CN109596754A - 一种丹参对照提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丹参对照提取物,其来源于:对丹参药材粉末进行多次低温提取、低温浓缩、低温干燥得到不同批次的丹参提取物,然后对不同批次的丹参提取物进行调配,得到丹参对照提取物。本发明的丹参对照提取物因是不同批次的提取物进行调配而成,保证了不同批次的丹参对照提取物的一致性;而且其性状稳定、均匀且便于使用。所述丹参对照提取物在应用上,是作为对照用于丹参及含丹参/丹参有效成分的药材或中药制剂的质量控制中,在此质量控制过程中,是将丹参对照提取物进行简单处理即可直接使用,操作简便,尤其在多成分含量测定时,对照提取物溶液的配制比对照品溶液的配制更加简便,不仅可以对药材或中药制剂进行定性鉴别,而且还可以用于半定量甚至定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量控制技术领域,特别是涉及一种丹参对照提取物的制备方法。
背景技术
现行中药质量控制模式基本上是沿着天然药物化学的发展,对中药某一种或几种有效成分为目标的分析方法和既有定性又可定量的质量标准的构思,参照国外植物药的质量控制方法,借鉴化学药品质量控制的模式,并借助文献报道建立相应的简单理化鉴别,再发展到以光谱、色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。每一味中药材都是多成分的综合体,这决定了其特有的整体性和模糊性,也表明以药材中一两个甚至几个成分作为药材质量的评价方法存在很大的局限性。1990 版《中国药典》增加了对照药材的薄层色谱鉴别,使得中药及中成药的鉴别有了很大的进展。目前中药和国外的草药越来越重视多成分或多组分的检测,例如德国银杏叶提取物的质量控制。指纹图谱的分析方法,可以从整体上对药材进行质量控制,现在仍然有很大的研究价值。目前中国药典在控制药材质量方面有两种“对照品”,化学对照品和中药对照药材。其中化学对照品可用于药材的定性鉴别和定量分析,中药对照药材则用于显微鉴别和薄层鉴别。然而,化学对照品和中药对照药材在中药质量控制上都有其局限性。首先,中药中化学成分多样化,单一或者几个化合物并不能反映药材的全貌,而现有的标准往往有很多漏洞,以次充好的现象时有发生。中药对照药材受到产地、生长环境的影响,很难保证每一批的质量一致,而且只能用于定性鉴别,无法反映药材成分含量的高低。
中药对照提取物是用中药材制备的性状及成分稳定,可以用于定性或者定量分析的提取物,谢培山先生对中药对照提取物提出了四个基本要求(ASCS),也是对照提取物应具备几个基本条件:Authenticity,药材来源可靠,具有代表性; Specificity,使用的检测方法专属性;Con-sistency,不同批次对照提取物应保持一致;Stability,性状稳定、均匀、便于使用。运用高效薄层色谱指纹图谱以及高效液相指纹图谱等方法,可以用于药材的定性鉴别,经过外标法标化的对照提取物,可以进一步用来半定量及定量分析检测。中药对照提取物将对中药质量控制有重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种批次一致性好、性状稳定、均匀且便于使用的丹参对照提取物,本发明还提供了所述丹参对照提取物的应用,即将所述丹参对照提取物用于丹参及含丹参/丹参有效成分的药材或中药制剂的质量控制中。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的丹参对照提取物因是不同批次的提取物进行调配而成,克服了因中药对照药材受到产地、生长环境的影响,很难保证每一批的质量一致的缺陷,从而保证了不同批次的丹参对照提取物的一致性;保证了制备全过程的低温控制,有效防止了有效成分的变化;其性状稳定、均匀且便于使用。所述丹参对照提取物在应用上,是将丹参对照提取物经过定量分析后,作为对照用于丹参及含丹参 /丹参有效成分的药材或中药制剂的质量控制中,在此质量控制过程中,是将丹参对照提取物进行简单处理即可直接使用,操作简便,尤其在多成分含量测定时,对照提取物溶液的配制比对照品溶液的配制更加简便,不仅可以对药材或中药制剂进行定性鉴别,而且还可以用于半定量甚至定量分析。
附图说明
图1-1是针对以化学对照品和丹参对照药材为参照物质对丹参原料药材进行薄层色谱法得到的丹参水溶性成分薄层色谱图。其中标号S的色谱带从上往下对应为化学对照品迷迭香酸、丹参素、丹酚酸B,6对应为丹参对照提取物,1-5依次对应丹参原料药材1、丹参原料药材2、丹参原料药材3、丹参原料药材4和丹参原料药材5。
图1-2是针对以化学对照品和丹参对照药材为参照物质对丹参原料药材进行薄层色谱法得到的丹参脂溶性成分薄层色谱图。其中标号S的色谱带从上往下对应为化学对照品丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮,6对应为丹参对照提取物,1-5依次对应丹参原料药材1、丹参原料药材2、丹参原料药材3、丹参原料药材4和丹参原料药材5。
图2-1、2-2、2-3是针对以化学对照品为参照物质丹参原料药材进行高效液相色谱法得到的吸收波长分别为248nm、270nm、286nm的HPLC指纹图谱叠加图,从上往下1-5分别对应丹参原料药材1、丹参原料药材2、丹参原料药材3、丹参原料药材4和丹参原料药材5,6对应为丹参原料药材,S1、S2由左往右对应化学对照品为丹酚酸B、丹参酮IIA,R对应共有模式。
图3为丹参对照提取物制备流程图。
图4-1、4-2、4-3为丹参对照提取物与丹参提取原料药材在吸收波长分别为248nm、270nm、286nm的HPLC共有模式指纹图谱叠加图,S1、S2由左往右对应化学对照品为丹酚酸B、丹参酮IIA,ERS对应丹参对照提取物,R为丹参原料药材共有模式。
图5-1是针对以化学对照品、丹参对照药材和丹参对照提取物为参照物质对市售药材进行薄层色谱法得到的丹参水溶性成分薄层色谱图。其中标号S的色谱带从上往下对应为化学对照品迷迭香酸、丹参素、丹酚酸B,15对应为丹参对照药材,16对应为丹参对照提取物,1-14依次对应丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参12、丹参13 和丹参14。
图5-1-1丹参药材及对照提取物高效薄层色谱图数码扫描图谱,条带1-14依次对应丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参12、丹参13和丹参14。15对应为丹参对照药材,16 对应为丹参对照提取物。
图5-1-2丹参药材及对照提取物脂溶性高效薄层色谱图数码扫描图谱,条带1-14依次对应丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参12、丹参13和丹参14。15对应为丹参对照药材, 16对应为丹参对照提取物。
图5-2是针对以化学对照品、丹参对照药材和丹参对照提取物为参照物质对市售药材进行薄层色谱法得到的丹参脂溶性成分薄层色谱图。其中标号S的色谱带从上往下对应为化学对照品丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮,15对应为丹参对照药材,16对应为丹参对照提取物,1-14依次对应丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参12、丹参13和丹参14。
图6-1、6-2、6-3是针对以化学对照品和丹参对照提取物为参照物质对市售药材进行高效液相色谱法得到的吸收波长分别为248nm、270nm、286nm的HPLC指纹图谱叠加图,从上往下1-14依次对应丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9和丹参10、丹参11、丹参12、丹参13和丹参 14。15对应为丹参对照药材,16为丹参对照提取物,S1、S2由左往右对应化学对照品为丹酚酸B、丹参酮IIA,R对应共有模式。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例中使用到的仪器和材料的来源如下:
拟用于制备对照提取物的药材:
丹参药材购于全国各大药材市场,经谢培山教授鉴定为唇形科植物丹参 Salviamiltiorrhiza Bge的干燥根和根茎。
Linomat 5薄层色谱半自动点样仪、ATS 4薄层色谱全自动点样仪、薄层色谱双槽展开缸、Chromatogram Immersion Device III色谱显色用浸渍槽和TLC visualizer薄层色谱摄像仪(瑞士,CAMAG)。
Agilent 1100series高效液相色谱仪,配有DAD检测器(美国,Agilent Technologies)。
甲苯、乙醇、甲醇、甲酸、磷酸、正己烷、乙酸乙酯均为分析纯(广州化学试剂厂)。
乙腈、甲醇为色谱纯(Merck KGaA)。
丹酚酸B,标示纯度≥98%,(宝鸡市辰光生物科技有限公司;批号: 20160928);
丹参酮IIA,标示纯度≥98.9%,(中国食品药品鉴定研究所;批号: 110766-201521);
丹参素,标示纯度≥98%,(宝鸡市辰光生物科技有限公司;批号:2015071);
迷迭香酸,标示纯度≥98%,(宝鸡市辰光生物科技有限公司;批号: 20151210);
丹参酮I,标示纯度≥98%,(中国食品药品鉴定研究所;批号: 110867-201607);
隐丹参酮,标示纯度≥98%,(中国食品药品鉴定研究所;批号: 110852-200806);
二氢丹参酮I,标示纯度≥98%,(宝鸡市辰光生物科技有限公司;批号:20161014);
丹参对照药材,(中国食品药品鉴定研究所;批号:120923-201615)
测试药材丹参:
丹参原料药材5批采购于全国各大药材市场,丹参原料药1-5
丹参药材14批采购于广州各大药店及药材市场,丹参1~14;
实施例1:丹参原料药材的筛选
本实施例提供了本发明丹参对照提取物的原料药材的筛选方法。
用薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以化学对照品和丹参对照药材为参照物质对丹参原料药材进行分析以及筛选。
丹参药材购于全国各大药材市场,经谢培山教授鉴定为唇形科植物丹参 Salviamiltiorrhiza Bge的干燥根和根茎。经鉴定5批药材符合标准可以备用。
1薄层色谱
1.1水溶性成分薄层色谱
1.1.1样品制备
化学对照品溶液:精密称取丹参素、丹酚酸B用甲醇配制成每1ml含0.5mg 的化学对照品溶液;精密称取迷迭香酸用甲醇配制成每1ml含0.1mg的化学对照品溶液。
药材供试品溶液:取原料药材粉末各0.5g,加入30%甲醇5ml,超声30分钟(500w),离心3分钟(转速为每分钟3200转),取上清液过0.22um滤膜即得药材供试品溶液。丹参药材买自全国各大药材市场,分别为:丹参原料药材1、丹参原料药材2、丹参原料药材3、丹参原料药材4和丹参原料药材5;同法制备丹参对照药材样品。
1.1.2薄层色谱检测
检测条件如下:
薄层板:TLC G60预制板(Merck);
点样:5μl,条带状点样长8mm;
展开剂:甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸=5:4:0.5:2;
展开方式:于双槽展开缸(20cm×10cm)在一侧加展开剂12ml,共同预平衡15分钟;薄层板的干燥:点样后的在50℃加热板下加热15分钟,保证薄层板的干燥;
检视:喷以5%香草醛70%硫酸乙醇溶液在90℃加热3min,在日光下下检视色谱。
检测结果:如图1-1所示,为日光下检视薄层色谱图。标号S的色谱带从上往下为化学对照品迷迭香酸、丹参素、丹酚酸B,1-5依次对应为丹参原料药材 1、丹参原料药材2、丹参原料药材3、丹参原料药材4和丹参原料药材5,6 对应为丹参对照药材;由图1-1可见,丹酚酸B、丹参素和迷迭香酸分离情况好,各批次丹参药材丹参对照药材在同一位置都可以显示相同的斑点,各批次丹参药材与丹参对照药材间相似度高。
1.2脂溶性成分薄层色谱
1.2.1样品制备
化学对照品溶液:精密称取丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I、二氢丹参酮用甲醇配制成每1ml含0.2mg的化学对照品溶液。
药材供试品溶液:取原料药材粉末各1g,加入乙酸乙酯5ml,超声30分钟(500w),离心3分钟(转速为每分钟3200转),取上清液过0.22um滤膜即得药材供试品溶液。丹参药材买自全国各大药材市场,分别为:丹参原料药材1、丹参原料药材2、丹参原料药材3、丹参原料药材4和丹参原料药材5;同法制备丹参对照药材样品。
1.2.2薄层色谱检测
检测条件如下:
薄层板:TLC G60预制板(Merck);
点样:8μl,条带状点样长8mm;
展开剂:正己烷-乙酸乙酯-甲酸=30:10:0.5;
展开方式:于双槽展开缸(20cm×10cm)在一侧加展开剂12ml,共同预平衡15分钟;薄层板的干燥:点样后的在50℃加热板下加热15分钟,保证薄层板的干燥;
检视:取出,晾干,在紫外灯(254nm)下检视荧光猝灭色谱。
检测结果:如图1-2所示,为紫外灯(254nm)下检视薄层荧光猝灭色谱图。标号S的色谱带从上往下为化学对照品丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮,1-5依次对应为丹参原料药材1、丹参原料药材2、丹参原料药材3、丹参原料药材4和丹参原料药材5;6对应为丹参对照药材;由图1可见,丹参酮 IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮分离情况好,各批次丹参药材丹参对照药材在同一位置都可以显示相同的斑点,各批次丹参药材与丹参对照药材间相似度高。结合水溶性成分薄层色谱结果,初步可筛选作为丹参对照提取物的提取药材。
2高效液相色谱
2.1样品制备
化学对照品溶液:取丹参酮IIA对照品适量,精密称定,置棕色容量瓶,用甲醇配制成每1ml约含丹参酮IIA 20μg的溶液,为丹参酮IIA对照品溶液;另取丹酚酸B对照品适量,精密称定,用80%甲醇配制成每1ml约含1mg丹酚酸B 的溶液,为丹酚酸B对照品溶液;
药材供试品溶液:取本品粉末(过三号筛)约0.2g,精密称定,先后用甲醇、 30%甲醇各10ml,前后分别超声提取30min(500w),离心5min(转速为每分钟3200转),甲醇提取液与30%甲醇提取液合并至25ml容量瓶中,用30%甲醇定容至刻度,用045μm滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液(新鲜配制)。丹参药材买自全国各大药材市场,分别为:丹参原料药材1、丹参原料药材2、丹参原料药材3、丹参原料药材4和丹参原料药材5;同法制备丹参对照药材样品。
2.2高效液相色谱检测
高效液相色谱法检测条件如下:
色谱仪器:Agilent 1100series高效液相色谱仪,配有DAD检测器(美国,AgilentTechnologies)
色谱柱:Zorbox SB C18column(250mm×4.6mm I.D,5μm);
流动相:A-甲醇,B-乙腈,C-0.2%磷酸水溶液;
梯度洗脱程序:0-45min:0%A→0%A,45-60min:0%A→35%A,60-80min: 35%A→35%A,80-90min:35%A→5%A,90-100min:5%A→5%A;
0-45min:0%B→30%B,45-60min:30%B→36%B,60-80min: 36%B→36%B,80-90min:36%B→90%B,90-100min:90%B→90%B;
0-45min:100%C→70%C,45-60min:70%C→29%C,60-80min:29%C→29%C,80-90min:29%C→5%C,90-100min:5%C→5%C;
检测波长248nm、270nm、286nm(DAD检测器);流速1.0ml/min;进样量 20μl;柱温20℃,运行时间:100min。
高效液相色谱法检测方法:分别精密吸取化学对照品溶液10μl、丹参对照药材溶液和药材供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪。
高效液相色谱法检测结果:
测定,记录色谱图,即得图2-1、2-2、2-3所示的吸收波长分别为248nm、270nm、286nm的HPLC指纹图谱叠加图,从上往下1-5分别对应丹参原料药材1、丹参原料药材2、丹参原料药材3、丹参原料药材4和丹参原料药材5,S1、S2由左往右对应化学对照品为丹酚酸B、丹参酮IIA,6为丹参对照药材,R对应共有模式。
由图2-1、2-2、2-3可以看出,丹参1-丹参5原料药材和丹参对照药材的指纹图谱具有高度的一致性,由此建立丹参药材的指纹图谱共有模式,并对所有样品进行相似度分析。
根据既定的丹参药材指纹图谱共有模式,采用夹角余弦算法根据各样品组分及其峰面积对5批丹参药材及丹参对照药材样品进行相似度评价,结果如表1所示。
表1
根据以上相似度分析结果,5批丹参原料药材在吸收波长为248nm、270nm 和286nm下的相似度均很高,结合薄层色谱结果可选用为丹参标准对照提取物提取得原料药材。
实施例2:丹参对照提取物的制备
本实施例提供了本发明丹参对照提取物的制备方法,其方法流程图如图3所示。
一:提取
选取丹参药材,制成粉末,然后加入其质量10倍体积的95%乙醇(即固液比为1:10(w/V)),闪式提取1min后中速定性滤纸过滤,收集滤渣1和滤液1,滤渣1按相同方法再次提取二次,并将再次提取二次收集的滤液与滤液1合并即为提取液,将提取液低温浓缩即得丹参干膏1;最后一次过滤得到滤渣2,加入滤渣2 质量10倍体积的70%乙醇(即固液比为1:10(w/V)),闪式提取1min后中速定性滤纸过滤,收集滤渣3和滤液2,滤渣3按相同方法再次提取二次,并将再次提取二次收集的滤液与滤液2合并即为提取液,将提取液低温浓缩即得丹参干膏2;
二:制备丹参提取物
分别用适量乙醇将干膏溶解完全后,再分别加干膏质量的50%的微粉硅胶(山河药辅),用旋转蒸发仪低温回收溶剂至干,粉碎过110目筛,得到丹参提取物 1和丹参提取物2。
制备5批丹参提取物,通过对照品利用高效液相色谱法测定,检测结果如表 3所示:
表3
三:调配
将步骤二的5个批次的丹参提取物1按1:1比例混合勾兑得到丹参混合提取物1,将步骤二的5个批次的丹参提取物2按1:1比例混合勾兑得到丹参混合提取物2,将丹参混合提取物1与丹参混合提取物2以1:5.6比例混合勾兑得到丹参对照提取物,最终产品对应原药材比例大约为1:6.0(g/g),通过对照品利用高效液相色谱法测定,其中各成分的含量的测定结果如表4所示。
表4
调配标准为:应使最终的丹参对照提取物中丹酚酸B的含量不得低于3.00%且不高于8.00%;隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA总含量不低于0.25%且不高于0.50%(含量以wt%计)。此调配标准中的各成分的含量的范围也是经过多次反复实验综合保持稳定性、一致性以及后面的应用等得出的最佳数据。
四:检测
将步骤三调配成的丹参对照提取物通过对照品利用高效液相色谱法测定得到指纹图谱,与制备原料药材共有模式图谱进行相似度检测,如图4-1、4-2、4-3,ERS对应丹参对照提取物,S1、S2由左往右对应化学对照品为丹酚酸B、丹参酮IIA,R为丹参原料药材共有模式。不同吸收波长下得到相似度分别为 248nm=0.977、270nm=0.956、286nm=0.992,丹参对照提取物和丹参药材指纹图谱共有模式的相似度高,这说明本发明的丹参对照提取物能代表丹参药材。
实施例3丹参对照提取物的性状分析
1.表观状态:实施例2得到的丹参对照提取物为浅黄色粉末。
2.水分测定:按照2015版中国药典附录IX G(减压干燥法)进行。检测结果为丹参对照提取物含水量为4.10%。
3.一致性测试:按照实施例2的方法制备3批次丹参对照提取物,经测定各批次间的针对丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的薄层色谱检测结果差异很小,丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的荧光斑点有明显的显示,且分布非常一致;经高效液相色谱检测其丹酚酸B和隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA含量在调配标准范围之内。因此利用本发明的丹参对照提取物的制备方法制备得到的丹参对照提取物一致性非常好。
4.稳定性测试:
取3个不同批次的按照实施例2的方法制备的丹参对照提取物的供试品,按照国家药典委员会制订的“国家药品标准物质研制技术要求”的相关规定,考察指标包括性状和溶解性。
供试品开口置适宜的洁净容器中,60℃温度下放置10天,于第5天和第 10天取样,按稳定性重点考察项目进行检测。
结果显示,高温试验前后供试品性状无明显变化,高温试验前后薄层色谱图也无明显变化,溶出率测定结果用SPSS进行独立样本t-检验,计算结果P>0.05,说明无显著性差异。
实施例4
本实施例提供了对实施例2制备得到的丹参对照提取物的应用。
用薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以化学对照品、丹参对照药材和丹参对照提取物为参照物质对市售药材进行分析。
1薄层色谱
1.1水溶性成分薄层色谱
1.1.1样品制备
化学对照品溶液:精密称取丹参素、丹酚酸B用甲醇制成每1ml含0.5mg 的化学对照品溶液;精密称取迷迭香酸用甲醇制成每1ml含0.1mg的化学对照品溶液。
丹参对照提取物溶液:精密称取实施例2制备得到的丹参对照提取物 150mg,加入30%甲醇1ml,超声(500w)处理15分钟,摇匀,加30%甲醇定容至2ml容量瓶,过0.22μm滤膜即得丹参对照提取物溶液。
药材供试品溶液:取原料药材粉末各0.5g,加入30%甲醇5ml,超声30分钟(500w),离心3分钟(转速为每分钟3200转),取上清液过0.22um滤膜即得药材供试品溶液。药材均买自广州,分别为:丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参12、丹参13 和丹参14。
1.1.2薄层色谱检测
检测条件如下:
薄层板:TLC G60预制板(Merck);
点样:5μl,条带状点样长8mm;
展开剂:甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸=5:4:0.5:2;
展开方式:于双槽展开缸(20cm×10cm)在一侧加展开剂12ml,共同预平衡15分钟;薄层板的干燥:点样后的在50℃加热板下加热15分钟,保证薄层板的干燥;
检视:喷以5%香草醛70%硫酸乙醇溶液在90℃加热3min,在日光下检视色谱。
检测结果:如图5-1所示,为日光下检视薄层色谱图。标号S的色谱带从上往下为化学对照品迷迭香酸、丹参素、丹酚酸B,1-14依次对应丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参12、丹参13和丹参14。15对应为丹参对照药材,16对应为丹参对照提取物;
结果分析:由图5-1可知,迷迭香酸、丹参素、丹酚酸B分离情况较好,丹参对照提取物和丹参对照药材、丹参药材(丹参1-丹参14)在同一位置都可以显示相同的斑点,从图谱看出丹参对照提取物与丹参对照药材、药材(丹参1- 丹参14)有高度的一致性。
1.2脂溶性成分薄层色谱
1.2.1样品制备
化学对照品溶液:精密称取丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I、二氢丹参酮用甲醇制成每1ml含0.2mg的化学对照品溶液。
丹参对照提取物溶液:精密称取实施例2制备得到的丹参对照提取物 150mg,加入乙酸乙酯1ml,超声(500w)处理15分钟,摇匀,加乙酸乙酯定容至2ml容量瓶,过0.22μm滤膜即得丹参对照提取物溶液。
药材供试品溶液:取原料药材粉末各1g,加入乙酸乙酯5ml,超声30分钟 (500w),离心3分钟(转速为每分钟3200转),取上清液过0.22um滤膜即得药材供试品溶液。药材均买自广州,分别为:丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参12、丹参13 和丹参14。
1.2.2薄层色谱检测
检测条件如下:
薄层板:TLC G60预制板(Merck);
点样:8μl,条带状点样长8mm;
展开剂:正己烷-乙酸乙酯-甲酸=30:10:0.5;
展开方式:于双槽展开缸(20cm×10cm)在一侧加展开剂12ml,共同预平衡15分钟;薄层板的干燥:点样后的在50℃加热板下加热15分钟,保证薄层板的干燥;
检视:取出,晾干,在紫外灯(254nm)下检视色谱。标号S的色谱带从上往下为化学对照品丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮,1-14依次对应丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参12、丹参13和丹参14。15对应为丹参对照药材,16 对应为丹参对照提取物;
结果分析:由图5-2可知,丹参酮IIA、丹参I、隐丹参酮和二氢丹参酮分离情况较好,丹参对照提取物和丹参对照药材,丹参药材(丹参1-丹参14)在同一位置都可以显示相同的斑点,从图谱看出丹参对照提取物与丹参对照药材、丹参药材药材(丹参1-丹参14)有高度的一致性。
2高效液相色谱
2.1样品制备
化学对照品溶液:取丹参酮IIA对照品适量,精密称定,置棕色容量瓶,用甲醇配制成每1ml约含丹参酮IIA 20μg的溶液,为丹参酮IIA对照品溶液;另取丹酚酸B对照品适量,精密称定,用80%甲醇配制成每1ml约含1mg丹酚酸B 的溶液,为丹酚酸B对照品溶液;
丹参对照提取物溶液:取丹参ERS约30mg,精密称定,先后用甲醇、30%甲醇各2ml,前后分别超声30min,离心5min,合并提取液至5ml容量瓶,用 30%甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为丹参ERS溶液;
药材供试品溶液:取本品粉末(过三号筛)约0.2g,精密称定,先后用甲醇、 30%甲醇各10ml,前后分别超声提取30min(500w),离心5min(转速为每分钟3200转),甲醇提取液与30%甲醇提取液合并至25ml容量瓶中,用30%甲醇定容至刻度,用045μm滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液(新鲜配制)。药店药材均买自广州,分别为:丹参1、丹参2、丹参3、丹参4、丹参5、丹参 6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参12、丹参13和丹参14。
2.2高效液相色谱检测
高效液相色谱法检测条件如下:
色谱仪器:Agilent 1100series高效液相色谱仪,配有DAD检测器(美国,AgilentTechnologies)
色谱柱:Kromasil 100-5C18column(250mm×4.6mm I.D,5μm);
流动相:A-甲醇,B-0.1%磷酸水溶液;
梯度洗脱程序:0-30min:18%A→55%A,30-35min:55%A→62%A,35-50min:62%A→65%A,50-55min:65%A→80%A,55-65min:80%A→100%A,65-75min: 100%A→100%A;
0-30min:82%B→45%B,30-35min:45%B→38%B,35-50min:38%B→35%B, 50-55min:35%B→20%B,55-65min:20%B→0%B,65-75min:0%B→0%B;
检测波长240nm(DAD检测器);流速1ml/min;进样量10μl;柱温20℃,运行时间:75min。
高效液相色谱法检测方法:分别精密吸取化学对照品溶液、丹参对照药材溶液、丹参对照提取物溶液和药材供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪。
高效液相色谱法检测结果:
测定,记录色谱图,即得图6-1、6-2、6-3所示的吸收波长分别为248nm、270nm、286nm的HPLC指纹图谱叠加图,从上往下1-14依次对应丹参1、丹参2、丹参 3、丹参4、丹参5、丹参6、丹参7、丹参8、丹参9、丹参10、丹参11、丹参 12、丹参13和丹参14。1为丹参对照提取物,2为丹参对照药材,S1、S2由左往右对应化学对照品为丹酚酸B、丹参酮IIA,R对应共有模式。
由图6-1、6-2、6-3可以看出,丹参1-丹参14药材的指纹图谱具有高度的一致性。根据丹参对照提取物指纹图谱,采用夹角余弦算法根据各样品组分及其峰面积对14批丹参药材指纹图谱进行相似度评价,结果如表5所示。
表5
根据以上相似度分析结果,14批药材除丹参12外其余样品和丹参对照提取物的相似度≥0.900,相似度很高。表明本发明的丹参对照提取物与药材的一致性良好,应用于药材或中药制剂的半定量鉴别分析。
根据TLC及HPLC指纹图谱的结果可知,对所述丹参对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图与其对应的药材一致,更确切的说,对所述丹参对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图中的迷迭香酸、丹参素、丹酚酸B和二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I位置处的荧光斑点和采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在丹酚酸B和隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA位置处的色谱峰分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致,因此本发明的丹参对照提取物可应用于药材或中药制剂的定性鉴别,例如对药材或中药制剂的丹酚酸B、丹参酮类成分进行定性分析。
根据HPLC测定结果以及统计分析,建立的丹参提取药材指纹图谱共有模式与丹参药材的相似度极高,而本发明的丹参对照提取物和丹参提取药材指纹图谱共有模式的相似度又极高,这说明使用本发明的丹参对照提取物对药材或中药制剂进行丹酚酸B、丹参酮类成分的含量测定可靠性极高,因此本发明的丹参对照提取物可应用于药材或中药制剂的半定量鉴别分析,也可应用于丹参及含丹参/ 丹参有效成分的药材或中药制剂的质量控制中,例如对药材或中药制剂的丹酚酸 B、丹参酮类成分进行半定量鉴别分析,或者对丹参及含丹参/丹参有效成分的药材或中药制剂进行半定量检测进而控制其质量。
Claims (10)
1.一种丹参对照提取物,其特征在于,其来源于:对丹参药材粉末进行多次低温提取、低温浓缩、低温干燥,得到不同批次的丹参提取物,然后对不同批次的丹参提取物进行调配,得到丹参对照提取物;
任选的,所述对丹参药材粉末进行多次提取,是使其含有的丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的浓度提高,从而得到不同批次的丹参提取物。
任选的,所述丹参对照提取物中丹酚酸B的含量不得低于3.00%且不高于8.00%;隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA总含量不低于0.25%且不高于0.50%;
任选的,对所述丹参对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致;
任选的,对所述丹参对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图中的丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA处的荧光斑点和采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA位置处的色谱峰应分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致。
2.根据权利要求1所述的丹参对照提取物,其特征在于,该丹参对照提取物采用以下步骤制备而成:
步骤一、提取:取丹参药材粉末与不同比例乙醇混合,低温提取后过滤,得到滤液1、滤液2和滤渣1、滤渣2,将滤液1和滤液2低温浓缩成丹参干膏1和丹参干膏2;
步骤二、制备丹参提取物:将所得丹参干1和丹参干膏2,溶解于乙醇,得到丹参干膏的乙醇溶液1和丹参干膏的乙醇溶液2,再加入辅料,低温干燥过筛得到丹参提取物1和丹参提取物2;
步骤三、调配:将不同批次的丹参提取物进行调配,得到丹参对照提取物。
3.根据权利要求2所述的丹参对照提取物,其特征在于,所述步骤一中所述的滤渣1按照步骤一的提取方法经过N次提取,并将N次提取收集的滤液与滤液1合并即为提取液,将提取液低温浓缩得到丹参干膏1;滤渣1最后一次提取过滤,得到滤渣2,滤渣2按照步骤一的提取方法经过N次提取,并将N次提取收集的滤液与滤液2合并即为提取液,将提取液低温浓缩得到丹参干膏2;其中6≥N≥0,且N为整数;
任选的,对于丹参提取物1,所述N为3;对于丹参提取物2,所述N为3。
4.根据权利要求2所述的丹参对照提取物,其特征在于,所述步骤一中所述的提取溶液乙醇浓度为30%~95%;
任选的,对于丹参提取物1,所述步骤一中提取溶液乙醇浓度为95%;
任选的,对于丹参提取物2,所述步骤一中提取溶液乙醇浓度为70%。
5.根据权利要求2所述的丹参对照提取物,其特征在于,所述步骤一中的丹参药材粉末与乙醇的重量体积比为1:5~1:45;
任选的,所述步骤一中的丹参药材粉末与乙醇的重量体积比为1:10;
任选的,所述步骤一中的低温提取方式为:闪式提取;
任选的,所述步骤一中的闪式提取时间为1~5min;
任选的,所述步骤一中的闪式提取时间为1min;
任选的,所述步骤一中的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤;
任选的,所述步骤一中的过滤是用中速滤纸。
6.根据权利要求2所述的丹参对照提取物,其特征在于,所述步骤二中丹参干膏1和丹参干膏2与乙醇的重量体积比:1:2~1:10;
任选的,所述步骤二中所用辅料是微粉硅胶和/或药用淀粉。
任选的,对于丹参提取物1所述辅料为微粉硅胶;
任选的,对于丹参提取物2所述辅料为微粉硅胶;
任选的,所述步骤二是在丹参干膏的乙醇溶液1和丹参干膏的乙醇溶液2中加入其重量的10%~50%的微粉硅胶;
任选的,所述步骤二是在丹参干膏的乙醇溶液1中加入其重量的50%的微粉硅胶;
任选的,所述步骤二是在丹参干膏的乙醇溶液2中加入其重量的30%的微粉硅胶;
任选的,所述步骤二蒸干后是过90~200目筛网过滤;
任选的,对于丹参提取物1所述步骤二低温干燥后是过110目筛网过滤;
任选的,对于丹参提取物2所述步骤二低温干燥后是过110目筛网过滤;
任选的,所述步骤二与步骤三之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的丹参提取物的丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA进行检测的步骤。
7.根据权利要求1、2、5、6中所述的“低温”是指不高于60℃。
8.根据权利要求2所述的丹参对照提取物,其特征在于,所述步骤三中调配的标准为:应使最终得到的对照提取物中丹酚酸B的含量不得低于3.00%且不高于8.00%;隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA总含量不低于0.25%且不高于0.50%;
任选的,对所述丹参对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致;
任选的,对所述丹参对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图中的丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA位置处的荧光斑点和采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA位置处的色谱峰应分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致。
9.权利要求1至8任一项所述的丹参对照提取物在药材或中药制剂的鉴别,或丹参或含丹参/丹参有效成分的药材或中药制剂的质量控制中的应用。
10.根据权利要求9的应用,其特征在于,所述药材或中药制剂的鉴别,或丹参及含丹参/丹参有效成分的中药制剂的质量控制的方法为:将权利要求1-8任一项制备得到的丹参对照提取物、药材或中药制剂以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测,对比判别;
任选的,所述薄层色谱法和/或高效液相色谱法是对丹参对照提取物、药材或中药制剂中的丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA进行检测。
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