CN104931519A - 一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种注射用丹参多酚酸中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇的含量检测方法，基于核磁共振法(¹H-NMR)对注射用丹参多酚酸中的主要成分及辅料同时进行含量测定。该方法具有简便易行、稳定性好、精密度高、重现性好、专属性强等特点，在全面检测注射用丹参多酚酸质量方面具有广阔的应用前景。

Description

一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法

技术领域

本发明涉及一种药物含量检测方法，尤其是一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法。

背景技术

注射用丹参多酚酸是近几年开发的一种新型冻干粉针剂，主要组方为丹参多酚酸，其配方和制备方法：丹参多酚酸加入甘露醇等辅料和注射用水，经活性炭除热原、微孔滤膜过滤，再冷冻干燥而得，具有活血、化瘀、通脉之功，用于冠心病稳定型心绞痛，分级为I、II级，心绞痛症状表现为轻、中度，中医辨证为心血瘀阻证者，症见胸痛、胸闷、心悸。

围绕注射用丹参多酚酸质量控制的研究很多，测定其主要有效成分酚酸主要采用C18色谱柱，由于甘露醇是一种六元醇极性化合物，不能采用常规的C18柱进行检测，所以同时对制剂中主要有效成分和辅料的分析尚未见报道。

甘露醇为注射用丹参多酚酸的辅料，目前报道的甘露醇的测定方法有碘量法、紫外-可见分光光度法、HPLC-RID和HPLC-ELSD 法等。碘量法与紫外－可见分光光度法需要经过化学反应，操作繁琐，难以直接测定甘露醇含量。HPLC-RID法示差折光检测器灵敏度低，易受外界影响。HPLC-ELSD法较好，而甘露醇对色谱柱要求较高，C18柱对甘露醇不能检测，普通色谱柱难以同时对其多酚酸及辅料甘露醇测定。且色谱法存在不同待测组分在检测器上响应差异的问题，NMR是一种无偏向性的检测方法，可以解决这一问题。

定量质子核磁共振(quantitative proton nuclear magnetic resonance,q¹H-NMR)因其独特的优势而获得越来越多的关注，广泛应用于药物、食品、农业等领域，且我国2010版药典将q¹H-NMR收载在附录中。q¹H-NMR用于药物分析的最大优势在于可同时提供化合物结构确证的定性信息和含量测定的定量信息。与HPLC方法相比，核磁共振法具有样品前处理简单、谱图直观、耗时短等优点，能准确地检测出制剂中的有效成分和辅料，为中药注射剂含量测定提供了一种新的手段。

中药注射剂在制备工艺上往往需要使用一些辅料，例如助溶剂、抗氧剂、pH调节剂、等渗调节剂、膨松剂等。近年来中药注射剂安全问题层出不穷，辅料的安全问题日益受到关注。本发明同时对注射用丹参多酚酸中的有效成分和辅料进行定性定量分析，对保证制剂安全有效具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法，该方法可以同时对丹参多酚酸注射液中的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇的含量进行检测。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法，基于核磁共振法(¹H-NMR)对注射用丹参多酚酸中的多种成分同时进行含量测定，具体步骤为：

(1)内标溶液的配制

称取K₂HPO₄、NaH₂PO₄与内标物TSP(3-三甲基硅基丙酸钠-d₄)于容量瓶中，用D₂O(重水)溶解并定容至刻度线，用于所有实验溶剂；

(2)对照品溶液的制备

分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇对照品，并分别制成相应的对照品储备液；

(3)供试品溶液的制备

精密称取注射用丹参多酚酸冻干粉并加入上述内标溶液中溶解，其中，每20mg丹参多酚酸冻干粉加入1ml内标溶液，得供试品溶液，将所述供试品溶液可转移至5mm核磁管中，直接用于¹H- NMR测试；

(4)¹H-NMR指纹图谱的测定

将核磁管置于核磁共振仪中，采用水峰抑制脉冲序列测定注射用丹参多酚酸样品溶液的¹H-NMR指纹图谱和对照品溶液的¹H-NMR图谱，所有的一维¹H-NMR谱均在298K下采集，脉冲序列zgcppr抑制水峰，谱宽设置为12335.5Hz，弛豫延迟时间为20s确保所有信号完全弛豫，采样点数32k，扫描次数：16次；

为对其信号进行归属，测定指定样品的2D NMR谱，包括：¹H- ¹H COSY,¹H-¹H TOCSY,¹H-¹³C HSQC和¹H-¹³C HMBC谱；

(5)样品¹H-NMR图谱分析

依据NMR谱及文献数据，鉴定迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、甘露醇，采用MetresNova软件对得到的¹H-NMR指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标，并对其信号进行归属；

(6)¹H-NMR多成分的含量测定

在上述实验条件下采集图谱，对迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸和甘露醇以及内标物TSP的定量峰分别进行积分，按照1H-NMR内标法根据积分结果依照下式计算样品的质量：

$\frac{A_{\mathrm{TSP}}}{A_S}=\frac{n_{\mathrm{TSP}}{W}_{\mathrm{TSP}}/M_{\mathrm{TSP}}}{n_S{W}_S/M_S}$

其中，A_TSP和A_S分别是TSP甲基峰和化合物定量峰的积分面 积，n_TSP和n_S分别代表TSP甲基峰和化合物定量峰的质子个数，W_TSP和W_S分别是TSP和化合物的质量，M_TSP和M_S分别是TSP和化合物的分子量。

优选的，上述丹参多酚酸注射液的含量检测方法，所述步骤(1)中所述内标溶液中含有1.5M K₂HPO₄、1.5M NaH₂PO₄、0.2mg/ml TSP。(例如，精密称取K₂HPO₄3.4836g、NaH₂PO₄2.4001g与内标物TSP(3-三甲基硅基丙酸钠-d₄)20mg于100ml容量瓶中)。

优选的，上述丹参多酚酸注射液的含量检测方法，所述步骤(2)中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇对照品分别制成相应的对照品溶液，方法如下：分别加所述内标溶液制成质量浓度为1.685、1.235、16.21、12.54mg/ml的混合溶液，作为对照品储备液。

优选的，上述丹参多酚酸注射液的含量检测方法，所述步骤(5)中迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、甘露醇的信号进行归属如下表1。

表1

本发明的有益效果是：

上述注射用丹参多酚酸的含量检测方法，由于供试品均为水溶性成分，故选择重水为溶剂；实验发现溶液pH值对NMR图谱有影响，故配制成一定磷酸盐缓冲液，可以稳定pH值；将制剂样品溶解于重水磷酸盐缓冲液中，不加其它任何处理，直接用于NMR测试，操作简便，而且可以最大程度反映注射剂的真实组成。

本发明所述方法可以有效解决丹参多酚酸及赋形剂甘露醇等成分的定量分析问题，上述方法具有简便易行、稳定性好、精密度高、重现性好、专属性强等特点，在全面检测注射用丹参多酚酸质量方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为注射用丹参多酚酸样品的一维¹H NMR谱,δ2.5-4.3和δ5.7-7.7部分分别放大2倍、8倍，其中1是丹酚酸B，2是紫草酸，3是甘露醇，4是迷迭香酸；

图2为4种成分迷迭香酸(A)，紫草酸(B)，丹酚酸B(C)，甘露醇(D)用于含量测定的定量峰图谱。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

注射用丹参多酚酸¹H-NMR标准指纹图谱的建立

1.1 仪器与试药 

BRUKER AVANCEⅢ600型超导核磁共振波谱仪，质子激发频率600.23MHz，配置BBFO正相观察宽带探头。5mm标准核磁样品管(美国NORELL公司)。METTLER TOLEDO XP6天平(瑞士METTLER公司)。

D₂O(氘代度>99.8％，美国NORELL公司)；3-(三甲基甲硅烷)丙酸-d₄钠盐(TSP，氘代度>98％，美国Sigma-Aldrich公司)；迷迭香酸(批号w10-5-3)、紫草酸(批号w14-8-0)、丹酚酸B(批号w15-5-7)标准品均购自天津中新药业集团股份有限公司，纯度经HPLC检测均 大于98％，甘露醇标准品(批号1120B032)购自索莱宝科技有限公司，纯度大于96％。

1.2 注射用丹参多酚酸供试品溶液的制备

注射用丹参多酚酸冻干粉精密称取20mg，加入1ml内标溶液，转移至5mm核磁管中，直接用于¹H-NMR测试。

1.3 ¹H-NMR指纹图谱的测定

将核磁管置于核磁共振仪中，采用水峰抑制脉冲序列测定注射用丹参多酚酸样品溶液的¹H-NMR指纹图谱和对照品溶液的¹H-NMR图谱，所有的一维¹H-NMR谱均在298K下采集，脉冲序列zgcppr抑制水峰，谱宽设置为12335.5Hz，弛豫延迟时间为20s确保所有信号完全弛豫，采样点数32k，扫描次数：16次。

为对其信号进行归属，测定指定样品的2D NMR谱，包括：¹H- ¹H COSY,¹H-¹H TOCSY,¹H-¹³C HSQC和¹H-¹³C HMBC谱。

1.4 样品¹H-NMR图谱分析

采用MetresNova软件对得到的¹H-NMR指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、化学位移校正，根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，结合丹红注射液对照样品的二维核磁图谱信息和标准品溶液的¹H-NMR图谱鉴定出丹酚酸B，紫草酸，甘露醇，迷迭香酸(图1)。通过核磁共振一维谱和二维谱对目标化合物的信号进 行了全归属，结果显示迷迭香酸8-H(6.16,d,16.2Hz)、紫草酸H-8'(4.21,d,5.4Hz)、丹酚酸BH-8'(4.08,d,5.4Hz)信号峰与其它信号峰分离良好，被选为定量峰(图2)。

甘露醇则选择3.88～3.9(2H)作为定量峰。在¹H-NMR谱中，糖类的端基质子一般在δ4.3～5.9之间，而在注射用丹参多酚酸病并没有发现，且通过信号归属，甘露醇各部分积分面积与其质子数成正比，提示甘露醇信号峰没有收到其它信号干扰。

1.5 方法学考察 

线性关系考察：精密移取对照品储备液适量于量瓶中，用内标溶液稀释并定容，配置系列质量浓度的混合对照品溶液，分别取适量装入NMR管中,按“1.3”项下条件采集图谱，以对照品质量浓度(mg/ml)为横坐标(X)，定量峰与内标物峰积分面积之比为纵坐标(Y)进行线性回归。

精密度试验取供试品溶液，按“2.2”项下条件连条件连续测定6次，记录积分面积，计算样品定量峰与内标积分面积比值的RSD值。

精密度试验：取供试品溶液，按上述¹H-NMR测试条件下连续测定6次，记录积分面积，计算RSD值。

重复性试验：取样品适量，共6份，精密称定，按“1.2”项下 方法制备供试品溶液，按上述¹H-NMR测试条件进行测定，记录积分面积，计算RSD值。

稳定性试验：取同一供试品溶液分别在0，2，4，8，12，18，24h进样测定，记录积分面积，计算RSD值。

加样回收率试验：取样品适量，共6份，精密称定，分别精密加入各标准品适量，计算回收率。

线性回归方程分别为迷迭香酸Y＝2.8685X-0.0746，R2＝0.9993；紫草酸Y＝4.6127X-0.0437，R2＝0.9994；丹酚酸BY＝6.0685X-0.2835，R2＝0.9997；甘露醇Y＝0.5352X-0.0772，R2＝0.9995。结果表明，迷迭香酸在1.685～0.105mg/ml，紫草酸在1.235～0.077mg/ml，丹酚酸B在16.21～1.013mg/ml，甘露醇在12.54～0.784mg/ml范围内，与定量质子峰面积线性关系良好。

实验结果见下表2。

表2 定量核磁法方法学考察

1.6 定量核磁法测定不同批号注射用丹参多酚酸中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇的含量

取样品适量，精密称定，按照“1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3”项下条件进行测定。记录样品NMR图谱，计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定(％,n＝3)

上述参照具体实施方式对该一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法，其特征在于：基于核磁共振法(¹H-NMR)对注射用丹参多酚酸中的多种成分同时进行含量测定，具体步骤为：

(1)内标溶液的配制

称取K₂HPO₄、NaH₂PO₄与内标物TSP于容量瓶中，用D₂O(重水)溶解并定容至刻度线，用于所有实验溶剂；

(2)对照品溶液的制备

分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇对照品，分别制成相应的对照品储备液；

(3)供试品溶液的制备

精密称取注射用丹参多酚酸冻干粉并加入上述内标溶液中溶解，其中，每20mg丹参多酚酸冻干粉加入1ml内标溶液，得供试品溶液，将所述供试品溶液可转移至5mm核磁管中，直接用于¹H-NMR测试；

(4)¹H-NMR指纹图谱的测定

将核磁管置于核磁共振仪中，采用水峰抑制脉冲序列测定注射用丹参多酚酸样品溶液的¹H-NMR指纹图谱和对照品溶液的¹H- NMR图谱，所有的一维¹H-NMR谱均在298K下采集，脉冲序列zgcppr抑制水峰，谱宽设置为12335.5Hz，弛豫延迟时间为20s确保所有信号完全弛豫，采样点数32k，扫描次数：16次；

为对其信号进行归属，测定指定样品的2D NMR谱，包括：¹H- ¹H COSY,¹H-¹H TOCSY,¹H-¹³C HSQC和¹H-¹³C HMBC谱；

(5)样品¹H-NMR图谱分析

依据NMR谱及文献数据，鉴定迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、甘露醇，采用MetresNova软件对得到的¹H-NMR指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标，并对其信号进行归属；

(6)¹H-NMR多成分的含量测定

在上述实验条件下采集图谱，对迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸和甘露醇以及内标物TSP的定量峰分别进行积分，按照¹H-NMR内标法根据积分结果依照下式计算样品的质量：

其中，A_TSP和A_S分别是TSP甲基峰和化合物定量峰的积分面积，n_TSP和n_S分别代表TSP甲基峰和化合物定量峰的质子个数，W_TSP和W_S分别是TSP和化合物的质量，M_TSP和M_S分别是TSP和化合物的分子量。

2.根据权利要求1所述的丹参多酚酸注射液的含量检测方法， 其特征在于：所述步骤(1)中所述内标溶液中含有1.5M K₂HPO₄、1.5M NaH₂PO₄、0.2mg/ml TSP。

3.根据权利要求1所述的丹参多酚酸注射液的含量检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇对照品分别制成相应的对照品溶液，方法如下：分别加所述内标溶液制成质量浓度为1.685、1.235、16.21、12.54mg/ml的混合溶液，作为对照品储备液。

4.根据权利要求1所述的丹参多酚酸注射液的含量检测方法，其特征在于：所述步骤(5)中迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、甘露醇的信号进行归属如下：

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