CN102768247A - 一种治疗冠心病心绞痛药物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种治疗冠心病心绞痛药物的检测方法，该检测方法包括采用高效液相色谱法检测所述药物中的人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re和人参皂苷Rb₁，其中，所述高效液相色谱的条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；采用乙腈溶液为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的过程为：第0-25分钟，流动相A乙腈溶液为15％体积，流动相B水为85％体积；第25-70分钟，流动相A乙腈溶液为15-22％体积，流动相B水为85-78％体积；第70-80分钟，流动相A乙腈溶液为22-30％体积，流动相B水为78-70％体积；第80-105分钟，流动相A乙腈溶液为30-40％体积，流动相B水为70-60％体积；第105-120分钟，流动相A乙腈溶液为40-15％体积，流动相B水为60-85％体积。

Description

一种治疗冠心病心绞痛药物的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗冠心病心绞痛药物的检测方法。

背景技术

心血管疾病为目前发病率最高的四种疾病之一，其中冠心病和心绞痛较为常见。在老年人群中有较高的发病率。随着我国进入老龄化社会，对该类治疗药物的需求也越来越大。

益心舒胶囊(标准号：WS₃-b-2620-97)在治疗冠心病心绞痛方面有好的疗效。其配方如下：人参150g、麦冬150g、五味子100g、黄芪150g、丹参200g、川芎100g、山楂150g。制备方法如下：以上七味，取人参粉碎细粉后备用。五味子、丹参用85％乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.15～1.12(20℃)，得醇浸膏。其余麦冬等加水煎煮2次，第一次2.5小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约500ml，加入等量85％乙醇，充分搅拌后，静置过夜，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.30～1.36(80℃)，得水提浸膏。将上述二种浸膏合并后，加入人参细粉及适量淀粉，混合均匀，制粒，干燥，装胶囊，制成1000粒，即得。该药物具有益气复脉，活血化瘀，养阴生津的作用。用于气阴两虚，心肌脉结代，胸闷不舒、胸痛及冠心病心绞痛见有上述症状者。

在现有的益心舒胶囊的检测方法中，并未考察人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)的含量。为进一步控制该产品的质量，保证检测人员的身体健康，减少环境污染，需要对该产品的检测进行改进，从而更进一步保证该产品的质量和疗效。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种治疗冠心病心绞痛药物的检测方法，该检测方法能够有效控制药物的质量，使药物质量达到稳定、可控、高效及安全的标准，从而更好地满足医疗需要。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。

一种治疗冠心病心绞痛药物的检测方法，该药物由以下重量份的药材制成：

人参100-500重量份，麦冬100-500重量份，五味子100-300重量份，黄芪150-450重量份，丹参200-600重量份，川芎100-300重量份，山楂200-400重量份，微晶纤维素300-500重量份，甘露醇50-200重量份；

该检测方法包括采用高效液相色谱法检测所述药物中的人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re和人参皂苷Rb₁，其中，所述高效液相色谱的条件包括：

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

采用乙腈溶液为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的过程为：第0-25分钟，流动相A乙腈溶液为15％体积，流动相B水为85％体积；第25-70分钟，流动相A乙腈溶液为15-22％体积，流动相B水为85-78％体积；第70-80分钟，流动相A乙腈溶液为22-30％体积，流动相B水为78-70％体积；第80-105分钟，流动相A乙腈溶液为30-40％体积，流动相B水为70-60％体积；第105-120分钟，流动相A乙腈溶液为40-15％体积，流动相B水为60-85％体积。

梯度洗脱(gradient elution)又称为梯度淋洗或程序洗脱。在气相色谱中，为了改善对宽沸程样品的分离和缩短分析周期，广泛采用程序升温的方法。而在液相色谱中则采用梯度洗脱的方法。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子达到良好的分离目的。本发明梯度洗脱的优点：1)缩短分析周期；2)提高分离能力；3)峰型得到改善，很少拖尾；4)增加灵敏度。由于本发明治疗冠心病心绞痛药物中化学成分比较多，采用梯度洗脱能明显体现成分定量。

在上述检测方法中，所述高效液相色谱的条件还包括：柱温为25～40℃，优选为30℃。

在上述检测方法中，所述高效液相色谱的条件还包括：检测波长为203nm；流速为1mL·min^-1。

在上述检测方法中，对照品溶液的制备方法如下：

精密称取人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁对照品适量，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，作为对照品溶液。

在上述检测方法中，供试品溶液的制备方法如下：

取所述药物适量，研细，取约4g，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20m1分次转溶至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取3次，每次15ml，弃去三氯甲烷液，水层用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用0.5％NaOH溶液洗涤4次，每次15ml，合并碱洗液，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗3次，每次15ml，分取正丁醇层，置水浴上蒸干，残渣用20％乙腈溶解，并定容至5ml，作为供试品溶液。

在上述检测方法中，所述药物的制备方法如下：

1)将所述的人参粉成细粉，备用；

2)将所述量的五味子、丹参加入6-12倍体积的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.10-1.35的清膏，备用；

3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加6-12倍体积的水煎煮，煎液滤过，加等体积的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜，得醇沉液；

4)将步骤3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.20-1.40的清膏，备用；

5)将步骤2)和步骤4)所得的清膏合并，加入步骤1)所得人参细粉及300-500重量份的微晶纤维素和50-200重量份甘露醇混匀，制成微丸。

在上述检测方法中，所述药物的制备方法如下：

1)将所述量的人参粉成细粉，备用；

2)将所述量的五味子、丹参加入8倍体积的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.15-1.12的清膏，备用；

3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加8倍体积的水煎煮，煎液滤过，加等量的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜，得醇沉液；

4)将步骤3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.30-1.36的清膏，备用；

5)将步骤2)和步骤4)所得的清膏合并，加入步骤1)所得人参细粉及400重量份的微晶纤维素和100重量份的甘露醇混匀，制成微丸。

在一个具体实施方案中，本发明的检测方法包括如下步骤：

一、色谱条件与系统适用性试验：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A：乙腈，流动相B：水，按下表进行梯度洗脱；检测波长为203nm；柱温：30℃；流速为1mL·min^-1。理论板数按人参皂苷Rg₁峰计算应不低于6000。

二、对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re适量，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，作为对照品溶液。

三、供试品溶液的制备

取治疗冠心病心绞痛的药物(例如宜心舒丸，购自昆明赛诺制药有限公司)适量，研细，取约4g，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml分次转溶至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取3次，每次15ml，弃去三氯甲烷液，水层用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用0.5％NaOH溶液洗涤4次，每次15ml，合并碱洗液，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗3次，每次15ml，分取正丁醇层，置水浴上蒸干，残渣用20％乙腈溶解，并定容至5ml，作为供试品溶液。

四、测定法

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI D)测定，即得。

本品每袋含人参以人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)和人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)的总量计，不得低于1.8mg，以人参皂苷Rb₁(C₅₄H₉₂O₂₃)计，不得低于1.2mg。

本发明的药物药丸直径＜0.05mm，崩解溶化性优，疗效发挥快，且释药稳定，生物利用度高，局部刺激性小，丸剂外观整洁美观，患者乐于服用，吸湿性小，运输、储存、携带等均比较方便。具有益气复脉，活血化瘀，养阴生津的作用。用于气阴两虚，心悸脉结代，胸闷不舒、胸痛及冠心病心绞痛见有上述症状者。采用微晶纤维素和甘露醇作为辅料，吸湿性大大降低，并且口感更好，利于保存和服用。

本发明的检测方法改变了原来检测方法的梯度洗脱条件，增加了柱温的控制，实现了三个组份的有效分离，达到了分析定量的目的，并根据药材含量和制剂处方规定了三组分的含量限值。

附图说明

图1表示采用本发明的检测方法检测实施例1药品的色谱图；

图2表示人参皂苷Rg1线性关系图；

图3表示人参皂苷Re线性关系图；

图4表示人参皂苷Rb1线性关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例1：

本实施例所采用的配方中各组分的重量份如下：

人参     300；

麦冬     300；

五味子   200；

黄芪     300；

丹参     400；

川芎     200；

山楂     300。

本实施例提供益心舒微丸的制备方法如下：

(1)将所述量的人参粉成细粉，备用；

(2)将所述量的五味子、丹参加入8倍体积的85％乙醇回流提取二次，第一次3小时，第二次1.5小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.10-1.35(20℃)的清膏，备用；

(3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加8倍体积的水煎煮二次，第一次2.5小时，第二次1.5小时，合并滤液，滤过，加等体积的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜，得醇沉液；

(4)将步骤(3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.20-1.40(80℃)的清膏，备用；

(5)将步骤(2)和步骤(4)所得的清膏合并，加入步骤(1)所得人参细粉及300重量份的微晶纤维素和100重量份的甘露醇混匀，制成微丸。

本发明所提供的益心舒微丸，药丸直径＜0.05mm，崩解溶化性优，疗效发挥快，且释药稳定，崩解时间约60分钟，生物利用度高，局部刺激性小。丸剂外观整洁美观，患者乐于服用，微丸的临界相对湿度为57％，吸湿性小，运输、储存、携带等均比较方便。

益心舒微丸对室性期前收缩的治疗

方法：将60例室性期前收缩患者随机分为治疗组和对照组，每组30例，治疗组用益心舒微丸加美西律治疗，对照组用美西律治疗，疗程均为4周。用动态心电图(Holter)检测24h内室性期前收缩次数。

结果：入选者性别、年龄、体重及24h室性期前收缩次数差异无统计学意义。用药4周疗效(以Holter为准)比较，治疗组总有效率为96.9％。对照组为73.3％，两组差异有统计学意义(P＜0.01)。

结论：益心舒微丸联合美西律治疗室性期前收缩有显著疗效，比单独用美西律治疗室性期前收缩效果好。

实施例2：

本实施例所采用的配方中各组分的重量份如下：

人参      300；

麦冬      300；

五味子    200；

黄芪      300；

丹参      400；

川芎      200；

山楂      300。

本实施例提供益心舒微丸的制备方法如下：

(1)将所述的人参粉成细粉，备用；

(2)将所述量的五味子、丹参加入6倍体积的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.10(20℃)的清膏，备用；

(3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加6倍体积水煎煮，煎液滤过，加等量的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜，得醇沉液；

(4)将步骤(3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.20(80℃)的清膏，备用；

(5)将步骤(2)和步骤(4)所得的清膏合并，加入步骤(1)所得人参细粉及500重量份的微晶纤维素和200重量份的甘露醇混匀，制成微丸。

本发明所提供的益心舒微丸，药丸直径＜0.05mm，崩解溶化性优，疗效发挥快，且释药稳定，崩解时间约60分钟，生物利用度高，局部刺激性小。丸剂外观整洁美观，患者乐于服用，微丸的临界相对湿度为57％，吸湿性小，运输、储存、携带等均比较方便。

益心舒微丸治疗冠心病80例临床观察

方法：将80例冠心痛病人，分为治疗组和对照组，两组病人第一疗程均口服抗心绞痛、扩冠等西药常规治疗，治疗组加服益心舒胶囊3粒，每日3次，30天为一疗程，观察两组病人治疗前后心绞痛及伴随症状改善情况和心电图变化。

结果：经三个疗程治疗后，治疗组在心绞痛及伴随症状改善情况和心电图变化方面总有效率明显优于对照组。

结论：益心舒有较好的缓解冠心痛病人的心绞痛及伴随症状，扩张冠状动脉，增加心肌收缩力，改善微循环及心肌缺血状况。本发明所提供的微丸治疗冠心痛心绞痛症状，起效较快，有利于快速缓解患者的痛苦。

实施例3：

本实施例所采用的配方中各组分的重量份如下：

人参      100；

麦冬      500；

五味子    100；

黄芪      450；

丹参      200；

川芎      300；

山楂      200。

本实施例提供益心舒微丸的制备方法如下：

(1)将所述量的人参粉成细粉，备用；

(2)将所述量的五味子、丹参加入8倍体积的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.15(20℃)的清膏，备用；

(3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加8倍体积水煎煮，煎液滤过，加等量的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜，得醇沉液；

(4)将步骤(3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.30(80℃)的清膏，备用；

(5)将步骤(2)和步骤(4)所得的清膏合并，加入步骤(1)所得人参细粉及400重量份的微晶纤维素和50重量份的甘露醇混匀，制成微丸。

本发明所提供的益心舒微丸，药丸直径＜0.05mm，崩解溶化性优，疗效发挥快，且释药稳定，崩解时间约60分钟，生物利用度高，局部刺激性小。丸剂外观整洁美观，患者乐于服用，微丸的临界相对湿度为57％，吸湿性小，运输、储存、携带等均比较方便。

益心舒微丸治疗房性早搏临床研究

方法：对62例房性早搏患者进行随机分组对照研究。入选者性别、年龄、体重及24h房早数量差异无显著性。2例失访。治疗组30例给予益心舒1袋tid po，加用异搏定40mg tid po，疗程4周。对照组30例给予异搏定40mgtid po，疗程4周。做24h动态心电图(Holter)检测治疗前后房早次数。

结果：用药4周疗效(以Holter为准)比较。试验组：益心舒加用异搏定总有效率为90％，房早次数从治疗前(5088±4258)次/24h显著下降到治疗后(1274±1671)次/24h，治疗前后差异有非常显著性(P＜0.01)。对照组：异搏定组总有效率为66％。房性早搏由治疗前(5039±3102)次/24h下降到治疗后(2229±1829)次/24h，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)。两组有效率比较差异有非常显著性(P＜0.01)。

结论：益心舒联合异搏定治疗房性早搏疗效显著，比单独用异搏定治疗房性早搏效果好。

实施例4：

本实施例所采用的配方中各组分的重量份如下：

人参    100；

麦冬    100；

五味子  100；

黄芪    450；

丹参    600；

川芎    300；

山楂    400。

本实施例提供益心舒微丸的制备方法如下：

(1)将所述量的人参粉成细粉，备用；

(2)将所述量的五味子、丹参加入12倍体积的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.12(20℃)的清膏，备用；

(3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加12倍体积水煎煮，煎液滤过，加等量的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜，得醇沉液；

(4)将步骤(3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.36(80℃)的清膏，备用；

(5)将步骤(2)和步骤(4)所得的清膏合并，加入步骤(1)所得人参细粉及450重量份的微晶纤维素和50重量份的甘露醇混匀，制成微丸。

本发明所提供的益心舒微丸，药丸直径＜0.05mm，崩解溶化性优，疗效发挥快，且释药稳定，崩解时间约60分钟，生物利用度高，局部刺激性小。丸剂外观整洁美观，患者乐于服用，微丸的临界相对湿度为57.5％，吸湿性小，运输、储存、携带等均比较方便。

实施例5：

本实施例所采用的配方中各组分的重量份如下：

人参    500；

麦冬    500；

五味子  300；

黄芪    450；

丹参    600；

川芎    300；

山楂    200。

本实施例提供益心舒微丸的制备方法如下：

(1)将所述的人参粉成细粉，备用；

(2)将所述量的五味子、丹参加入12倍量的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.12(20℃)的清膏，备用；

(3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加10倍水煎煮，煎液滤过，滤液浓缩至适量，加等量的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜；

(4)将步骤(3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.32(80℃)的清膏，备用；

(5)将步骤(2)和步骤(4)所得的清膏合并，加入人参细粉及400重量份的微晶纤维素和80重量份的甘露醇混匀，制成微丸，干燥即得。

本发明所提供的益心舒微丸，药丸直径＜0.05mm，崩解溶化性优，疗效发挥快，且释药稳定，崩解时间约60分钟，生物利用度高，局部刺激性小。丸剂外观整洁美观，患者乐于服用，微丸的临界相对湿度为57.5％，吸湿性小，运输、储存、携带等均比较方便。

实施例6：

本实施例所采用的配方中各组分的重量份如下：

人参    500；

麦冬    100；

五味子  100；

黄芪    150；

丹参    200；

川芎    275；

山楂    400。

本实施例提供益心舒微丸的制备方法如下：

(1)将所述的人参粉成细粉，备用；

(2)将所述量的五味子、丹参加入12倍量的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.35(20℃)的清膏，备用；

(3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加12倍水煎煮，煎液滤过，滤液浓缩至适量，加等量的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜；

(4)将步骤3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.25(80℃)的清膏，备用；

(5)将步骤(2)和步骤(4)所得的清膏合并，加入人参细粉及450重量份的微晶纤维素和150重量份的甘露醇混匀，制成微丸，干燥即得。

本发明所提供的益心舒微丸，药丸直径＜0.05mm，崩解溶化性优，疗效发挥快，且释药稳定，崩解时间约60分钟，生物利用度高，局部刺激性小。丸剂外观整洁美观，患者乐于服用，微丸的临界相对湿度为57％，吸湿性小，运输、储存、携带等均比较方便。

实施例7：

本实施例所采用的配方中各组分的重量份如下：

人参    500；

麦冬    500；

五味子  300；

黄芪    450；

丹参    200；

川芎    100；

山楂    200。

本实施例提供益心舒微丸的制备方法如下：

(1)将所述的人参粉成细粉，备用；

(2)将所述量的五味子、丹参加入10倍量的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.30(20℃)的清膏，备用；

(3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加10倍水煎煮，煎液滤过，滤液浓缩至适量，加等量的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜；

(4)将步骤(3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.30(80℃)的清膏，备用；

(5)将步骤(2)和步骤(4)所得的清膏合并，加入人参细粉及180重量份的微晶纤维素和120重量份甘露醇混匀，制成微丸，干燥即得。

本发明所提供的益心舒微丸，药丸直径＜0.05mm，崩解溶化性优，疗效发挥快，且释药稳定，崩解时间约60分钟，生物利用度高，局部刺激性小。丸剂外观整洁美观，患者乐于服用，微丸的临界相对湿度为57％，吸湿性小，运输、储存、携带等均比较方便。

实施例8

一、色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A：乙腈，流动相B：水，按下表进行梯度洗脱；检测波长为203nm；柱温：30℃；流速为1ml·min^-1；理论板数按人参皂苷Rg₁峰计算应不低于6000。

二、对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re适量，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，作为对照品溶液。

三、供试品溶液的制备

取实施例1的药品适量，研细，取约4g，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml分次转溶至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取3次，每次15ml，弃去三氯甲烷液，水层用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用0.5％NaOH溶液洗涤4次，每次15ml，合并碱洗液，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗3次，每次15ml，分取正丁醇层，置水浴上蒸干，残渣用20％乙腈溶解，并定容至5ml，作为供试品溶液。

四、测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定，即得，色谱图如图1所示。

本品每袋含人参以人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)和人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)的总量计，不得低于1.8mg，以人参皂苷Rb₁(C₅₄H₉₂O₂₃)计，不得低于1.2mg。

五、方法学研究资料

1.实验样品来源

品名：益心舒丸

批号：10120702

规格：2g/袋

生产厂家：昆明赛诺制药有限公司

生产日期：2010年12月7日

2.指标成分的选择

参照2010版药典8页人参含量测定要求，选择人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)，人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)，人参皂苷Rb₁(C₅₄H₉₂O₂₃)，作为指标成份。

3.对照品的来源

人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)：中国生物制品检定所，批号：0703-200221含量：100％；

人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)：中国生物制品检定所，批号：110754-200221含量：100％；

人参皂苷Rb₁(C₅₄H₉₂O₂₃)：中国生物制品检定所，批号：110704-200217含量：100％。

4.色谱条件的选择

4.1检测波长的选择：对人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re，人参皂苷Rb₁对照品分别进行光谱检测，光谱图上可见，三者的最大吸收均为末端吸收，参照《中国药典》2010年版一部人参项下含量测定方法，选择203nm为样品的检测波长。

4.2色谱条件：C18柱(Agilent HC-C18，5μm，4.6×250mm，)，流动相A：乙腈，流动相B：水，根据表中规定的洗脱时间和比例进行梯度洗脱，检测波长为203nm，流速为1mL·min-1，柱温：30℃。理论塔板数按人参皂苷Rg₁峰计应不低于6000，相邻峰的分离度应大于1.5。

表1  梯度洗脱表

5.供试品的制备

取本品适量，研细，取约4g，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml分次转溶至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取3次，每次15ml，弃去三氯甲烷液，水层用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用0.5％NaOH溶液洗涤4次，每次15ml，合并碱洗液，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗3次，每次15ml，分取正丁醇层，置水浴上蒸干，残渣用20％乙腈溶解，并定容至5ml，作为供试品溶液。

6.对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg₁，人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)，人参皂苷Rb₁、对照品适量，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液。

7.空白实验：按照处方中的药味，去掉人参药材，其他药材按照处方中的制法进行煎煮和制备，制备后的样品按照供试品的处理方法进行提取，按照上述的条件进行检测，从色谱图判断，其结果阴性无干扰。8.线性实验

(1)实验方法：在60％-140％的浓度范围内，配制5份对照品溶液，测定各浓度样品的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，使用最小二乘法进行线性回归分析。

(2)实验情况：

通过5个浓度和峰面积的对应关系，进行线性回归分析：

人参皂苷Rg₁在1.2468*10^-3mg至2.9092*10^-3mg浓度范围内，线性关系良好，回归方程：Y＝4*10¹⁰X+83368；r＝0.9999，线性关系图如图1；

人参皂苷Re在1.0878*10^-3mg至2.5382*10^-3mg浓度范围内，线性关系良好，回归方程：Y＝4*10¹⁰X+1680.4，r＝0.9999线性关系图如图2；

人参皂苷Rb1在1.1292*10^-3mg至2.6349*10^-3mg浓度范围内，线性关系良好，回归方程：Y＝4*10¹⁰X+83368；，r＝0.9999线性关系图如图3。

表2  线性实验数据汇总

9.精密度实验

(1)实验方法：

进行重复性实验：由1名分析人员对同一批次的样品，进行6次重复实验，根据6份实验结果，进行结果评价。

(2)实验情况

对同一样品由同一人员重复实验6次，其中，人参皂苷Rg1：6次平行实验，RSD为1.34％，人参皂苷Re 6次平行实验，RSD为1.36％，人参皂苷Rb1 6次平行实验，RSD为1.62％，各组份RSD值均小于2.0％，重复性实验结果符合规定。

表3  精密度实验对照品数据汇总表

表4  精密度实验样品数据汇总表

10.准确度实验

(1)实验方法：采用加样回收实验，取已知准确含量的供试品9份，分三组，每组三份.分别向每组供试品溶液中加入不同含量的对照品溶液，混合均匀后，按供试品溶液的制备方法，分别进行提取，制备，计算回收率.

(2)样品的制备过程：

取已知含量批号为10120702的样品研细，精密称取27.1526g，精密加入200ml甲醇，超声处理30分钟，放冷过滤，精密量取12ml、15ml、18ml至分液漏斗中，而后精密吸取1#对照品溶液8ml、10ml、12ml分别加入上述分液漏斗中，每个浓度制备3份，共9份溶液，按照含量测定的方法进行提取制备。

通过80％、100％、120％三个浓度组9份样品的回收率实验，结果表明，人参皂苷Rg1的平均收率为99.75％，RSD为1.27％；人参皂苷Re平均收率为98.39％、RSD为0.95％；人参皂苷Rb1平均收率为101.24％，RSD为0.75％，三组分平均收率符合要求，RSD符合要求。

表5  回收率实验对照品数据汇总表

表6  加样回收实验样品含量

表7：80％浓度组回收率实验样品数据汇总表

表8：100％浓度组回收率实验样品数据汇总表

表9：120％浓度组回收率实验样品数据汇总表

表10：9组回收率实验结果汇总表

11.方法学实验结论

经过以上专属性实验，线性回归，精密度实验，准确度实验，结果表明：变更后的含量测定方法符合中国药典2010版(一部)附录“中药质量标准分析方法验证指导原则”的要求，该方法可行。

Claims (7)

1.一种治疗冠心病心绞痛药物的检测方法，该药物由以下重量份的药材制成：

人参100-500重量份，麦冬100-500重量份，五味子100-300重量份，黄芪150-450重量份，丹参200-600重量份，川芎100-300重量份，山楂200-400重量份，微晶纤维素300-500重量份，甘露醇50-200重量份；

该检测方法包括采用高效液相色谱法检测所述药物中的人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re和人参皂苷Rb₁，其中，所述高效液相色谱的条件包括：

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

采用乙腈溶液为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的过程为：第0-25分钟，流动相A乙腈溶液为15％体积，流动相B水为85％体积；第25-70分钟，流动相A乙腈溶液为15-22％体积，流动相B水为85-78％体积；第70-80分钟，流动相A乙腈溶液为22-30％体积，流动相B水为78-70％体积；第80-105分钟，流动相A乙腈溶液为30-40％体积，流动相B水为70-60％体积；第105-120分钟，流动相A乙腈溶液为40-15％体积，流动相B水为60-85％体积。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件还包括：柱温为25～40℃，优选为30℃。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件还包括：检测波长为203nm；流速为1mL·min^-1。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，对照品溶液的制备方法如下：

精密称取人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，作为对照品溶液。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法如下：

取所述药物适量，研细，取约4g，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水20ml分次转溶至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取3次，每次15ml，弃去三氯甲烷液，水层用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用0.5％NaOH溶液洗涤4次，每次15ml，合并碱洗液，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗3次，每次15ml，分取正丁醇层，置水浴上蒸干，残渣用20％乙腈溶解，并定容至5ml，作为供试品溶液。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述药物的制备方法如下：

1)将所述的人参粉成细粉，备用；

2)将所述量的五味子、丹参加入6-12倍体积的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.10-1.35的清膏，备用；

3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加6-12倍体积的水煎煮，煎液滤过，加等体积的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜，得醇沉液；

4)将步骤3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.20-1.40的清膏，备用；

5)将步骤2)和步骤4)所得的清膏合并，加入步骤1)所得人参细粉及300-500重量份的微晶纤维素和50-200重量份甘露醇混匀，制成微丸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述药物的制备方法如下：

1)将所述量的人参粉成细粉，备用；

2)将所述量的五味子、丹参加入8倍体积的85％乙醇回流提取，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.15-1.12的清膏，备用；

3)将所述量的麦冬、黄芪、川芎、山楂加8倍体积的水煎煮，煎液滤过，加等量的85％的乙醇，充分搅拌后，静置过夜，得醇沉液；

4)将步骤3)所得醇沉液，滤去沉淀物，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.30-1.36的清膏，备用；

5)将步骤2)和步骤4)所得的清膏合并，加入步骤1)所得人参细粉及400重量份的微晶纤维素和100重量份的甘露醇混匀，制成微丸。

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