *
陈忱等: "大鼠血浆中枸杞多糖荧光标记物定量分析方法的建立", 《食品科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112730822A (zh) * 2020-12-21 2021-04-30 浙江九旭药业有限公司 一种血浆中银杏酮酯制剂有效成分的检测方法
CN112730822B (zh) * 2020-12-21 2024-01-30 浙江上药九旭药业有限公司 一种血浆中银杏酮酯制剂有效成分的检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Penington et al. Megakaryocytes in states of altered platelet production: cell numbers, size and DNA content
Friedman et al. Cellular calcium transport in renal epithelia: measurement, mechanisms, and regulation
Badin et al. Plasma polysaccharide fraction containing uronic acid, in normal subjects and in patients with rheumatoid arthritis
CN103760121A (zh) 一种血液中亚硝酸盐的检测方法
CN111983244A (zh) 一种干血斑中四种维生素的检测方法及检测试剂盒
CN107102021A (zh) 一种海马1h‑nmr指纹图谱的构建方法和用途
CN109596817A (zh) 一种lbp的质谱试剂盒lbp含量检测系统及方法
Cox et al. Measurement of small intestinal permeability markers, lactulose, and mannitol in serum (results in celiac disease)
CN108362807A (zh) 一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用
US6884223B2 (en) Method for detecting α-oxoaldehydes in the whole blood, blood plasma and/or serum of a patient
CN107037152B (zh) 一种明胶胶囊中胭脂红酸含量的检测方法
US6995019B2 (en) Fluorescent isothiocyanate (fitc) sinistrin, its production and use
Allan et al. A sex difference in the leucocyte count
CN107703080A (zh) 一种蒲公英提取物总黄酮含量的测定方法
CN104931519A (zh) 一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法
CN106645748A (zh) 一种异常黏液质型阳痿病证哺乳动物血清和阴茎平滑肌组织差异蛋白体系及筛选方法与应用
CN101408519A (zh) 一种检测盐酸西布曲明的方法及其应用
CN113960302B (zh) 一种基于高内涵技术的肾毒性检测方法及其应用
CN107782808A (zh) 确定骨化三醇软胶囊溶出度的方法和系统
CN109738544A (zh) 一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测及验证方法
Mellblom et al. Protein content, dry mass and chemical composition of individual mast cells related to body growth
CN103698280A (zh) 用固定液固定兼萃取生物组织从而推断其死亡时间的方法
RU2655775C1 (ru) Способ количественного определения ацикловира
CN110702809A (zh) 一种基于抗肝纤维化生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价方法
JP3849945B2 (ja) 血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20190524

Address after: 518000 Huitong Building, No. 10 Longgang Road, Pingnan Community, Longgang Street, Longgang District, Shenzhen City, Guangdong Province, 805

Applicant after: Shenzhen Bogang Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: Floor 1-2, Building No. 2, 500 Lane, Furong Hualu, Pudong New Area, Shanghai, 200120

Applicant before: SHANGHAI HAOGANG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190409