CN103674996A - 一种鉴别丹参药材或衍生品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴别丹参药材或衍生品的方法，包括：1）对丹参药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的丹参酮特征提取物和丹酚酸特征提取物；2）对所述丹参酮或丹酚酸特征提取物均进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；3）通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；4）利用所述特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出丹参药材或衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量。本发明可以反映丹参中含有哪些丹参酮类和丹酚酸类化合物以及它们之间的比例，达到对丹参药材品种或衍生品质量鉴定的目的。

Description

一种鉴别丹参药材或衍生品的方法

技术领域

本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别丹参药材或衍生品的方法。

背景技术

丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）是唇形科鼠尾草属植物丹参的干燥根及根茎，是我国常用传统中药之一。丹参归心、肝经，药性微寒，味苦、无毒，具有祛癖止痛、活血调经、养心除烦的功效。其活性成分可分为脂溶性成分和水溶性成分两部分。脂溶性成分主要为丹参酮类（主要是邻醌酮类、二萜醌类及其衍生物）化合物，具有扩张血管、改善微循环、抗菌消炎的作用。水溶性成分主要为丹酚酸类（多个丹参素和咖啡酸缩合体），为治疗心脑血管疾病的活性成分。由于丹参酮类与丹酚酸类两部分极性相差较大，所以两种成分综合提取困难，相同的方法难以兼顾，需分别提取。

定性鉴别上述两类成分或定量测定其某种活性成分含量，已成为评价丹参及其制剂质量的重要方法（例如中国药典2010版是对丹参药材中脂溶性成分丹参酮ⅡA和水溶性成分丹酚酸B进行定性和定量分析）；这种针对单一成分进行定性、定量分析的质量检测模式不能有效控制中药材或衍生品的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制丹参及其制剂质量的迫切要求。

指纹图谱是目前国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方式。人们凭借实用的指纹图谱不仅可确认该产品的真伪，同时能判断其稳定性。目前，丹参药材及其制剂的指纹图谱研究工作，集中为HPLC指纹图谱、毛细管电泳指纹图谱（HPCE法）、近红外光谱法（IR）、高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS）等。其中主流方法HPLC指纹图谱由于受非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）影响较大和需用标准品等等原因，重复性、和可行性均存在许多局限性；HPCE法虽以其高效、快速、简便且柱不易受污染而优于HPLC法，但仍存在重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低等不足；单一LC-MS分析方法由于中药复方的复杂性和缺乏标准品的现状，MS还有离子化程度和基质干扰等问题，通常不足以对多种成分进行准确的结构定性；IR采集过程中受环境变化影响较大且不易解析，重复性和可行性较差。

IGD核磁共振碳谱偶联（IGD¹³C NMR coupling）指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，该技术是在已研究多年的核磁共振氢谱（¹H NMR）指纹图谱技术[赵天增，等.¹HNMR指纹法鉴定植物中药，中草药2000，31(11)：868-870]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术[谢培山等，中药色谱指纹图谱，人民卫生出版社，2005]）提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。

丹参的品质不在于某个单一成分，其疗效是多个成分协同配比的结果。因此，建立不仅能控制丹参活性成分，而且能控制这些活性成分之比例的IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱势在必行。丹参药材或衍生品核磁共振碳谱偶联指纹图谱的研究与应用，不仅可以解决我国丹参药材鉴别和评价的难题，也为加强丹参药材或衍生品内在成分研究的系统化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材或衍生品中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明的目的是提供一种鉴别丹参药材或衍生品的方法。

为了实现上述目的，本发明提供的鉴别丹参药材或衍生品的方法，包括以下步骤：

1）对丹参药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的丹参酮特征提取物和丹酚酸特征提取物；

2）对所述丹参酮特征提取物和丹酚酸特征提取物均进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；

3）通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；

4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述绝对含量，计算出丹参药材或衍生品中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。

其中，步骤1）中，从丹参药材或饮片中提取丹参酮特征提取物的方法，包括：

取丹参药材或饮片粉碎，用6~10倍量90~95%（体积百分数）乙醇回流提取2~3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至粉末，即得丹参药材或饮片乙醇提取物；取上述丹参药材或饮片乙醇提取物回流提取或超声提取两遍，第一遍加入8~12倍量乙酸乙酯，70~80℃下回流提取或50~60℃下超声提取18~22min；离心，沉淀后，第二遍加入8~12倍量乙酸乙酯，50~60℃下回流提取或30~40℃下超声提取18~22min，上清液合并后减压浓缩，回收溶剂至干，即得丹参酮特征提取物（CET）。

进一步地，将丹参药材或饮片粉碎后，用6倍量95%乙醇回流提取。

进一步地，第一遍回流提取或超声提取的条件为：加入10倍量乙酸乙酯，75℃下回流提取或55℃下超声提取20min。

进一步地，第二遍回流提取或超声提取的条件为：加入10倍量乙酸乙酯，55℃下回流提取或35℃下超声提取20min。

其中，步骤1）中，从丹参药材或饮片中提取丹酚酸特征提取物的方法，包括：

取丹参药材或饮片粉碎，用6~10倍量75%~95%乙醇（体积百分数）回流提取2~3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至浸膏；取上述浸膏超声提取两遍，第一遍加入8~12倍量乙酸乙酯，50~60℃下超声提取2~3次，每次18~22min；离心，沉淀后，第二遍加入8~12倍量乙酸乙酯，40~50℃下超声提取18~22min；沉淀后，再加水8~20倍水回流2~3次，每次28~32min，取出，即得丹酚酸特征提取物（CES）。

进一步地，将丹参药材或饮片粉碎后，用6倍量90%~95%乙醇回流提取2~3次。

进一步地，第一遍超声提取的条件为：加入10倍量乙酸乙酯，55℃下超声提取2~3次，每次20min。

进一步地，第二遍超声提取的条件为：加入10倍量乙酸乙酯，45℃下超声提取20min。

进一步地，超声提取完毕，用水回流的条件为：加水8~20倍，溶解后回流2次，每次30min。

其中，步骤2）中，对丹参酮特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解丹参酮特征提取物的溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）、氘代丙酮（CD₃CO CD₃）或氘代二甲基亚砜（DMSO-d₆），优选CDCl₃；丹参酮特征提取物和相应溶剂的质量体积比为55:1~65:1（mg：mL），优选60:1。

其中，步骤2）中，对丹酚酸特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解丹酚酸特征提取物的溶剂为氘代甲醇（CD₃OD）、氘代丙酮（CD₃CO CD₃）或氘代二甲基亚砜（DMSO-d₆），优选CD₃OD；丹酚酸特征提取物和相应溶剂的质量体积比为55:1~65:1（mg：mL），优选60:1。

除丹参饮片外，其他丹参衍生品，如丹参酮提取物或丹酚酸提取物可直接作为丹参酮特征提取物（CET）或丹酚酸特征提取物（CES），用上述方法进行鉴别。

其中，步骤2）中，丹参酮特征提取物中的活性成分特征峰为C-2或C-18吸收峰，它们化学位移为δ_C 18.0~20.0。

进一步地，C-2吸收峰化学位移为δ_C 18.0~19.5；C-18吸收峰化学位移为δ_C 19.5~20.0。

其中，步骤2）中，丹酚酸特征提取物中的活性成分特征峰为C-9吸收峰。溶解丹酚酸特征提取物的溶剂为氘代甲醇，C-9吸收峰的化学位移为δ_C 167.5~169.0；溶解丹酚酸特征提取物的溶剂为代二甲基亚砜，C-9吸收峰的化学位移为δ_C 164.5~167.0。

其中，步骤2）中，所述峰强度可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。

其中，步骤3）中，所述定量分析手段为：高效液相（HPLC）法。

其中，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。

进一步地，丹参酮特征提取物中的活性成分的标准参照品为丹参酮IIA。

进一步地，丹酚酸特征提取物中的活性成分的标准参照品为丹酚酸B。

其中，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：

$W_n=\frac{W_1{M}_n{h}_n}{M_1{h}_1};$ 其中：

W₁为步骤3）用定量分析手段测定的丹参药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；

M₁为所述丹参药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量；

h₁为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的丹参药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；

W_n为丹参药材或衍生品中某一活性成分的质量百分含量；

M_n为丹参药材或衍生品中某一活性成分的分子量；

h_n为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的丹参药材或衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度；该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的W_n相加之和，即活性成分组的含量。

上述公式的推导过程为：

$\frac{W_1}{M_1}:\frac{W_n}{M_n}=\frac{h_1}{h_n}$

$\⇒\frac{W_1{M}_n}{M_1{W}_n}=\frac{h_1}{h_n}$

$\⇒W_1{M}_n{h}_n=M_1{W}_n{h}_1$

$\⇒W_n=\frac{W_1{M}_n{h}_n}{M_1{h}_1}$

本发明方法所述活性成分组，既可以是丹参单味药材中的活性成分组，也可是丹参衍生品中的活性成分组。所述丹参酮特征提取物指该提取物中含有丹参酮类活性成分，丹酚酸类特征提取物指该提取物中含有丹酚酸类活性成分，活性成分组即指相应同类活性成分的总和。

其中，所述丹参衍生品包括：丹参饮片、丹参提取物（如丹参酮提取物或丹酚酸提取物）或丹参天然药物。

本发明所述的丹参药材，包括丹参植物的各个部位，如根、皮、茎、叶、花和果实等。

本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD¹³C NMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：

①稳定性（重复性）：IGD¹³C NMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。

②整体性（全面性）：IGD¹³C NMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。

③可靠性（单一性）：IGD¹³C NMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。

④可行性（易辨性）：IGD¹³C NMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。

IGD核磁共振碳谱指纹图谱只能表明特征提取物中有哪些活性成分，以及这些活性成分之间的定量比例，而这些活性成分的绝对含量必须通过标准参照品和其他分析定量手段，再通过偶联公式而得到。

本发明对丹参酮特征提取物和丹酚酸特征提取物采用分别提取的方式，使得极性、活性成分差异较大的丹参酮（二萜醌）与丹酚酸两类成分分别得到有效富集及简化，可以准确反映丹参药材中主要活性成分及其比例。本发明采用IGD核磁共振碳谱指纹图谱对丹参药材进行鉴别，可以反映丹参药材或衍生品中含有哪些丹参酮类和丹酚酸类化合物以及它们之间的比例，达到对丹参药材品种和质量或衍生品质量鉴定的目的。线性范围宽，灵敏度高，重复性和可行性好。不仅能够有效控制丹参药材或衍生品的内在质量，也可以满足当前对于客观有效地评价和控制丹参或衍生品质量的迫切要求。总体来看，不仅可以解决我国丹参药材鉴别和评价的难题，也为加强丹参药材或衍生品内在成分研究的系统化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。

附图说明

图1-1-1-a为具体实施方式中提取方法1获得的河南洛阳丹参药材中丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

图1-1-1-b为具体实施方式中提取方法1获得的河南洛阳丹参药材中丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

图1-1-2-a为具体实施方式中提取方法2获得的河南洛阳丹参药材中丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

图1-1-2-b为具体实施方式中提取方法2获得的河南洛阳丹参药材中丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

图1-2-1-a为实施例1洛阳丹参药材丹酚酸特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

图1-2-1-b为实施例1洛阳丹参药材丹酚酸特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

图2-1-a为实施例2中原正信丹参药材丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

图2-1-b为实施例2中原正信丹参药材丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

图2-2-a为实施例2中原正信丹参药材丹酚酸特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

图2-2-b为实施例2中原正信丹参药材丹酚酸特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

图3-1-a为实施例3河南禺州丹参药材丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

图3-1-b为实施例3河南禺州丹参药材丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

图3-2-a为实施例3河南禺州丹参药材丹酚酸特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

图3-2-b为实施例3河南禺州丹参药材丹酚酸特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

图4-1-a为实施例4市售丹参酮提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

图4-1-b为实施例4市售丹参酮提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

图5-1-a为实施例5自制丹酚酸提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

图5-1-b为实施例5自制丹酚酸提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一、丹参药材或衍生品IGD核磁共振碳谱指纹图谱研究

（1）由丹参药材或衍生品提取得到的丹参酮特征提取物（CET）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）丹参酮特征提取物（CET）的获得

①从丹参药材中获得丹参酮特征提取物的最佳提取分离程序的选择（以河南洛阳丹参为例）

i）提取方法1

取阴干的丹参药材的根、皮，粉碎，用6倍量无水乙醇回流提取(×2)，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至粉末，即得丹参药材无水乙醇提取物。取上述粉末（丹参药材无水乙醇提取物）加入10倍量乙酸乙酯，75℃下回流或55℃下超声提取20min，离心，沉淀加入10倍量乙酸乙酯，55℃下回流或35℃下超声提取20min，上清液合并后减压浓缩，回收溶剂至干，即得丹参酮提取物1(CET1)。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-1-1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图1-1-1-b。

ii）提取方法2

取阴干的丹参药材的根、皮，粉碎，用6倍量95%乙醇回流提取(×2),滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至粉末，即得丹参药材95%乙醇提取物。取上述粉末（丹参药材95%乙醇提取物）加入10倍量乙酸乙酯，55℃下超声提取20min，离心，沉淀加入10倍量乙酸乙酯，35℃下超声提取20min，上清液合并后减压浓缩，回收溶剂至干，即得丹参酮提取物2(CET2)。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-1-2-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图1-1-2-b。

②丹参酮特征提取物的最佳提取分离程序的确定

上述河南洛阳丹参药材提取方法1和提取方法2的丹参酮提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，都显示丹参酮IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I和隐丹参酮等化合物的特征信号，但其活性成分比例不同。提取方法1所得丹参酮提取物丹参酮I含量小于二氢丹参酮I，与通常所测结果不符，可能是无水乙醇在工业生产中不常用的缘故。因此，选用提取方法2。选用提取方法2得到的提取物也叫丹参药材丹参酮特征提取物（CET）。

确定后的提取方法，将各条件数值进行微调，所得的提取物同样可以满足要求（发明内容已概括出范围），以上述给出的条件更优。

③丹参饮片丹参酮特征提取物最佳提取分离程序的确定

同丹参药材。

④其他丹参衍生品丹参酮特征提取物的确定

直接取其他丹参衍生品（除丹参饮片外的丹参衍生品，如丹参酮提取物）作为丹参酮特征提取物。

2）丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测

取丹参酮特征提取物30mg，溶于0.5mL CDCl₃中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得丹参酮IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

3）丹参酮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析

①鉴别

丹参酮特征提取物（CET）IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹参酮类（邻醌酮类、二萜醌类及其衍生物）化合物的特征信号，丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮和二氢丹参酮等均有相应的NMR信号。

②丹参酮特征提取物中的各活性成分特征峰选取

由于丹参酮特征提取物中含有一系列醌酮类化合物，碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大相应峰作为特征峰。为此，经实际考察，选择δ_C19.0~20.0左右一组C-2或C-18碳峰作为该类活性成分碳峰指定特征峰，其原因为C-2脂环碳或C-18甲基碳与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同化合物C-2或C-18碳峰之间化学位移也有一定差别。

③标准参照品的选择

丹参酮IIA是丹参酮特征提取物中脂溶性成分的主要活性成分之一，其C-2化学位移为δ_C 19.1，与其他主要脂溶性成分在此没有重叠；因此，选择丹参酮IIA作为标准参照品。

4）采用HPLC法测定丹参药材或衍生品中丹参酮IIA的含量

①丹参酮IIA含量测定

i）色谱条件（参照2010版药典）

流动相：甲醇：水=75：25；色谱柱：C18（250*4.6mm，5um）；

检测波长：270nm。

ii）丹参酮IIA标准参照品溶液的配制

精确称取丹参酮IIA 5mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得丹参酮IIA标准参照品溶液。

iii）含有丹参酮类活性成分的供试品溶液的制备

准确称取供试品：丹参药材95%乙醇提取物、饮片95%乙醇提取物或者其他丹参衍生品（如丹参酮提取物）200mg于100mL容量瓶中，加适量甲醇（30-40mL）溶解，超声振荡后稀释至刻度，摇匀后分别得到三种含有丹参酮类活性成分的供试品溶液，即丹参药材95%乙醇提取物供试品溶液，丹参饮片95%乙醇提取物供试品溶液和其他丹参衍生品供试品溶液（如丹参酮提取物供试品溶液）。

iv）测定法

分别精密吸取丹参酮IIA标准参照品溶液与含有丹参酮类活性成分的供试品溶液各20μ1，注入液相色谱仪，测定，即得丹参酮IIA含量。

②丹参酮IIA绝对含量计算（丹参药材或衍生品中丹参酮IIA含量计算）

i）由下式计算含有丹参酮类活性成分的供试品溶液中丹参酮IIA质量浓度：

$C_X=C_R\×\frac{A_X}{A_R}$

C_X：含有丹参酮类活性成分的供试品溶液中丹参酮IIA质量浓度（ug/mL）；

C_R：丹参酮IIA标准参照品溶液质量浓度（ug/mL）；

A_X：含有丹参酮类活性成分的供试品溶液的峰面积；

A_R：丹参酮IIA标准参照品溶液的峰面积。

ii）丹参药材或饮片中丹参酮IIA质量百分含量计算

a)由下式计算上述丹参药材或饮片95%乙醇提取物供试品溶液中丹参酮IIA质量百分含量

W'_丹参酮IIA(%)：丹参药材或饮片95%乙醇提取物供试品溶液中丹参酮IIA质量百分含量；

C_X：丹参药材或饮片95%乙醇提取物供试品溶液中丹参酮IIA质量浓度(ug/mL)；

m_供试品：称取的丹参药材或饮片95%乙醇提取物供试品的质量(mg)。

b）由下式计算丹参药材或饮片中丹参酮IIA质量百分含量：

W_丹参酮IIA（%）：丹参药材或饮片中丹参酮IIA质量百分含量；

W'_丹参酮IIA（%）：丹参药材或饮片95%乙醇提取物供试品溶液中丹参酮IIA质量百分含量；

m'：得到的丹参药材或饮片95%乙醇提取物的总质量(mg)；

m：称取的丹参药材或饮片的质量(mg)。

iii）由下式计算其他丹参衍生品中丹参酮IIA质量百分含量

W_丹参酮IIA(%)：其他丹参衍生品（如丹参酮提取物）中丹参酮IIA质量百分含量；

C_X：其他丹参衍生品供试品溶液（如丹参酮提取物供试品溶液）中丹参酮IIA质量浓度(ug/mL)；

m_供试品：称取的其他丹参衍生品供试品的质量(mg)。

5）通过偶联公式计算丹参药材或衍生品中丹参酮各个主要活性成分含量及总量，即丹参酮类活性成分组的含量

$W_n=\frac{W_1{M}_n{h}_n}{M_1{h}_1}$

W₁：丹参药材或衍生品中标准参照品丹参酮IIA的质量百分含量；

M₁：标准参照品丹参酮IIA的分子量；

h₁：标准参照品丹参酮IIA的特征峰峰强度（峰高）；

W_n：丹参药材或衍生品中某一丹参酮类活性成分的质量百分含量；

M_n：丹参药材或衍生品中某一丹参酮类活性成分的分子量；

h_n：丹参药材或衍生品中某一丹参酮类活性成分的特征峰峰强度（峰高）。

（2）由丹参药材得到的丹酚酸特征提取物（CES）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）丹酚酸特征提取物（CES）的获得

取阴干的丹参根、皮，粉碎，用6倍量75%~95%乙醇回流提取(×2)，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至浸膏。取上述浸膏加入10倍量乙酸乙酯，55℃下超声提取20min(×2)，离心，沉淀加入10倍量乙酸乙酯，45℃下超声提取20min；沉淀加8~20倍水，溶解后回流30min（×2），取出，即得丹酚酸特征提取物(CES)。

确定后的提取方法，将各条件数值进行微调，所得的提取物同样可以满足要求（发明内容已概括出范围），以上述给出的条件更优。

2）丹参酸特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测

取丹酚酸特征提取物（CES）30mg，溶于0.5mL CD₃OD（亦可采用DMSO-d₆），作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得丹酚酸IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

3）丹酚酸特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析

①鉴别

丹酚酸特征提取物（CES）IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹酚酸类化合物的特征信号，丹酚酸B、紫草酸、迭迭香酸等均有相应的NMR信号。

②丹酚酸特征提取物中的各活性成分特征峰选取

由于丹酚酸特征提取物中含有一系列酚酸类化合物，碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大相应峰作为特征峰。为此，经实际考察，选择δ_C 168.0（CD₃OD）[或δ_C 165.0（DMSO-d₆）]左右一组C-9碳峰作为该类活性成分碳峰指定特征峰，其原因为C-9羰基碳与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同丹酚酸化合物C-9碳峰之间化学位移也有一定差别。

③标准参照品的选择

丹酚酸B是丹酚酸特征提取物中水溶性成分的主要活性成分之一，其C-9特征峰的化学位移为δ_C 167.5~169.0(CD₃OD)或δ_C164.5~167.0(DMSO-d₆)，与其他主要水溶性成分在此没有重叠；因此，选择丹酚酸B作为标准参照品。

4）采用HPLC测定丹参药材或衍生品中丹酚酸B的含量

①丹酚酸B含量测定

i）色谱条件（参照2010版药典）

流动相：甲醇乙腈一甲酸一水(30：10：1：59)；

色谱柱：C18（250*4.6mm，5um）；检测波长：268nm。

ii）丹酚酸B标准参照品溶液的配制

精确称取丹酚酸B 5mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得丹酚酸B标准参照品溶液。

iii）含有丹酚酸类活性成分的供试品溶液的制备

a）丹参药材或饮片供试品溶液的制备

准确称取供试品：丹参药材/饮片的粉末0.4~0.5g，加75％甲醇25mL，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至1mL，作为丹参药材或饮片供试品溶液。

b）其他丹参衍生品供试品溶液的制备

准确称取供试品：其他丹参衍生品（如丹酚酸提取物）200mg于100mL容量瓶中，加适量甲醇（30~40mL）溶解，超声振荡后稀释至刻度，摇匀后即得其他丹参衍生品供试品溶液（如丹酚酸提取物供试品溶液）。

iv）测定法

分别精密吸取丹酚酸B标准参照品溶液与含有丹酚酸类活性成分的供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得丹酚酸B含量。

②丹酚酸B绝对含量计算（丹参药材或衍生品中丹酚酸B含量计算）

i）由下式计算含有丹酚酸类活性成分的供试品溶液中丹酚酸B质量浓度：

$C_X=C_R\×\frac{A_X}{A_R}$

C_X：含有丹酚酸类活性成分的供试品溶液中丹酚酸B质量浓度（ug/mL）；

C_R：丹酚酸B标准参照品溶液质量浓度（ug/mL）；

A_X：含有丹酚酸类活性成分的供试品溶液的峰面积；

A_R：丹酚酸B标准参照品溶液的峰面积。

ii）由下式计算丹参药材或衍生品中丹酚酸B质量百分含量

W_丹酚酸B（%）：丹参药材或衍生品中丹酚酸B质量百分含量；

C_X：含有丹酚酸类活性成分的供试品溶液中的丹酚酸B质量浓度(ug/mL)；

m：称取的丹参药材或衍生品的质量(mg)。

5）通过偶联公式计算丹参药材或衍生品中丹酚酸各个主要活性成分的含量及总量总量，即丹酚酸类活性成分组的含量

$W_n=\frac{W_1{M}_n{h}_n}{M_1{h}_1}$

W₁：丹参药材或衍生品中标准参照品丹酚酸B的质量百分含量；

M₁：标准参照品丹酚酸B的分子量；

h₁：标准参照品丹酚酸B的特征峰峰强度（峰高）；

W_n：丹参药材或衍生品中某一丹酚酸类活性成分的质量百分含量；

M_n：丹参药材或衍生品中某一丹酚酸类活性成分分子量；

h_n：丹参药材或衍生品中某一丹酚酸类活性成分特征峰峰强度（峰高）。

二、仪器、试剂与材料

主要仪器和设备

核磁共振波谱仪Bruker DPX 400型。

质谱仪：Waters Micromass公司Q-Tof MicroTM型。

半制备高效液相色谱仪：Waters 600型。

高效液相色谱仪：Agilent 1200型。

2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。

DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；柱层析硅胶G和薄层层析硅胶H：青岛海洋化工厂；硅胶层析柱6cm ×70cm（直径×高度）。

丹参（河南洛阳）、丹参（中原正信药材公司）、丹参（河南禹州），均经河南省农业大学朱长山教授鉴定；丹参酮IIA，化学对照品，实验室自制（经光谱数据鉴定）；丹酚酸B，化学对照品，实验室自制（经光谱数据鉴定）；试剂：色谱纯（甲醇，天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。

三、基础研究

（1）丹参酮分离流程

取阴干的河南洛阳丹参根3Kg，粉碎，用6倍量95%乙醇回流提取2次,滤液合并浓缩，所得浸膏用水溶解,然后依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯部分浓缩成浸膏。取此浸膏20g用薄层柱色谱分离,用正己烷－醋酸乙酯－甲酸（30：10：0.5）洗脱，得丹参酮IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I和隐丹参酮等化合物。

（2）丹酚酸分离流程

取阴干的河南洛阳丹参根3Kg，粉碎，用6倍量95%乙醇回流提取1次。蒸去乙醇的浸膏用热水充分提取，浓缩后后的水提取液用氯仿萃取以去掉丹参酮等色素，水层酸化到PH3，并依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取总酚酸。用80-100目硅胶作吸附剂，氯仿-甲醇-甲酸（85:15:1）作展开剂，切割成若干份后分别用热乙醇洗脱。用该方法可根据极性大小将总酚酸粗分。用硅胶H作吸附剂，不同比例的氯仿-甲醇-甲酸（95:5:1；90:10:1；85:15:1）作洗脱剂，可将粗分后的总酚酸进一步分离、纯化。得丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、紫草酸等化合物。

（3）丹参药材中主要活性成分的结构及核磁共振碳谱数据

丹参酮IIA（C₁₉H₁₈O₃）

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ_C:29.90(C-1)，19.13(C-2),37.86(C-3),34.67(C-4)，150.14(C-5)，133.48(C-6)，120.25(C-7)，127.48(C-8)，126.52(C-9)，144.50(C-10),183.68(C-11),175.81(C-12)，119.91*(C-13)，161.74(C-14)，141.28(C-15),121.16*(C-16),8.82(C-17)，31.85**(C-18)，31.67**(C-19)（*，**归属可互换）

隐丹参酮（C₁₉H₂₀O₃）

¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ_C:29.67(C-1)，19.07(C-2),37.80(C-3),34.85(C-4)，152.36(C-5)，132.58(C-6)，122.51(C-7)，128.39(C-8)，126.26(C-9)，143.68(C-10),184.26(C-11),175.69(C-12)，118.29(C-13)，170.76(C-14)，81.46(C-15),34.60(C-16),18.82(C-17)，31.93*(C-18)，31.88*(C-19)（*归属可互换）

丹参酮I（C₁₈H₁₂O₃）

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ_C:124.73(C-1)，130.61(C-2),128.30(C-3),135.16(C-4)，133.58(C-5)，132.87(C-6)，120.44(C-7)，129.56(C-8)，123.05(C-9)，132.87(C-10),183.38(C-11),175.55(C-12)，118.68(C-13)，161.11(C-14)，141.99(C-15),121.72(C-16),8.78(C-17)，19.82(C-18)

二氢丹参酮I（C₁₈H₁₄O₃）

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ_C:125.08(C-1)，130.45(C-2),128.26(C-3),134.99(C-4)，132.17(C-5)，131.96(C-6)，120.35(C-7)，128.88(C-8)，126.17(C-9)，134.99(C-10),184.38(C-11),175.78(C-12)，118.72(C-13)，170.59(C-14)，81.66(C-15),34.76(C-16),18.86*(C-17)，19.89*(C-18)（*归属可互换）

Anhydride of tanshinone IIA(丹参酮IIA酐，C₁₉H₁₈O₄)

¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ_C:28.1(C-1)，19.3(C-2),38.4(C-3),34.2(C-4)，149.4(C-5)，130.3(C-6)，122.9(C-7)，123.4(C-8)，128.4(C-9)，135.5(C-10),155.5(C-11),155.3(C-12)，122.6(C-13)，162.7(C-14)，140.8(C-15),113.7(C-16),8.6(C-17)，31.8(C-18)，31.8(C-19)

丹参酮IIB（C₁₉H₁₈O₄）

¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ_C:29.7(C-1)，18.7(C-2),32.2(C-3),39.9(C-4)，145.9(C-5)，133.8(C-6)，120.2(C-7)，127.0(C-8)，126.0(C-9)，146.1(C-10),183.0(C-11),175.4(C-12)，120.7(C-13)，161.0(C-14)，141.4(C-15),121.1(C-16),8.7(C-17)，26.6(C-18)，71.4(C-19)

19-羟基隐丹参酮（C₁₉H₂₀O₄）

¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ_C:29.5(C-1)，18.7(C-2),32.1(C-3),40.0(C-4)，148.2(C-5)，132.8(C-6)，122.8(C-7)，128.5(C-8)，118.6(C-9)，145.3(C-10),184.1(C-11),175.6(C-12)，122.8(C-13)，170.7(C-14)，81.5(C-15),34.6(C-16),18.7(C-17)，26.6(C-18)，71.4(C-19)

丹参新酮（miltirone，C₁₉H₂₂O₂）

¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ_C:29.3(C-1)，18.6(C-2),37.4(C-3),34.0(C-4)，148.7(C-5)，133.7(C-6)，128.2(C-7)，142.5(C-8)，127.9(C-9)，143.9(C-10),181.6(C-11),180.5(C-12)，134.1(C-13)，139.5(C-14)，26.4(C-15),21.2(C-16),21.2(C-17)，31.3(C-18)，31.3(C-19)

Salviamone（C₁₉H₁₈O₄，鼠尾草酮）

¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ_C:120.8(C-1)，127.1(C-2),130.8(C-3),134.7(C-4)，135.0(C-5)，122.2(C-6)，119.5(C-7)，119.6(C-8)，153.6(C-9)，123.8(C-10),175.9(C-11),131.1(C-12)，26.3(C-13)，73.1(C-14)，158.6(C-15),144.2(C-16),16.5(C-17)，19.4(C-18)

Ferruginol（C₂₀H₃₀O，弥罗松酚）

¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ_C:38.9(C-1)，19.2(C-2),41.7(C-3),33.7(C-4)，50.3(C-5)，19.3(C-6)，127.2(C-7)，148.6(C-8)，37.5(C-9)，37.5(C-10),111.0(C-11),150.7(C-12)，131.4(C-13)，126.6(C-14)，26.8(C-15),22.7(C-16),22.5(C-17)，21.6(C-18),33.4(C-19),24.7(C-20)

鼠尾草酚（Carnosol，C₂₀H₂₆O₄）

¹³C NMR(100MHz,CDCl3):δ_C 30.0(t,C-1),19.0(t,C-2),41.2(t,C-3),33.9(s,C-4),43.0(d,C-5),30.9(t,C-6),71.1(t,C-7),127.6(s,C-8),132.2(s,C-9),39.9(s,C-10),141.0(d,C-11),139.3(s,C-12),133.0(s,C-13),112.3(d,C-14),27.1(q,C-15),22.7(q,C-16),22.6(q,C-17),32.9(q,C-18),21.2(q,C-19),68.5(t,C-20)

丹酚酸B（C₃₆H₃₀O₁₆）

¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ_C:126.4(C-1),128.9(C-2)，149.0(C-3),145.2(C-4)，118.3(C-5)，122.1(C-6)，143.5(C-7)，116.4(C-8)，168.0(C-9)，129.2(C-1')，117.5(C-2'),146.1(C-3'),145.1(C-4')，116.5(C-5')，121.2(C-6')，37.5(C-7')，74.6(C-8')，173.6(C-9')，133.6(C-1'')，113.3(C-2″),146.8(C-3'),145.9(C-4″)，118.4(C-5″)，116.5(C-6″)，88.3(C-7″)，57.9(C-8″)，172.3(C-9″)，124.6(C-1″)，117.3(C-2″'),145.1(C-3″'),146.6(C-4″')，116.4(C-5″')，121.7(C-6″')，37.9(C-7″')，75.5(C-8″)，172.5(C-9″″);

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ_C:122.8(C-1)，125.0(C-2),145.8(C-3),147.3(C-4)，117.3(C-5)，120.0(C-6)，141.8(C-7)，117.1(C-8)，165.9(C-9)，127.9(C-1')，115.6(C-2'),145.5(C-3'),145.1(C-4')，115.4(C-5')，121.2(C-6')，36.2(C-7')，74.1(C-8')，171.3(C-9')，131.4(C-1″)，112.6(C-2″),144.0(C-3″),143.9(C-4″)，116.5(C-5″)，116.9(C-6″)，86.1(C-7″)，55.5(C-8″)，170.4(C-9″)，127.6(C-1″)，115.9(C-2″'),145.1(C-3″'),147.3(C-4″')，116.5(C-5″')，121.2(C-6″')，36.4(C-7″')，74.9(C-8″)，170.7(C-9″″)

丹酚酸A（C₂₆H₂₂O₁₀）

¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ_C:126.1(C-1)，128.4(C-2),144.4(C-3),148.3(C-4)，114.8(C-5)，120.1(C-6)，147.4(C-7)，115.5(C-8)，168.7(C-9)，129.3(C-1')，117.4(C-2'),146.1(C-3'),145.2(C-4')，116.3(C-5')，122.0(C-6')，37.9(C-7')，74.7(C-8')，173.6(C-9')，131.4(C-1″)，114.0(C-2″),146.4(C-3″),146.7(C-4″)，116.5(C-5″)，120.5(C-6″)，137.9(C-7″)，120.1(C-8″)

丹酚酸C（C₂₆H₂₀O₁₀）

¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ_C:126.3(C-1)，132.7(C-2),144.3(C-3),148.0(C-4)，114.9(C-5)，119.6(C-6)，146.7(C-7)，116.3(C-8)，168.7(C-9)，129.4(C-1')，117.6(C-2'),146.2(C-3'),145.3(C-4')，116.7(C-5')，121.8(C-6')，38.0(C-7')，74.8(C-8')，173.5(C-9')，123.3(C-1″)，113.4(C-2″),146.0(C-3″),145.2(C-4″)，111.8(C-5″)，118.8(C-6″)，159.4(C-7″)，99.2(C-8″)

紫草酸（C₂₇H₂₂O₁₂）

¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ_C:124.6(C-1)，127.6(C-2),148.8(C-3),145.2(C-4)，118.3(C-5)，121.7(C-6)，144.1(C-7)，116.3(C-8)，168.1(C-9)，129.2(C-1')，117.5(C-2'),146.6(C-3'),145.2(C-4')，116.4(C-5')，122.0(C-6')，37.9(C-7')，74.6(C-8')，173.4(C-9')，133.8(C-1″)，113.4(C-2″),146.7(C-3″),146.1(C-4″)，118.3(C-5″)，116.3(C-6″)，88.8(C-7″)，57.5(C-8'')，175.1(C-9″)

迭迭香酸（C₁₈H₁₆O₈）

¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)：δ_C:127.6(C-1)，115.2(C-2),146.6(C-3),149.6(C-4)，116.3(C-5)，123.1(C-6)，147.7(C-7)，114.3(C-8)，168.4(C-9)，129.2(C-1')，117.5(C-2'),146.0(C-3'),143.1(C-4')，116.5(C-5')，121.8(C-6')，37.8(C-7')，74.5(C-8')，173.4(C-9');

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)：δ_C:125.9(C-1)，113.8(C-2),145.3(C-3),148.9(C-4)，115.3(C-5)，122.1(C-6)，146.4(C-7)，115.8(C-8)，166.4(C-9)，127.8(C-1')，117.1(C-2'),145.9(C-3'),144.3(C-4')，116.2(C-5')，120.5(C-6')，36.6(C-7')，73.3(C-8')，171.3(C-9')

原儿茶醛（C₇H₆O₃）

¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ_C：130.84(C-1)，115.30(C-2)，153.74(C-3)，147.21(C-4)，116.22(C-5)，126.43(C-6)，193.07(醛基);

¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)δ_C：129.0(C-1)，114.5(C-2)，152.3(C-3),146.0(C-4)，115.7(C-5)，124.6(C-6)，191.2(醛基)。

原儿茶酸

¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ_C:123.2(C-1)，115.8(C-2)，146.1(C-3)，151.5(C-4)，117.8(C-5)，123.9(C-6)，170.3(C-7);

¹³C NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ_C:123.17(s,C-1),115.10(d,C-2),144.18(s,C-3),149.15(s,C-4),116.19(d,C-5),121.17(s,C-6),171.12(s,C-7)。

咖啡酸（C₉H₈O₄）

¹³C NMR(CD₃OD,75MHz):127.8(C-1),115.1(C-2),149.4(C-3),147.0(C-4),115.5C-5),116.8(C-6),146.8(C-7),122.8(C-8),170.9(C-9)

阿魏酸（C₁₀H₁₀O₄）

¹³C NMR(125MHz,CD₃OD):δ_C 51.9(q,OCH₃-3),114.8(d,C-8),115.1(d,C-2),116.4(d,C-5),122.7(d,C-6),127.6(s,C-1),146.6(s,C-4),146.7(s,C-7),149.3(s,C-3),169.5(s,C-9).

绿原酸（Chlorogenic acid，C₁₆H₁₈O₉）

¹³C NMR(125MHz,CD₃OD):127.8(C-1),115.2(C-2),146.8(C-3),149.6(C-4),116.0(C-5),123.0(C-6),147.1(C-7),115.3(C-8),168.7(C-9);B:76.1(C-1),38.8(C-2),72.0(C-3),73.4(C-4),71.3(C-5),38.2(C-6),177.0(C-7)

丹参素（C₉H₁₀O₅）

¹³C NMR(125MHz,D₂O):129.3(C-1),117.2(C-2),143.7(C-3),142.8(C-4),116.2(C-5),121.8(C-6),38.9(C-7),71.3(C-8),177.1(C-9);

9'紫草酸乙酯（C₃₈H₃₄O₁₆）

¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ_C:124.6(C-1),126.4(C-2)，149.1(C-3),146.1(C-4)，116.4(C-5)，122.2(C-6)，143.8(C-7)，116.4(C-8)，168.0(C-9)，129.0(C-1')，117.6(C-2'),146.8(C-3'),145.3(C-4')，116.5(C-5')，122.1(C-6')，37.9(C-7')，74.9(C-8')，171.9(C-9')，62.4(-OCH₂-),14.4(CH₃),133.6(C-1″)，113.3(C-2″),146.6(C-3″),145.1(C-4″)，118.4(C-5″)，116.5(C-6″)，88.3(C-7″)，57.9(C-8″)，172.2(C-9″)，128.7(C-1″')，117.3(C-2″'),146.0(C-3″'),145.1(C-4″')，116.4(C-5''')，121.7(C-6″')，37.5(C-7″')，75.7(C-8″')，172.5(C-9″')

实施例1：河南洛阳丹参药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱

（1）特征提取物制备

选择河南洛阳的丹参药材，按下述方法制备丹参药材丹参酮和

丹酚酸特征提取物：

1）丹参酮特征提取物制备方法如下：取阴干的丹参根、皮，粉碎，精密称定，用体积为6倍量、95v%的乙醇回流提取2次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至粉末，即得丹参95v%乙醇提取物。取上述粉末（丹参95v%乙醇提取物）加入体积为10倍量的乙酸乙酯，55℃下超声提取20min，离心，沉淀加入体积为10倍量的乙酸乙酯，35℃下超声提取20min，上清液合并后减压浓缩，回收溶剂至干，即得丹参酮特征提取物(CET)。

2）丹酚酸特征提取物制备方法如下：取阴干的丹参根、皮，粉碎，精密称定，用体积为6倍量、95%的乙醇回流提取2次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至浸膏。取上述浸膏加入体积为10倍量的乙酸乙酯，55℃下超声提取2次，每次20min，离心，沉淀加入体积为10倍量的乙酸乙酯，45℃下超声提取20min；沉淀加体积为17倍量的水，溶解后回流2次，每次30min，取出，即得丹酚酸特征提取物(CES)。

（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测

1）丹参酮特征提取物检测方法如下：取丹参酮特征提取物30mg，溶于0.5mL CDCl₃中，作IGD核磁共振碳谱检测，既得丹参酮特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

2）丹酚酸特征提取物检测方法如下：取丹酚酸特征提取物30mg，溶于0.5mLCD₃OD中，作IGD核磁共振碳谱检测，既得丹酚酸特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

（3）丹参酮特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别

河南洛阳产丹参药材的丹参酮特征提取物(CET)的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹参酮类化合物的特征信号：δ_C28.0-30.5或120.5-125.1或38.5-39.5,18.5-19.4或126.5-131.0,32.0-42.0或128.0-131.0,33.0-40.5或134.0-136.0,148.0-152.5或132.0-135.5或50.0-51.0，130.0-134.0或122.0-120.5或19.0-19.5分别为A环1,2,3,4,5,6碳信号，120.0-123.0或127.0-128.5,127.0-130.0或119.5-123.5或142.0-149.0,126.0-129.0或118.0-123.5或153.0-154.0或37.0-38.0,144.0-149.0或131.5-135.0或123.0-124.0或37.0-38.0分别为B环7,8,9,10位碳信号，181.0-185.0或175.0-176.0或155.0-156.0或109.5-111.5,175.5-181.0或150.0-156.0或134.5-135.5,分别为C环11,12位羰基碳信号，118.0-124.5或26.0-27.0或130.0-131.0,161.0-163.0或170.0-171.0或139.0-140.0或126.0-130.0或72.5-73.5，140.0-142.0或81.0-82.0或26.0-27.0或158.0-159.0,113.0-122.0或34.0-35.0或21.0-27.0或144.0-144.5分别为D环13,14,15,16位碳信号，8.7-8.9或16.5-23.0,31.0-32.0或19.4-22.0,31.0-34.0或71.0-72.0为丹参酮类化合物C-17,18,19甲基碳信号。丹参酮类：丹参酮IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I、隐丹参酮和ferruginol等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-1-2-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图1-1-2-b。

2）河南洛阳丹参药材的丹参酮特征提取物中各活性成分比例测定结果如下：

3）河南洛阳丹参药材中丹参酮IIA质量百分含量测定结果如下：

4）河南洛阳丹参药材中丹参酮类活性成分质量百分含量测定结果如下：

下表中Ferruginol+Anhydride of tanshinone IIA的分子式是以Ferruginol作为代表的分子式，丹参酮IIB+丹参新酮的分子式是以丹参酮IIB作为代表的分子式（以下实施例均同实施例1）。

（4）丹酚酸特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别

河南洛阳产丹参药材的丹酚酸特征提取物（CES）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹酚酸类化合物的特征信号：δ_C124.6-130.9,127.6-129.0或115.0-115.5,144.4-153.7,145.2-149.6,114.8-118.3，116.5-117.0或120.1-126.4，143.5-147.7或193.0-193.5,114.0-116.5或122.5-123.0,168.0-168.7分别为丹酚酸骨架A环1,2,3,4,5,6,7,8,9碳信号，37.5-38.0,74.5-74.7分别为B环7,8位碳信号,57.5-57.7为丹酚酸B或紫草酸C环7,8位碳信号，37.5-38.0,75.5-75.7分别为D环7,8位碳信号,88.3-88.8,172.0-175.为丹酚酸类化合物A环以外其他9位碳信号。丹酚酸类丹酚酸B、紫草酸、迭迭香酸等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-2-1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图1-2-1-b。

2）河南洛阳丹参药材的丹酚酸特提取物中各活性成分比例测定结果如下：

3）河南洛阳丹参药材中丹酚酸B质量百分含量测定结果如下：

称取药材质量m	400mg
		药材中丹酚酸B质量百分含量W丹酚酸B(%)	3.65%

4）河南洛阳丹参药材中丹酚酸类活性成分质量百分含量测定结果如下：

下表中丹酚酸B+9'紫草酸乙酯的分子式是以丹酚酸B作为代表的分子式（以下实施例均同实施例1）。

实施例2：中原正信丹参药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱

（1）特征提取物制备

选择中原正信的丹参药材，按下述方法制备丹参药材丹参酮和丹酚酸特征提取物：

1）丹参酮特征提取物制备方法如下：取阴干的丹参根、皮，粉碎，精密称定，用体积为10倍量、95v%的乙醇提取3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至粉末，即得丹参药材95v%乙醇提取物。取上述粉末（丹参药材95v%乙醇提取物）加入体积为10倍量的乙酸乙酯，75℃下回流提取20min，离心，沉淀加入体积为10倍量的乙酸乙酯，55℃下回流提取20min，上清液合并后减压浓缩，回收溶剂至干，即得丹参酮特征提取物(CET)。

2）丹酚酸特征提取物制备方法如下：取阴干的丹参根、皮，粉碎，精密称定，用体积为6倍量、90v%的乙醇回流提取3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至浸膏。取上述浸膏加入体积为10倍量的乙酸乙酯，55℃下超声提取3次，每次20min，离心，沉淀加入体积为10倍量的乙酸乙酯，45℃下超声提取20min；沉淀加体积为8倍量的水，溶解后回流3次，每次30min，取出，即得丹酚酸特征提取物(CES)。

（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测

与实施例1的相同。

（3）丹参酮特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别

中原正信丹参药材的丹参酮特征提取物（CET）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹参酮类化合物的特征信号：δ_C28.0-30.5或120.5-125.1或38.5-39.5,18.5-19.4或126.5-131.0,32.0-42.0或128.0-131.0,33.0-40.5或134.0-136.0,148.0-152.5或132.0-135.5或50.0-51.0或42.5-43.5，130.0-134.0或122.0-120.5或19.0-19.5或30.5-31.5分别为A环1,2,3,4,5,6碳信号，120.0-123.0或127.0-128.5或70.5-71.5,127.0-130.0或119.5-123.5或142.0-149.0,126.0-132.5或118.0-123.5或153.0-154.0或37.0-38.0,144.0-149.0或131.5-135.0或123.0-124.0或37.0-40.0分别为B环7,8,9,10位碳信号，181.0-185.0或175.0-176.0或155.0-156.0或109.5-111.5或140.5-141.5,175.5-181.0或150.0-156.0或134.5-140.0,分别为C环11,12位羰基碳信号，118.0-124.5或26.0-27.0或130.0-133.5,161.0-163.0或170.0-171.0或139.0-140.0或126.0-130.0或72.5-73.5或112.0-113.0，140.0-142.0或81.0-82.0或26.0-27.5或158.0-159.0,113.0-122.0或34.0-35.0或21.0-27.0或144.0-144.5分别为D环13,14,15,16位碳信号，8.7-8.9或16.5-23.0,31.0-33.0或19.4-22.0,31.0-34.0或71.0-72.0为丹参酮类化合物C-17,18,19甲基碳信号。丹参酮类化合物丹参酮IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I、隐丹参酮和ferruginol等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图2-1-b。

2）中原正信丹参药材的丹参酮特提取物中各活性成分比例测定结果如下：

3）中原正信丹参药材中丹参酮IIA质量百分含量测定结果如下：

4）河南中原正信丹参药材中丹参酮类活性成分质量百分含量测定结果如下：

（4）丹酚酸特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别

中原正信丹参药材的丹酚酸特征提取物（CES）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹酚酸类化合物的特征信号（同实施例1）。丹酚酸类化合物丹酚酸B、紫草酸和迭迭香酸等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-2-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图2-2-b。

2）中原正信丹参药材的丹酚酸特提取物中各活性成分比例测定结果如下：

3）中原正信丹参药材中丹酚酸B质量百分含量测定结果如下：

称取药材质量m	400mg
		药材中丹酚酸B质量百分含量W丹酚酸B(%)	4.22%

4）中原正信丹参药材中丹酚酸类活性成分质量百分含量测定结果如下：

实施例3：河南禹州丹参药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱

（1）特征提取物制备

选择河南禹州的丹参药材，按下述方法制备丹参药材丹参酮和丹酚酸特征提取物：

1）丹参酮特征提取物制备方法如下：取阴干的丹参根、皮，粉碎，精密称定，用体积为6倍量、95v%的乙醇提取3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至粉末，即得丹参药材95v%乙醇提取物。取上述粉末（丹参药材95v%乙醇提取物）加入体积为10倍量的乙酸乙酯，75℃下回流提取20min，离心，沉淀加入体积为10倍量的乙酸乙酯，55℃下回流提取20min，上清液合并后减压浓缩，回收溶剂至干，即得丹参酮特征提取物(CET)。

2）丹酚酸特征提取物制备方法如下：取阴干的丹参根、皮，粉碎，精密称定，用体积为6倍量、95%的乙醇回流提取3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至浸膏。取上述浸膏加入体积为10倍量的乙酸乙酯，55℃下超声提取2次，每次20min，离心，沉淀加入体积为10倍量的乙酸乙酯，45℃下超声提取20min；沉淀加体积为20倍量的水，溶解后回流2次，每次30min，取出，即得丹酚酸特征提取物(CES)。

（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测

与实施例1相同。

（3）丹参酮特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别

河南禹州丹参药材的丹参酮特征提取物（CET）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹参酮类化合物的特征信号（同实施例1）。丹参酮类化合物丹参酮IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I、隐丹参酮和ferruginol等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图3-1-b。

2）河南禹州丹参药材的丹参酮特提取物中各活性成分比例测定结果如下：

3）河南禹州丹参药材中丹参酮IIA质量百分含量测定结果如下：

4）河南禹州丹参药材中丹参酮类活性成分质量百分含量测定结果如下：

（4）丹酚酸特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别

河南禹州丹参药材的丹酚酸特征提取物（CES）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹酚酸类化合物的特征信号：δ_C124.6-130.9,127.6-129.0或115.0-117.5,143.5-153.9,142.5-149.6,114.8-118.3，116.5-117.0或120.1-126.5，143.5-147.7或193.0-193.5或38.5-39.5,114.0-116.5或122.5-123.0或71.0-72.0,168.0-168.7或170.5-171.5或177.0-177.5分别为丹酚酸骨架A环1,2,3,4,5,6,7,8,9碳信号，37.5-38.0,74.5-74.7分别为B环7,8位碳信号,57.5-57.7为丹酚酸B或紫草酸C环7,8位碳信号，37.5-38.0,75.5-75.7分别为D环7,8位碳信号,88.3-88.8,172.0-175.为丹酚酸类化合物A环以外其他9位碳信号。丹酚酸类丹酚酸B、紫草酸和迭迭香酸等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-2-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图3-2-b。

2）河南禹州丹参药材的丹酚酸特征提取物中各活性成分比例测定结果如下：

3）河南禹州丹参药材中丹酚酸B质量百分含量测定结果如下：

称取药材质量m	100g
		药材中丹酚酸B质量百分含量W丹酚酸B(%)	4.05%

4）河南禹州丹参药材中丹酚酸类活性成分质量百分含量测定结果如下：

实施例4：市售丹参酮提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

（1）特征提取物选择

直接选择市售丹参酮提取物（供应商：咸阳瑞欣生物技术有限公司）作为特征提取物。

（2）丹参酮提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测

取市售丹参酮提取物30mg，溶于0.5mL CDCl₃中，作IGD核磁共振碳谱，既得市售丹参酮提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

（3）市售丹参酮提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别

市售丹参酮提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹参酮类化合物的特征信号（同实施例1）。丹参酮类：丹参酮IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I、隐丹参酮和ferruginol等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图4-1-b。

2）市售丹参酮提取物中各活性成分比例测定结果如下：

3）市售丹参酮提取物中丹参酮IIA质量百分含量测定结果如下：

4）市售丹参酮提取物中丹参酮类活性成分质量百分含量测定结果如下：

实施例5：自制丹酚酸提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

（1）特征提取物选择

直接选择自制丹酚酸提取物（水提后大孔吸附树脂精制纯化：用河南洛阳野生丹参取100g，剪成小段，加6倍蒸馏水，100℃水浴回流加热0.5h，过滤，滤渣再加6倍水提取，共提3次。提取液减压浓缩到约350mL，抽滤，用10%HCl调PH值至～2，上D101大孔吸附树脂（南开大学化工厂）200g，先用水洗脱，再用300mL的60%v乙醇洗脱，60%v乙醇部分浓缩至干，得丹酚酸提取物8.0g。）作为特征提取物。

（2）丹酚酸提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测

取自制丹酚酸提取物30mg，溶于0.5mLDMSO-d₆中，作IGD核磁共振碳谱，既得自制丹酚酸提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

（3）自制丹酚酸提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱

1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别

自制丹酚酸提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示丹酚酸类化合物的特征信号：δ_C 124.6-130.9,127.6-129.0或115.0-115.5,144.4-153.7,145.2-149.6,114.8-118.3，116.5-117.0或120.1-126.4，143.5-147.7或193.0-193.1,114.0-116.5或122.5-123.0,168.0-168.7分别为丹酚酸骨架A环1,2,3,4,5,6,7,8,9碳信号，37.5-38.0,74.5-74.7分别为B环7,8位碳信号,57.5-57.7为丹酚酸B或紫草酸C环7,8位碳信号，37.5-38.0,75.5-75.7分别为D环7,8位碳信号,88.3-88.8,172.0-175.为丹酚酸类化合物A环以外其他9位碳信号。丹酚酸类丹酚酸B、紫草酸、迭迭香酸等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图5-1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图5-1-b。

2）自制丹酚酸提取物中各活性成分比例测定结果如下：

3）自制丹酚酸提取物中丹酚酸B质量百分含量测定结果如下：

4）自制丹酚酸提取物中丹酚酸类活性成分质量百分含量测定结果如下：

Claims (10)

1.一种鉴别丹参药材或衍生品的方法，包括以下步骤：

1）对丹参药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的丹参酮特征提取物和丹酚酸特征提取物；

2）对所述丹参酮特征提取物和丹酚酸特征提取物均进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；

3）通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；

4）利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出丹参药材或衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，从丹参药材或饮片中提取丹参酮特征提取物的方法，包括：取丹参药材或饮片粉碎，用6~10倍量、90~95%的乙醇回流提取2~3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至粉末，即得丹参药材或饮片乙醇提取物；取上述丹参药材或饮片乙醇提取物回流提取或超声提取两遍，第一遍加入8~12倍量乙酸乙酯，70~80℃下回流提取或50~60℃下超声提取18~22min；离心，沉淀后，第二遍加入8~12倍量乙酸乙酯，50~60℃下回流提取或30~40℃下超声提取18~22min，上清液合并后减压浓缩，回收溶剂至干，即得丹参酮特征提取物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，从丹参药材或饮片中提取丹酚酸特征提取物的方法，包括：取丹参药材或饮片粉碎，用6~10倍量75%~95%乙醇回流提取2~3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至浸膏；取上述浸膏超声提取两遍，第一遍加入8~12倍量乙酸乙酯，50~60℃下超声提取2~3次，每次18~22min；离心，沉淀后，第二遍加入8~12倍量乙酸乙酯，40~50℃下超声提取18~22min；沉淀后，再加水8~20倍，水回流2~3次，每次28~32min，取出，即得丹酚酸特征提取物。

4.根据权利要求2或3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2）中，对丹参酮特征提取物或丹酚酸特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解丹参酮特征提取物的溶剂为氘代氯仿、氘代丙酮或氘代二甲基亚砜；溶解丹酚酸特征提取物的溶剂为氘代甲醇、氘代丙酮或氘代二甲基亚砜；丹参酮特征提取物或丹酚酸特征提取物和相应溶剂的质量体积比均为55:1~65:1。

5.根据权利要求1~4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2）中，丹参酮特征提取物中的活性成分特征峰为C-2或C-18吸收峰，它们化学位移为δ_C 18.0~20.0。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）中，丹酚酸特征提取物中的活性成分特征峰为C-9吸收峰，溶解丹酚酸特征提取物的溶剂为氘代甲醇，C-9吸收峰的化学位移为δ_C 167.5~169.0；溶解丹酚酸特征提取物的溶剂为代二甲基亚砜，C-9吸收峰的化学位移为δ_C 164.5~167.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述定量分析手段为高效液相法；所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，丹参酮特征提取物中的活性成分的标准参照品为丹参酮IIA，丹酚酸特征提取物中的活性成分的标准参照品为丹酚酸B。

9.根据权利要求1~8任意一项所述的方法，其特征在于，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：

$W_n=\frac{W_1{M}_n{h}_n}{M_1{h}_1};$ 其中：

W₁为步骤3）用定量分析手段测定的丹参药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；

M₁为所述丹参药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量；

h₁为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的丹参药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；

W_n为丹参药材或衍生品中某一活性成分的质量百分含量；

M_n为丹参药材或衍生品中某一活性成分的分子量；

h_n为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的丹参药材或衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度。

10.根据权利要求1~9任意一项所述的方法，其特征在于，所述丹参衍生品包括：丹参饮片，丹参酮提取物，丹酚酸提取物或丹参天然药物。

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