CN101336961A - 冠心丹参滴丸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备冠心丹参滴丸的方法，包括：(1)丹参用75－95％乙醇提取，滤过，滤液减压回收乙醇；(2)丹参药渣用水或30－70％乙醇提取，滤过，滤液浓缩，静置，离心，取上清液用树脂柱吸附；先用水冲洗，再用30－70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇；(4)三七用50－90％乙醇提取，提取液滤过，滤液回收乙醇，浓缩液放置，滤过，滤液上树脂柱吸附；先用水冲洗，再用30－70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇；(5)将上述药液合并，浓缩成稠膏；(6)将稠膏与基质搅匀，加入降香油，混合均匀，密闭保温，滴制成型，即得。本发明所制备的滴丸剂在有效成分的含量、生物利用度等方面都有了明显提升。

Description

冠心丹参滴丸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的制备方法，尤其涉及一种治疗冠心病心绞痛的冠心丹参滴丸的制备方法，属于中药领域。

背景技术

冠心丹参片是治疗冠心病心绞痛的一种疗效确切的中药制剂，其处方组成为：丹参200g三七200g降香油1.75ml；其制法如下：以上三味，三七粉碎成细粉；丹参粉碎成中粉，照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法(附录I)，用90％乙醇作溶剂进行渗漉，收集漉液，回收乙醇并浓缩成稠膏；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量，加入上述细粉及稠膏，搅匀，制成颗粒，干燥，喷加降香油，混匀，压制成1000片，包糖衣，即得。目前，临床上使用的冠心丹参片多是片剂和胶囊剂。

丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效。用于胸腹刺痛、心烦不眠、肝脾肿大及心绞痛，能显著增加冠脉流量，是心血管系统的常用中药。丹参中的主要有效成分有脂溶性成分和水溶性成分，两大部分。脂溶性部分主要是丹参酮类：包括丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I、二氢丹参酮等成分，其中丹参酮IIA是丹参中脂溶性化合物的代表成分。药理研究表明丹参酮IIA具有抗血小板聚集作用，抗血栓作用和对实验性心肌缺血何灌注损伤具有保护作用。水溶性部分主要是丹参酚酸类：包括丹酚酸A～C、迷失香酸及其甲酯、丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸等。丹酚酸B是丹参中水溶性化合物的代表成分。药理研究表明丹参酚酸类成分具有抗血小板聚集作用，抗血栓形成作用、改善微循环作用、抗氧化损伤作用和多途径发挥心肌保护作用。

三七具有散瘀止痛，消肿定痛等的功效，用于冠心病心绞痛的治疗，其中三七总皂苷为主要有效成分。

降香油具有有降气、止血、消炎、镇痛等多种功效。

滴丸剂是中药新剂型，粒径小、圆滑、便于吞咽及含服，具有速效、高效、服用剂量小的优点，将冠心丹参片制备成滴丸剂，可提高其生物利用度、更充分的发挥其疗效，最终达到提高疗效的目的，符合中医药理论急病急治原则。

公开号为CN 1939406A的中国专利申请公开了一种冠心丹参滴丸的制备方法，该专利申请仅仅对药物稠膏与基质的用量、基质的种类以及滴制成型等工艺参数进行了摸索或优化。该专利申请没有对丹参和三七的有效成分的提取和纯化方法进行优化，所制备的滴丸在有效成分的含量乃至疗效上都有待提高。由于丹参和三七中含有多种有效成分，其中，丹参中的有效成分分为脂溶性成分和水溶性成分两大部分，不同的提取条件，所得到的提取物中，有效成分的含量差别较大，这直接导致了最终产品在生物利用度和疗效方面存在着显著差别。最大限度的将丹参和三七中的各种有效成分充分的提取出来以及将提取物的纯化程度、药物稠膏与基质的用量比例、基质的种类以及滴制成型等工艺参数都直接关系到所制备滴丸剂的生物利用度和疗效的高低。

发明内容

本发明目的是提供一种冠心丹参滴丸的制备方法，该制备方法对于丹参和三七中的有效成分的提取和纯化方法以及药物稠膏与基质的用量比例、基质的种类以及滴制成型等直接影响产品疗效的工艺参数进行了优化和筛选，最大限度的提高了冠心丹参滴丸的有效成分的含量和生物利用度。

本发明目的是通过以下技术方案来实现的：

一种制备冠心丹参滴丸的方法，包括：

(1)按以下重量份称取各原料药：丹参1600份，三七1600份，降香油14份；

(2)丹参用75-95％乙醇提取，提取液滤过，滤液减压回收乙醇，得药液1，备用；

(3)将步骤(2)乙醇提取后的丹参药渣挥干乙醇，再用水或30-70％乙醇提取，提取液滤过，滤液浓缩，浓缩液静置，离心，取上清液用树脂柱吸附；吸附完成后先用水冲洗，弃取冲洗液，再用30-70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得药液2，备用；

(4)三七粉碎后用50-90％乙醇提取，提取液滤过，滤液回收乙醇，浓缩，浓缩液放置过夜，滤过，滤液通过预处理好的树脂柱，上样吸附；吸附完成后先用水冲洗，弃取冲洗液，再用30-70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得药液3，备用；

(5)将药液1、药液2和药液3合并，合并后的药液浓缩成稠膏，备用；

(6)将稠膏与熔融后的基质搅匀，再加入降香油，混合均匀，密闭保温，滴制成型，即得。

此外，本发明还可以将步骤(2)、(3)和(4)所制备的药液1、药液2和药液3与降香油混合后，加入适宜的制剂辅料和载体，按照本领域的常规制剂方法制备成适宜的口服制剂，例如可以是颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、散剂或口服液等，这些都应在本发明的保护范围之内。

为了达到更好的技术效果，优选的，步骤(2)中将丹参粉碎后每次用4倍量的95％乙醇提取2次，其中，第1次提取2小时，第2次提取1.5小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，备用；

步骤(3)中将步骤(2)醇提后的丹参药渣挥干乙醇后，优选的，每次用4倍量的70％乙醇提取3次，其中，第1次提取1小时，第2次、第3次各提取0.5小时；

优选的，步骤(3)中将浓缩液pH值调至3.0后再进行静置和离心；

步骤(3)中将浓缩液浓度调整为0.1-0.3g生药/ml，再调pH值至3.0，静置、离心，取上清液，然后上大孔树脂D301、大孔树脂D101或聚酰胺树脂进行吸附，其中，药材与树脂比为1∶2-4，吸附时间为8-24h；优选的，步骤(3)中将浓缩液浓度调整为0.3g生药/ml，再调pH值至3.0，静置、离心，取上清液，然后上D101树脂柱进行吸附，其中，药材与树脂比为1∶3，吸附时间为24h；

步骤(3)中吸附完成后，优选的，先用水进行冲洗，弃取冲洗液，用30-70％乙醇洗脱、洗脱流速为树脂体积的0.1-0.6BV/h、洗脱液用量为树脂体积的8.0-12.0BV；优选的，先用树脂体积6.0BV的水进行冲洗，弃取冲洗液，再用树脂体积8.0BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为树脂体积的0.3-0.4B V/h；

步骤(4)中三七粉碎后，优选的，用70％乙醇提取3次，每次均提取1.5小时，加醇量均为药材的4倍量；

步骤(4)中将滤液通过预处理好的D101树脂柱，其中，上柱药液浓度为0.1-0.6g生药/ml，药材与树脂比为1∶1-3，吸附时间为8-24h；优选的，上柱药液浓度为0.4g生药/ml，药材与树脂比为1∶3，吸附时间为8h；

步骤(4)中吸附完成后，优选的，先用水冲洗，弃取冲洗液；再用树脂体积的8-12 BV的30-70％乙醇洗脱，洗脱液流速为树脂体积的0.1～0.6BV/h；优选的，吸附完成后，先用树脂体积5.0BV的水冲洗，弃取冲洗液；再用树脂体积的8.0 BV的50％乙醇洗脱，洗脱液流速为树脂体积的0.3～0.4BV/h；

步骤(5)中将合并后的药液浓缩成60℃测定时相对密度为1.15～1.40的稠膏，优选为60℃测定时相对密度为1.25～1.30的稠膏；

步骤(6)中，所述的基质优选由聚乙二醇4000和聚乙二醇6000按照1∶5-7的重量比例组成，更优选为，由聚乙二醇4000和聚乙二醇6000按照1∶7的重量比例组成；所述药膏与基质的重量比例优选为1∶1.5-2.5，更优选为1∶2；所述的保温优选在80℃温度下保温；在滴制成型时所用的冷却剂优选为二甲基硅油、植物油或液体石蜡，优选为二甲基硅油。

本发明进行了一系列的正交试验，对该滴丸剂的制备工艺进行了优选，优化和筛选出各个工艺阶段的最佳工艺条件或参数，所制备的滴丸剂在有效成分的含量、生物利用度等方面都有了显著提升，在治疗冠心病心绞痛的疗效上也有明显提高。

附图说明

图1本发明冠心丹参滴丸的最佳制备工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1  滴丸剂的制备

按以下重量称取各原料药：丹参1600g，三七1600g，降香油14g(或14ml)；

将丹参粉碎成细颗粒，用95％醇提取2次，加醇量均为药材的4倍量，第一次提取2小时、第二次提取1.5小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，得药液1，备用；

丹参药渣挥干乙醇，再用70％乙醇提取3次，加醇量均为药材的4倍量，第一次提取1小时，第二、三次均提取0.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至约5300ml(0.3g生药/ml)，用10％盐酸调pH至3.0，静置，离心去沉淀，取上清液，通过D101树脂柱(药材与树脂比1∶3；流速为树脂体积的1.0～2.0BV/h)，上样吸附24h。吸附后先用6倍量树脂体积的水冲洗，弃取，再用70％乙醇洗脱，洗脱液用量为树脂体积的8倍量，流速为树脂体积的(0.3～0.4BV/h)，收集洗脱液，减压回收乙醇，得药液2，备用；

三七粉碎成细颗粒，用70％乙醇提取3次，每次均提取1.5小时，加醇量均为药材的4倍量，滤过，合并滤液，回收乙醇，并继续浓缩至约4000ml(0.4g生药/ml)，放置过夜，滤过，通过预处理好的D101树脂柱(药材与树脂比1∶3；流速为树脂体积的1.0～2.0BV/h)，上样吸附8h。吸附后先用5倍量树脂体积的水冲洗，弃取，再用50％乙醇洗脱，洗脱液用量为树脂体积的8倍量，流速为树脂体积的(0.3～0.4BV/h)，收集洗脱液，减压回收乙醇，得药液3，备用。

将上述三种药液合并，并继续浓缩至(相对密度1.25～1.30，60℃测)，备用；将聚乙二醇4000与聚乙二醇6000(1∶7)适量，在水浴上加热至全部熔融后加入上述稠膏(药膏与基质比1∶2)，搅匀，再加入降香油，混合均匀，密闭并保温在80℃，用定量泵滴丸机以30丸/分的滴速滴制，冷却剂为二甲基硅油。将成型的滴丸沥尽冷却剂，即得。

实施例2

按以下重量称取各原料药：丹参1600g，三七1600g，降香油14g(或14ml)；将丹参粉碎成细颗粒，用95％醇提取2次，加醇量均为药材的5倍量，每次提取70分钟，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，得药液1，备用；

丹参药渣挥干乙醇，再用8倍量的水煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩，通过预处理好的大孔吸附树脂柱D101，水洗至洗脱液无色，然后用80％乙醇洗脱，洗至近无色，收集80％乙醇洗脱液，浓缩，得药液2，备用；

三七粉碎成细颗粒，用4倍量的70％乙醇加热回流提取3次，每次提取1.5小时，滤过，合并滤液，回收乙醇至无醇味，加入适量水，放置过夜，抽滤，滤液通过预处理好的D101树脂柱，上样吸附；吸附后先用水冲洗至洗脱液无色，弃取，再用50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，浓缩，得药液3，备用；

将药液1、2和3合并，并继续浓缩至稠膏(相对密度1.15～1.20，60℃测)，备用；将聚乙二醇4000与聚乙二醇6000(1∶5)适量，在水浴上加热至全部熔融后加入上述稠膏(药膏与基质比1∶2.4，搅匀，再加入降香油，混合均匀，密闭并保温在85℃，用定量泵滴丸机以30丸/分的滴速滴制，冷却剂为二甲基硅油。将成型的滴丸沥尽冷却剂，即得。

实施例3

按以下重量称取各原料药：丹参1600g，三七1600g，降香油14g(或14ml)；将丹参粉碎成细颗粒，用95％醇提取2次，加醇量均为药材的4倍量，第一次提取2小时、第二次提取1.5小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，得药液1，备用；

丹参药渣挥干乙醇，再用4倍量的50％乙醇提取3次，第一次提取1小时，第二、三次各提取0.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至约5300ml(0.3g生药/ml)，用10％盐酸调pH至3.0，静置，离心去沉淀，取上清液，通过D101树脂柱(药材与树脂比1∶2；流速为树脂体积的1.0-2.0BV/h)，上样吸附24h；吸附后先用6倍量树脂体积的水冲洗，弃取，再用50％乙醇洗脱，洗脱液用量为树脂体积的10倍量，流速为树脂体积0.6BV/h，，收集洗脱液，减压回收乙醇，得药液2，备用；

三七粉碎成细颗粒，用70％乙醇提取3次，每次均提取1.5小时，加醇量均为药材的4倍量，滤过，合并滤液，回收乙醇，并继续浓缩至约4000ml(0.4g生药/ml)，放置过夜，滤过，通过预处理好的D101树脂柱(药材与树脂比1∶3；流速为树脂体积的1.0～2.0BV/h)，上样吸附8h；吸附后先用5倍量树脂体积的水冲洗，弃取，再用50％乙醇洗脱，洗脱液用量为树脂体积的8.0BV，流速为树脂体积的0.3～0.4BV/h，收集洗脱液，减压回收乙醇，得药液3，备用；

将药液1、药液2和药液3合并，并继续浓缩至稠膏(相对密度1.35～1.40，60℃测)，备用；将聚乙二醇4000与聚乙二醇6000(1∶6)适量，在水浴上加热至全部熔融后加入上述稠膏(药膏与基质比1∶2.5)，搅匀，再加入降香油，混合均匀，密闭并保温在80℃，用定量泵滴丸机以30丸/分的滴速滴制，冷却剂为二甲基硅油。将成型的滴丸沥尽冷却剂，即得。

试验例1  本发明中药组合物滴丸剂的制备工艺优选试验

1、丹参的最佳提取工艺试验

丹参中的主要有效成分有脂溶性成分和水溶性成分两大部分。脂溶性部分主要是丹参酮类：包括丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I、二氢丹参酮等成分，其中丹参酮IIA是丹参中脂溶性化合物的代表成分。药理研究表明丹参酮IIA具有抗血小板聚集作用，抗血栓作用和对实验性心肌缺血何灌注损伤具有保护作用；

水溶性部分主要是丹参酚酸类：包括丹酚酸A～C、迷失香酸及其甲酯、丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸等。丹酚酸B是丹参中水溶性化合物的代表成分。药理研究表明丹参酚酸类成分具有抗血小板聚集作用，抗血栓形成作用、改善微循环作用、抗氧化损伤作用和多途径发挥心肌保护作用。为了确保有效成分提取完全，故把脂溶性部分和水溶性部分分别提取出来入药，以确保质量及疗效。

(1)脂溶性部分的提取工艺

①醇浓度的确定

以丹参中脂溶性的主要成分丹参酮IIA的含量为考察指标，采用高效液相色谱法测定不同浓度乙醇对丹参酮II A提取的影响。查阅文献得，此类化合物更易溶解于高浓度醇中及提取时间一般在2小时左右最好，时间不宜过长，因此本发明选取75％、85％、95％浓度的乙醇来进行试验，在加醇量、提取次数及提取时间相同的条件下进行试验。

丹参酮II A含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(75∶25)为流动相；检测波长270nm。理论板数按丹参酮II A峰计算应不低于4000。

供试品溶液的制备：取丹参细颗粒50g，平行两份，分别加入不同浓度的乙醇，每次加醇量均为药材量的4倍，提取二次，每次均为1小时，合并提取液，蒸干，残渣分别用不同浓度乙醇定容至250ml量瓶中，摇匀，再精密吸取提取液1ml至25ml量瓶中，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取精密称取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的丹参酮IIA对照品适量，加甲醇制成每1ml含35.6μg溶液，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取供试品溶液10μl与对照品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果见表1。

表1.醇浓度测定表(n＝2)

结果表明，用95％乙醇提取的丹参液中所含丹参酮IIA的含量较高，故采用95％乙醇提取。

②最佳提取工艺的确定

在确定了醇浓度的基础上，再以加醇量、提取时间和提取次数为影响因素，全面考察醇提丹参酮IIA工艺的条件，每个因素选三个水平，如表2。

表2.正交试验因素水平表

按L₉(3⁴)正交表分别进行试验，以丹参中所含丹参酮IIA的含量为指标进行考察，确定最佳的提取工艺。具体方法：分别取丹参50g，共9份(n＝2)，以表2中所列的因素水平，L₉(3⁴)正交试验条件提取后，滤过，滤液浓缩并定容至250ml量瓶中，摇匀，再精密吸取此溶液1ml至25ml量瓶中加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。按丹参酮II A含量测定项下方法操作，测定，计算，即得。结果见下表3、4。

表3.正交试验结果(n＝2)

表4.方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	显著性P
						A	0.011756	2	0.005878	3.97	P＞0.05
B	0.075289	2	0.037644	25.47	P＜0.05
						C	0.019756	2	0.009878	6.68	P＞0.05
D(误差)	0.002956	2	0.001478	1

查F表，F_0.10(2，2)＝9.0；F_0.05(2，2)＝19.0；F_0.01(2，2)＝99.0

上述方差分析结果表明：因素B对试验结果具有显著性影响，因素B以K₁最大，所以选择K₁，因素A与因素C的试验结果均没有显著性差异，为了节省能源及资源，因此因素A选择K₁，因素C选择K₂即可。从试验中得出最佳提取工艺为：A₁B₁C₂，即用95％醇提取2次，加醇量均为药材的4倍量，提取时间分别为2、1.5小时。

③最佳工艺验证

分别取丹参50g，共3份(n＝2)，按最佳提取工艺提取，即用95％醇提取2次，加醇量均为药材的4倍量，第一次提取2小时，第二次提取1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩并定容至250ml量瓶中，摇匀，再精密吸取此溶液1ml至25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。按丹参酮II A含量测定项下方法操作，测定，计算，即得。结果见下表5。

表5.最佳工艺验证表(n＝2)

结果表明，用95％醇提取2次，加醇量均为药材的4倍量，第一次提取2小时，第二次提取1.5小时，为最佳工艺。

(2)水溶性部分的提取工艺

丹参中水溶性酚酸类，呈弱酸性，溶于水、醇、丙酮、乙酸乙酯等溶剂中。但在水溶液中对热不稳定，而丹酚酸B在乙醇中稳定性较强。

①醇浓度的确定

以丹参中水溶性的主要成分丹酚酸B的含量为考察指标，采用高效液相色谱法测定不同浓度乙醇对丹酚酸B提取的影响。查阅文献得，此类化合物溶解于醇中及水中，提取时间一般在1小时左右最好，时间不宜过长，因此我们选取水、30％、50％、70％浓度的乙醇来进行试验，在加醇量、提取次数及提取时间相同的条件下进行试验。

丹酚酸B含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶59∶1)为流动相；检测波长286nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备：取精密称取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成每1ml含0.187mg的溶液，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取供试品溶液10～15μl与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果见表1。

供试品溶液的制备：

具体方法：取丹参50g，(n＝2)，先用95％乙醇提取脂溶性成分后，挥干乙醇，再分别用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇提取2次，每次加醇量均为药材的3倍量，每次1小时，合并提取液，浓缩并定容至250ml量瓶中，精密吸取此液5ml，置250ml量瓶中，加75％乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按丹酚酸B含量测定项下方法操作，测定，计算，即得。结果见下表6。

表6.醇浓度测定表

结果表明，95％醇也可提出少量的丹酚酸B，70％乙醇提取液中所含的丹酚酸B含量最高，故采用95％醇提后再用70％乙醇提取是可行的。

②最佳提取工艺的确定

在确定了纯浓度的基础上，再以加醇量、提取时间和提取次数为影响因素，全面考察醇提部分工艺条件，每个因素选三个水平，如表7。

表7.正交试验因素水平表

按L₉(3⁴)正交表分别进行试验，以丹参中所含丹酚酸B的量为指标进行考察确定最佳的提取工艺。具体方法：取丹参50g，共9份(n＝2)，以表7中所列的因素水平，L₉(3⁴)正交试验条件提取后，滤过，滤液浓缩并定容至250ml量瓶中，精密吸取此溶液5ml，置150ml量瓶中，加75％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。按丹酚酸B含量测定项下方法进行测定，计算，即得。测定结果见表8、9。

表8.正交试验结果(n＝2)

表9.方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	显著性P
						A	6.814289	2	3.407144	8.90	P＞0.05
B	21.33376	2	10.66688	27.87	P＜0.05
						C	2.608156	2	1.304078	3.41	P＞0.05
D(误差)	0.765422	2	0.382711	1

F_0.10(2，2)＝9.0；F_0.05(2，2)＝19.0；F_0.01(2，2)＝99.0

上述方差分析结果表明：因素B对试验结果具有显著性影响，因素B以K₃最大，所以我们选择K₃。因素A与因素C的试验结果均没有显著性差异，为了节省能源及成本，因素A选择K₁，因素C选择K₃即可。从试验中得出最佳提取工艺为：A₁B₃C₃，即用70％乙醇提取3次，每次加醇量均为药材的4倍量，第一次提取1小时，第二、三次各提取0.5小时。

③最佳工艺验证

取丹参粗颗粒50g，(n＝2)，先用95％乙醇提取脂溶性成分后，挥干乙醇，再用70％乙醇提取3次，每次加醇量均为药材的4倍量，第一次提取1小时，第二、三次均提取0.5小时，合并提取液，浓缩并定容至250ml量瓶中，精密吸取此液5ml，置150ml量瓶中，加75％乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按丹酚酸B含量测定项下方法操作，测定，计算，即得。结果见下表10。

表10.最佳工艺验证表

结果表明，此提取工艺可行，即先用95％乙醇提取脂溶性成分后，挥干乙醇，再用70％乙醇提取3次，每次加醇量均为药材的4倍重量，第一次提取1小时，第二、三次均提取0.5小时，为最佳工艺。

(3)纯化工艺

由于丹参水溶性部分出膏量太大，为减少服用量和提高疗效，需要进一步精致纯化，经查阅大量文献，将丹参水溶性部分通过上树脂柱，分离出主要有效成分，以丹酚酸B为主的丹参酚酸类成分，故先初步选择树脂种类，以大孔树脂D301、大孔树脂D101及聚酰胺树脂分离丹酚酸B进行考察筛选研究。

丹参提取液的制备：取丹参粗颗粒50g，先用95％乙醇提取脂溶性成分后，挥干乙醇，再用70％乙醇提取3次，每次加醇量均为药材的4倍量，第一次提取1小时，第二、三次各提取0.5小时，合并提取液，浓缩并定容至250ml量瓶中，即得。

①树脂的优选

具体方法：精密吸取丹参提取液5ml各2份，水浴蒸干，再加10ml水使溶解，分别加入预先处理好的(10g)D301、D101及聚酰胺树脂柱上，分别用水洗、50％乙醇各100ml淋洗，收集洗脱液定溶至150ml量瓶中，测定丹酚酸B含量，计算即得。见下表。

表11.不同树脂吸附丹酚酸B测定表

结果表明，D101型大孔树脂吸附丹酚酸B含量较高，故选用D101大孔树脂作为分离丹酚酸B的树脂。

②上柱条件优选

由于丹参酚酸类易溶于碱性溶液，故将上样液酸化后，降低溶解度，增强吸附能力，以提高含量。现以对上样液pH值大小进行考察，以丹酚酸B含量为考核指标进行优选。

具体方法：精密吸取丹参提取液5ml各2份，水浴蒸干，再加10ml水使溶解，用10％盐酸分别调pH值为2、3、4，放置，过滤。分别加入预先处理好的D101(10g)树脂柱上，先用水100ml洗脱，弃取，再用50％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液定溶至150ml量瓶中，测定丹酚酸B含量，计算即得。见表12。

表12.不同pH值对丹酚酸B的影响

结果表明，上样液pH值为3时的含量最高，能比原药液上柱提高一倍，故把上样液pH值定为3。

③D101树脂吸附工艺

在确定了树脂及药液酸碱度的基础上，再以药材树脂比、药液浓度、上样时间为影响因素，全面考察树脂吸附工艺的条件，每个因素选三个水平，如表13。

表13.醇提正交试验因素水平表

因素水平	药液浓度(g/ml)A	上样时间(h)B	药材∶树脂C	误差D
					1	0.1	8	1∶1
2	0.3	12	1∶2
					3	0.5	24	1∶3

按L₉(3⁴)正交设计表分别进行试验，以丹参中所含丹酚酸B的量为指标进行考察，确定最佳的吸附工艺。具体方法：精密吸取丹参提取液15ml各2份，水浴蒸干，再用不同用量的水溶解，使药液浓度分别为0.1g/ml、0.3g/ml、0.5g/ml，分别用10％盐酸调pH至3.0，静置，过滤，即得上样液。以表7中所列的因素水平，L₉(3⁴)正交试验条件上柱，分别加入预先处理好的D101树脂柱上，先用水100ml洗脱，弃取，再用50％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用75％乙醇定溶至25ml量瓶中，再精密吸取此溶液1ml置25ml量瓶中，用75％乙醇稀释至刻度，即得。测定丹酚酸B含量，计算即得。测定结果见表14、15。

表14.正交试验结果(n＝2)

表15.方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	显著性P
						A	1.623489	2	0.811744	1.67	P＞0.05
B	2.897756	2	1.448878	2.98	P＞0.05
						C	38.62709	2	19.31354	39.76	P＜0.05
D(误差)	0.971356	2	0.485678	1

F0.10(2，2)＝9.0；F0.05(2，2)＝19.0；F0.01(2，2)＝99.0

上述方差分析结果表明：因素C对试验结果具有显著性影响，因素C以K₃最大，所以我们选择K₃。因素A与因素B的试验结果均没有显著性差异，为了节省能源及成本，因素A我们选择K₂，因素B中以K₃最大，因此选择K₃。因此最佳吸附参数为：A₂B₃C₃，即上样药液浓度为0.3g/ml、上样吸附24h、药材与树脂比1∶3。

④D101树脂解吸工艺

在确定了吸附工艺参数的基础上，再以乙醇浓度、洗脱速度、洗脱液用量为影响因素，全面考察树脂解吸工艺的条件，每个因素选三个水平，如表16。

表16.醇提正交试验因素水平表

因素水平	乙醇浓度A	洗脱速度(BV/h)B	洗脱液用量(BV)C	误差D
					1	30	0.5～0.6	8
2	50	0.3～0.4	10
					3	70	0.1～0.2	12

按L₉(3⁴)正交设计表分别进行试验，以丹参中所含丹酚酸B的量为指标进行考察，确定最佳的解吸工艺。具体方法：分别精密吸取丹参提取液15ml各2份，蒸干，加10ml水溶解，用10％盐酸调pH至3.0，静置，过滤，即得上样液。以最佳吸附工艺参数配比，即上柱药液浓度为0.3g/ml、上样吸附24h、药材树脂比1∶3。按表7中所列的因素水平，L₉(3⁴)正交试验条件进行，先用6倍量柱体积的水冲洗，弃取，再分别用30％、50％、70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，用75％乙醇定溶至25ml量瓶中，再精密吸取此溶液1ml置25ml量瓶中，用75％乙醇稀释至刻度，即得。测定丹酚酸B含量，计算即得。测定结果见表17、18。

表17.正交试验结果(n＝2)

表18.方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	显著性P
						A	75.71682	2	37.85841	21.48	P＜0.05
B	9.684356	2	4.842178	2.74	P＞0.05
						C	28.76082	2	14.38041	8.16	P＞0.05
D(误差)	3.524422	2	1.762211	1

F_0.10(2，2)＝9.0；F_0.05(2，2)＝19.0；F_0.01(2，2)＝99.0

上述方差分析结果表明：因素A对试验结果具有显著性影响，因素A以K₃最大，所以我们选择K₃。因素B与因素C的试验结果均没有显著性差异，为了节省能源及成本，因素B我们选择K₂，C因素选择K₁即可。因此最佳吸附参数为：A₃B₂C₁，即用70％乙醇洗脱、流速为树脂体积0.3～0.4BV/h、洗脱液用量为树脂体积的8.0BV。

⑤纯化工艺验证

精密吸取丹参提取液15ml各2份，蒸干，加10ml水溶解(0.3g生药/ml)，用10％盐酸调pH至3.0，离心，取上清液，加入D101树脂柱(药材树脂比1∶3)，上样吸附24h。吸附后先用6倍量柱体积的水冲洗，弃取，再70％乙醇洗脱，洗脱液用量为树脂体积的8倍量，流速为树脂体积的(0.3～0.4BV/h)，收集洗脱液，蒸干，用75％乙醇定溶至25ml量瓶中，再精密吸取此溶液1ml置25ml量瓶中，用75％乙醇稀释至刻度，即得。测定丹酚酸B含量，计算即得。测定结果见表19。

表19纯化最佳工艺验证

结果表明，丹参纯化工艺是可行的。

3、三七的提取工艺

三七具有散瘀止痛，消肿定痛等的功效，用于冠心病心绞痛的治疗，其中三七总皂苷为主要有效成分，易溶于乙醇，故采用乙醇提取。

①醇浓度的确定

以三七药材中的主要成分三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁，人参皂苷Rb₁的总量为考察指标，采用高效液相色谱法测定不同浓度乙醇对三七总皂苷提取率的影响。因此我们选取50％、70％、90％浓度的乙醇来进行试验，在加醇量、提取次数及提取时间相同的条件下进行试验。

三七含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A；以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长203nm。理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～12	19	81
12～60	19→34	81→66
			60～70	34→19	66→81

对照品溶液的制备：取精密称取人参皂苷Rg₁，人参皂苷Rb₁对照品和三七皂苷R₁对照品适量，加甲醇制成每1ml人参皂苷Rg₁0.21mg、人参皂苷Rb₁0.154mg、三七皂苷R₁0.038mg的混合溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取三七粗颗粒50g，(n＝2)，分别加入不同浓度的乙醇，每次加醇量均为药材量的4倍，提取二次，每次均为1小时，合并提取液，蒸干，残渣分别用不同浓度乙醇定容至250ml量瓶中，摇匀，再精密吸取提取液15ml至100ml量瓶中，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取供试品溶液10μl与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果见表20。

表20.醇浓度测定表(n＝2)

结果表明，用70％乙醇提取的三七液中所含三七总皂苷的含量较高，故采用70％乙醇提取。

②最佳提取工艺的确定

在确定了醇浓度的基础上，再以加醇量、提取时间和提取次数为影响因素，全面考察醇提三七工艺的条件，每个因素选三个水平，如表21。

表21.正交试验因素水平表

按L₉(3⁴)正交表分别进行试验，以三七中所含人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁和三七皂苷R₁的总和为指标进行考察，确定最佳的提取工艺。具体方法：分别取三七50g，共9份(n＝2)，以表2中所列的因素水平，L₉(3⁴)正交试验条件提取后，滤过，滤液浓缩并定容至250ml量瓶中，摇匀，再精密吸取此溶液15ml至100ml量瓶中加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。按三七含量测定项下方法操作，测定，计算，即得。结果见下表22、23。

表22.正交试验结果(n＝2)

表23.方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	显著性P
						A	7.814067	2	3.907033	1.95	P＞0.05
B	27.5522	2	13.7761	6.87	P＞0.05
						C	160.8209	2	80.41043	40.14	P＜0.5
D(误差)	4.006467	2	2.003233	1

查F表，F_0.10(2_{，2)＝9.0；F0.05}(2，2)＝19.0；F_0.01(2，2)＝99.0

上述方差分析结果表明：因素C对试验结果具有显著性影响，因素C以K₃最大，所以我们选择K₃，因素A与因素B的试验结果均没有显著性差异，为了节省能源及资源，因此因素A我们选择K₁，因素B我们选择K₂即可。从试验中得出最佳提取工艺为：A₁B₂C₃，即用70％醇提取3次，加醇量均为药材的4倍量，提取时间均为1.5小时。

(3)三七纯化工艺

由于三七醇提后出膏量太大，为减少服用量和提高疗效，需要进一步精致纯化，经查阅文献，将三七醇提后，采用D101树脂分离纯化三七皂苷，分离出三七总皂苷主要有效成分，以是较成熟的工艺，但其中的最佳工艺参数需要进一步考察。我们将D101树脂吸附与解吸工艺分两部分进行考察，方法如下：

①D101树脂吸附三七工艺

在确定了醇提工艺的基础上，再以药材树脂比、药液浓度、上样时间为影响因素，全面考察树脂吸附工艺的条件，每个因素选三个水平，如表24。

表24.醇提正交试验因素水平表

因素水平	药液浓度(g/ml)A	药材∶树脂B	上样时间(h)C	误差D
					1	0.2	1∶1	8
2	0.4	1∶2	12
					3	0.6	1∶3	24

按L₉(3⁴)正交设计表分别进行试验，以三七中所含人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁和三七皂苷R₁的总和为指标进行考察，确定最佳的吸附工艺。具体方法：精密吸取同批按最佳提取工艺提取的三七液15ml各2份，水浴蒸干，不同用量的水溶解，以表7中所列的因素水平，L₉(3⁴)正交试验条件上柱，分别加入预先处理好的D101树脂柱上，先用水100ml洗脱，弃取，再用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇定溶至25ml量瓶中，再精密吸取此溶液5ml置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。测定人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁和三七皂苷R₁的总和，计算即得。测定结果见表25、26。

表25.正交试验结果(n＝2)

表26.方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	显著性P
						A	2.721689	2	1.360844	2.07	P＞0.1
B	17.66109	2	8.830544	13.47	P＜0.1
						C	2.282822	2	1.141411	1.74	P＞0.1
D(误差)	1.310556	2	0.655278	1

F_0.10(2，2)＝9.0；F_0.05(2，2)＝19.0；F_0.01(2，2)＝99.0

上述方差分析结果表明：因素B试验结果具有显著性影响，因素B以K₃最大，所以我们选择K₃。因素A与因素C的试验结果均没有显著性差异，为了节省能源及成本，因素A我们选择K₂，因素C选择K₁即可。因此最佳吸附参数为：A₂B₃C₁，即上柱药液浓度为0.4g生药/ml、药材与树脂比为1∶3、吸附时间为8h。

②D101树脂解吸三七工艺

在确定了吸附工艺参数的基础上，再以乙醇浓度、洗脱速度、洗脱液用量为影响因素，全面考察树脂解吸工艺的条件，每个因素选三个水平，如表27。

表27.解吸正交试验因素水平表

因素水平	乙醇浓度(％)A	洗脱速度(BV/h)B	洗脱液用量(BV)C	误差D
					1	30	0.5～0.6	8
2	50	0.3～0.4	10
					3	70	0.1～0.2	12

按L₉(3⁴)正交设计表分别进行试验，以三七中所含人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁和三七皂苷R₁的总和为指标进行考察，确定最佳的吸附工艺。具体方法：精密吸取同批按最佳提取工艺提取的三七液15ml各2份，水浴蒸干，水溶解成(0.4g生药/ml)、分别加入预先处理好的D101树脂柱上(药材与树脂比为1∶3)、吸附8h后，先用水100ml洗脱，弃取。再以表7中所列的因素水平，L₉(3⁴)正交试验条件进行解吸，收集洗脱液，蒸干，用甲醇定溶至25ml量瓶中，再精密吸取此溶液5ml置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。测定人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁和三七皂苷R₁的总和，计算即得。测定结果见表28、29。

表28.正交试验结果(n＝2)

表29.方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	显著性P
						A	118.2958	2	59.14788	14.88	P＜0.1
B	11.13682	2	5.568411	1.40	P＞0.1
						C	18.59582	2	9.297911	2.33	P＞0.1
D(误差)	7.949422	2	3.974711	1

F_0.10(2，2)＝9.0；F_0.05(2，2)＝19.0；F_0.01(2，2)＝99.0

上述方差分析结果表明：因素A对试验结果具有显著性影响，但因素A中K₂与K₃相差不大，所以我们选择K₂。因素B与因素C的试验结果均没有显著性差异，为了节省能源及成本，因素B我们选择K₂，因素C选择K₁。因此最佳吸附参数为：A₂B₂C₁，即用50％乙醇洗脱、流速为树脂体积0.3～0.4BV/h、洗脱液用量为树脂体积的8.0BV。

(四)分离、纯化、浓缩工艺研究

1、滤过方法：

减压(或加压)滤过，药渣与提取液的滤过我们选用200目尼龙筛网为滤材。

2、浓缩方法：

我们均采用温度低、速度快的减压浓缩方法。对于浓缩程度，我们把握的原则是将浓缩液能从浓缩罐中顺利倒出时的最大相对密度，经测定为1.25～1.30(60℃)，不同浓度稠膏的流动性考察结果见表30。

表30.不同浓度稠膏的流动性考察

稠膏相对密度(60℃)	1.20	1.26	1.32	1.38	1.40
						流动性(60℃)	好	好	好	较好	不好

(1)出膏量的考察：

取倍处方量，即丹参1600g、三七1600g。按处方工艺提取工艺提取，浓缩至1.20～1.25(60℃)时测定。提取物出膏量见表31。

表31.丹参提取物的出膏量

表32.三七提取物的出膏量

五、制剂成型工艺的研究

(一)滴丸制备条件的选择

1、基质的选择

中药滴丸中大多选用水溶性基质以聚乙二醇6000(PEG6000)和聚乙二醇4000(PEG4000)最为常用。聚乙二醇类聚合物当分子量大于1000时，呈固态，PEG6000与PEG4000的熔点分别为54～60℃、48～53℃。其本身无生理作用，化学稳定性较好，易溶于水，可用以从中释放水溶性或油性药物，对药物有助溶作用，同时还能容纳部分液体，此基质能发挥速效作用，是目前较为理想的一类水溶性基质。

本试验分别以PEG4000、PEG6000及明胶为基质，进行成型基质选择。

具体方法：分别取PEG4000、PEG6000及明胶，按药物与基质比初步定为1∶2的配比，水浴熔融，再分别加入提取物，提取物相对密度为1.25～1.30(60℃)，混匀，药液温度保持80℃，滴入二甲基硅油中，三种基质成型状况见下表。

表33基质的选择(n＝2)

结果表明，PEG6000对滴丸成型较好，故首选PEG6000作为成型基质，但就滴丸的硬度和流动性均不理想，可加入少量的PEG4000以做调整。

将PEG4000与PEG6000的配比进行优选，选用三种比例，即PEG4000与PEG6000比为1∶5，1∶6，1∶7；药物与基质比初步定为1∶2的配比，水浴熔融，再分别加入提取物，提取物相对密度为1.25～1.30(60℃)，混匀，药液温度保持80℃，滴入二甲基硅油中，结果见下表。

表34PEG4000与PEG6000的配比选择(n＝2)

结果表明，PEG4000与PEG6000的最佳配比为1∶7。

2、成型工艺条件优选

在确定了基质的基础上，再以提取物与基质的配比，提取物密度、冷却剂种类以及滴制温度等条件为影响因素，全面成型工艺的条件，每个因素选三个水平，如表35。

表35.成型因素水平表

因素         提取物密度        提取物∶基质      冷却剂     滴制温度(℃)

水平         (60℃)            B                 C          D

             A

1            1.15～1.20        1∶1.5            液体石蜡   75

2            1.25～1.30        1∶2              植物油     80

3            1.35～1.40        1∶2.5            二甲基硅油 85

按L₉(3⁴)正交设计表分别进行试验，以滴制程度，丸形、沉降状况及成丸的溶散时间为指标进行考察，选择最佳成型条件。具体方法：将PEG4000与PEG6000(1∶7)的基质配比，以表7中所列的因素水平，L₉(3⁴)正交试验条件进行试验。将基质在水浴上加热至全部熔融后加入上提取物，搅匀，再加入降香油，混合均匀，密闭并保持一定温度，滴入冷却剂中，观察成型情况。结果见表36。

结果表明，最佳配比是A₂B₂C₃D₂，即提取物密度为1.25～1.30，(60℃)；提取物与基质的比为1∶2；滴制温度影响不大，故选80℃，冷却剂为二甲基硅油。

Claims (10)

1、一种制备冠心丹参滴丸的方法，包括：

(1)按以下重量份称取各原料药：丹参1600份，三七1600份，降香油14份；

(2)丹参用75-95％乙醇提取，提取液滤过，滤液减压回收乙醇，得药液1，备用；

(3)将步骤(2)乙醇提取后的丹参药渣挥干乙醇，再用水或30-70％乙醇提取，提取液滤过，滤液浓缩，浓缩液静置，离心，取上清液用树脂柱吸附；吸附完成后先用水冲洗，弃取冲洗液，再用30-70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得药液2，备用；

(4)三七粉碎后用50-90％乙醇提取，提取液滤过，滤液回收乙醇，浓缩，浓缩液放置过夜，滤过，滤液通过预处理好的树脂柱，上样吸附；吸附完成后先用水冲洗，弃取冲洗液，再用30-70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得药液3，备用；

(5)将药液1、药液2和药液3合并，合并后的药液浓缩成稠膏，备用；

(6)将稠膏与熔融后的基质搅匀，再加入降香油，混合均匀，密闭保温，滴制成型，即得。

2、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(2)中将丹参粉碎后每次用4倍重量的95％乙醇提取2次，其中，第1次提取2小时，第2次提取1.5小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

3、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(3)中将步骤(2)醇提后的丹参药渣挥干乙醇后每次用4倍量的70％乙醇提取3次，其中，第1次提取1小时，第2次、第3次各提取0.5小时。

4、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(3)中将浓缩液pH值调至3.0后再进行静置和离心。

5、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(3)中将浓缩液浓度调整为0.1-0.3g生药/ml，再调pH值至3.0，静置、离心，取上清液，然后上D301大孔树脂、D101大孔树脂或聚酰胺树脂进行吸附，其中，药材与树脂的比为1∶2-4，吸附时间为8-24h；优选的，步骤(3)中将离心后上清液上D101树脂柱进行吸附，其中，药材与树脂的比为1∶3，吸附时间为24h。

6、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(3)中吸附完成后，先用水进行冲洗，弃取冲洗液，用30-70％乙醇洗脱；其中，洗脱液流速为树脂体积的0.1-0.6BV/h，洗脱液用量为树脂体积的8.0-12.0BV；优选的，步骤(3)中吸附完成后，先用树脂体积6.0BV的水进行冲洗，弃取冲洗液，再用树脂体积8.0BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为树脂体积的0.3-0.4BV/h。

7、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(4)中三七粉碎后用70％乙醇提取3次，每次均提取1.5小时，加醇量均为药材的4倍量。

8、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(4)中将滤液通过预处理好的D101树脂柱，其中，上柱药液浓度为0.2-0.6g生药/ml，药材与树脂的比1∶1-3，吸附时间为8-24h；优选的，上柱药液浓度为0.4g生药/ml，药材与树脂的比1∶3，吸附时间为8h。

9、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(4)中吸附完成后先用水冲洗，弃取冲洗液；再用树脂体积的8-12BV的30-70％乙醇洗脱，洗脱液流速为树脂体积的0.1～0.6BV/h；优选的，步骤(4)中吸附完成后先用树脂体积5.0BV的水冲洗，弃取冲洗液；再用树脂体积的8.0BV的50％乙醇洗脱，洗脱液流速为树脂体积的0.3～0.4BV/h。

10、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(5)中将合并后的药液浓缩成60℃测定时相对密度为1.15～1.40的稠膏，优选为浓缩成60℃测定时相对密度为1.25～1.30的稠膏；步骤(6)中，所述的基质由聚乙二醇4000和聚乙二醇6000按照1∶5-7的重量比例组成，优选为由聚乙二醇4000和聚乙二醇6000按照1∶7的重量比例组成；所述药膏与基质的重量比例为1∶1.5-2.5，优选为1∶2；所述的保温是在80℃温度下保温；在滴制成型时所用的冷却剂为二甲基硅油、植物油或液体石蜡，优选为二甲基硅油。

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