CN102240322B - 一种复方丹参片及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

一种复方丹参片，取丹参酮ⅡA晶体粉28～32份、丹参酚酸类成分浸膏粉68～72份、与三七总皂苷浸膏粉58～62份、研细的冰片20～26份、填充剂160～180份、崩解剂15～25份和有效量质量百分浓度为60%的聚乙二醇粘合剂混合均匀，过20目筛制粒，再加入润滑剂硬脂酸镁2～5份，压制成片、包薄膜衣制得；本发明对丹参药材的提取采用超临界流体萃取。本发明对丹参药材中丹参酮ⅡA的提取率高，达0.40～0.47mg/g，提取物纯度可达40～45%wt；丹酚酸B的提取率达0.40～0.47mg/g；取三七工艺的三七提取率可高达17.8mg/g（以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的总量计）；本发明复方丹参片在体内起效迅速、血药浓度达峰时间短，生物利用度高。

Description

一种复方丹参片及其制备工艺

技术领域

本发明涉及中成药及其制备工艺，具体涉及一种复方丹参片及其制备工艺，属于药物技术领域。

背景技术

丹参是我国传统著名的活血化瘀的中药，现代药理研究表明，丹参对心血管系统，血液系统作用十分明显，特别在近20年里，丹参治疗冠心病的研究甚多，其主要有效成分是水溶性的丹酚酸B(C₃₆H₃₀O₁₆)，脂溶性丹参酮II A(C₁₉H₁₈O₃)和丹参素(C₉H₁₀O₅)；三七同样具有散瘀止血，消肿定痛的功效，其提取物为人参皂苷Rg1(C₄₂H₇₂O₁₄)、人参皂苷Rb1(C₅₄H₉₂O₂₃)、和三七皂苷R1(C₄₇H₈₀O₁₈)。复方丹参片是由丹参、三七、冰片3味中药组成的具有活血化瘀、理气止痛作用，用于胸中憋闷，心绞痛的中药制剂。

目前复方丹参片的制备中主要采用丹参醇提加水提，三七细粉入药的制备工艺，其详细工艺为：丹参加乙醇加热回流1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用，药渣加50％乙醇，加热回流1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用，药渣加水煎煮2小时，煎液滤过，滤液浓缩至适量；三七粉碎成细粉，与上述浓缩液和适量辅料制成颗粒，干燥；冰片研细，与上述颗粒混合，压片，包衣，即得。

在上述现有制备工艺中，首先，丹参酮IIA为脂溶性成分，含量主要在表皮及须根中，经浸泡水洗等加工，会造成有一定的损失；丹酚酸B为水溶性成分，易溶于水，在现有制备工艺过程中，易造成成分的损失。第二，乙醇回流与水煎煮温度均可达到90～100℃，结合丹参酮类和丹参酚酸类成分的理化性质，即丹参酮遇湿、热、光均不稳定；酚酸B是二分子丹参素与一分子原紫草酸缩合而成的四聚咖啡酸类化合物，化学性质很不稳定，易降解，丹参素为一种游离酸，易氧化成有色的醌类物质，会导致各有效成分的损失。第三，三七以药材细粉入药，影响药物在人体内的吸收。采用现有复方丹参片的制备工艺制得的复方丹参片有效成分损失较大，药效、吸收等不够理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种吸收起效快、生物利用度高的复方丹参片。

本发明的另一目的在于提供上述复方丹参片的制备工艺。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种复方丹参片，取丹参酮II A晶体粉28～32份、丹参酚酸类成分浸膏粉68～72份、与三七总皂苷浸膏粉58～62份、研细的冰片20～26份、填充剂160～180份、崩解剂15～25份和有效量质量百分浓度为60％的聚乙二醇粘合剂混合均匀，过20目筛制粒，再加入润滑剂硬脂酸镁2～5份，压制成片、包薄膜衣制得；

所述崩解剂为低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚维酮中的一种或多种，优选采用低取代羟丙基纤维素；所述填充剂为乳糖、微晶纤维素、淀粉中的一种或多种，优选采用乳糖；

所述丹参酮IIA晶体粉和丹参酚酸类成分浸膏粉是按如下步骤制得的：

将丹参药材粉碎，采用超临界CO2萃取得到丹参酮II A结晶体，所述超临界CO2流体从萃取釜底部进入，所述萃取温度为38～42℃、时间为1.5～2.5h、压力为25～32Mpa，然后将流体降压到低于二氧化碳临界压力进入解析釜，由解析I与解析II两步完成，解析釜I压力为6～6.8Mpa，温度为20～25℃，解析时间1.5～2.5h；解析釜II压力为5～6Mpa，温度为20～25℃，解析时间1～2h，通过两步解析出制得丹参酮II A，丹参酮II A从解析釜底部放出，二氧化碳气体经过热交换器冷凝成二氧化碳液体再循环使用；将所述萃取后的药渣采用水提得到提取液，再减压干燥得丹参酚酸类浸膏。

进一步，上述丹参酚酸类浸膏的制备具体是在上述萃取后的药渣中加入其2～3倍重量的水，-0.1MPa减压回流提取3次，每次2小时，合并提取液、在压力-0.1Mpa，温度为60℃条件下，减压干燥，得水溶性丹参酚酸类浸膏。

优选地，上述萃取温度为40℃、时间为2h、压力为28Mpa；解析I温度优选为23℃、时间为2.5h、压力为6.8Mpa，解析II温度优选为21℃、时间为1.5h、压力为5Mpa。

整个分离过程是利用二氧化碳流体在超临界状态、合理有效地控制，特异地增加有机物的溶解度，而低于临界状态下对有机物基本不溶解，将二氧化碳流体不断在萃取釜和解析釜间循环，从而有效地将丹参酮II A从丹参药材中分离出来。

为了使丹参药材在萃取过程中更充分与二氧化碳结合、提高萃取丹参酮II A的收率，本发明对丹参药材的粉碎粒度为24目，丹参药材的水分含量为7.0％(以质量百分含量计)，CO2流量在14kg/h～18g/h，优选为15kg/h。

上述复方单参片的制备工艺，按如下步骤：

(1)、丹参酮II A晶体、丹参酚酸类浸膏的提取：

将含水量为7％的丹参药材粉碎、过24目筛，采用超临界CO2萃取得到丹参酮II A结晶体，所述超临界CO2流体从萃取釜底部进入，所述萃取温度为38～42℃、时间为1.5～2.5h、压力为25～32Mpa，然后将流体降压到低于二氧化碳临界压力进入解析釜，由解析I与解析II两步完成，解析釜I压力为6～6.8Mpa，温度为20～25℃，解析时间1.5～2.5h；解析釜II压力为5～6Mpa，温度为20～25℃，解析时间1～2h，通过两步解析出制得丹参酮II A，丹参酮II A从解析釜底部放出，二氧化碳气体经过热交换器冷凝成二氧化碳液体再循环使用；将所述萃取后的药渣中加入其2～3倍重量的水，-0.1MPa减压回流提取3次，每次2小时，合并提取液、在压力-0.1Mpa，温度为60℃条件下，减压干燥，得水溶性丹参酚酸类浸膏；

(2)、三七总皂苷浸膏的提取：

将三七药材粉碎后加醇加热回流2次，每次1.5小时，提取液初步澄清处理，滤液经大孔树脂纯化、乙醇溶液作为洗脱液，得三七总皂苷乙醇溶液，经过减压浓缩，真空干燥得三七总皂苷浸膏，三七药渣弃去；

(3)、复方单参片的制备

取丹参酮IIA晶体粉28～32份、丹参酚酸类成分浸膏粉68～72份、与三七总皂苷浸膏粉58～62份、研细的冰片20～26份、填充剂160～180份、崩解剂15～25份和有效量质量百分浓度为60％的聚乙二醇粘合剂混合均匀，过20目筛制粒，再加入润滑剂硬脂酸镁2～5份，压制成片、包薄膜衣制得。

为了进一步获得杂质含量少、有效成分高的三七总皂苷，上述三七总皂苷浸膏的制备过程的回流提取采用的醇优选为低级醇，如甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇、正丙醇、异丁醇等或其混合物，进一步优选乙醇。

为了进一步提高三七醇提取液中的有效成分和保证有效成分的生物活性，上述三七总皂苷浸膏的制备过程中，具体为：加10～12倍三七药材重量的体积百分浓度为70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，即得三七醇提取液，再进行所述初步澄清处理和大孔树脂纯化处理。

上述三七总皂苷浸膏制备过程中的初步澄清处理可用一般材料如纱布、丝绢、棉花等，也可用滤纸，也可经过高速离心后分取上清液，也可用絮凝剂如壳聚糖澄清剂、101果汁澄清剂、ZTC1+1天然澄清剂、蛋清絮凝剂等吸附澄清而除去提取液中较大的悬浮颗粒，还可用醇沉法除去大部分杂质；进一步优选高速离心，转速为4000转/分，离心20分钟后分取上清液，按照重量比1∶50(回流提取液：ZTC1+1天然澄清剂)加入ZTC1+1天然澄清剂，进行初步澄清处理。

上述三七总皂苷浸膏制备过程中大孔树脂纯化处理优选采用D101型大孔吸附树脂、D941型大孔弱碱性阴离子交换树脂、D3520型大孔吸附树脂、D4006型大孔吸附树脂、D4020型大孔吸附树脂、H103型大孔吸附树脂、H107型大孔吸附树脂、X-5型大孔吸附树脂、HP-10型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、HP-21型大孔吸附树脂、HP-30型大孔吸附树脂、HP-40型大孔吸附树脂或HP-50型大孔吸附树脂；进一步优选D101型大孔吸附树脂对初步澄清处理后的三七醇提取液进行吸附分离、再采用D941型大孔弱碱性阴离子交换树脂进行脱色处理。

上述D101型大孔吸附树脂的优选操作条件如下：

1)吸附容量优选0.8～1.1g.g^-1，进一步优选0.9～1.0g.g^-1，最佳为0.95～0.99g.g^-1；

2)洗脱液优选体积百分浓度为30～85％的乙醇，进一步优选体积百分浓度为55～80％的乙醇，最佳为体积百分浓度为65～75％的乙醇。

上述采用D101型大孔吸附树脂吸附分离具体是用体积百分浓度为65～75％乙醇上柱对初步澄清处理后的三七醇提取液预吸附45～75分钟，然后用水洗除去糖等杂质至Molish反应呈阴性，再用体积百分浓度为65～75％的乙醇洗脱树脂。

为了进一步降低三七的固量损失，并使脱色效果更佳，上述采用D941型大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色处理优选的操作工艺如下：

1)上柱液溶剂优选水或乙醇，进一步优选体积百分浓度为70％的乙醇；为了给工艺带来方便，以采用洗脱上述D101型大孔吸附树脂后的乙醇洗脱液，不经减压浓缩，作为上柱液溶剂直接上D941树脂柱为最佳；

2)洗脱剂优选体积百分浓度为30～80％的乙醇，进一步优选50～75％的乙醇，最佳为70～75％的乙醇；为了方便工业生产，优选体积百分浓度为70％的乙醇作为洗脱剂，洗脱时所述乙醇的体积优选100～200ml/50g，进一步优选120～180ml/50g，最佳为140～160ml/50kg。

采用本发明超临界法提取丹参药材中有效成分的优点如下：

1、超临界萃取(以下简称SFE)在接近室温及CO2气体笼罩下进行提取，有效地防止了热敏性物质丹酚酸B的氧化和逸散，在萃取物中保持着药用植物的有效成分，而且能把高沸点、低挥发性、易热解的物质在远低于其沸点温度下萃取出来。

2、使用SFE是最干净的提取方法，由于全过程不用有机溶剂，因此萃取物绝无残留的溶剂物质，从而防止了提取过程中对人体有害物的存在和对环境的污染，保证了100％的纯天然性。

3、萃取和分离合二为一，当饱和的溶解物的CO2流体进入分离器时，由于压力的下降或温度的变化，使得CO2与萃取物迅速成为两相(气液分离)而立即分开，不仅萃取的效率高而且能耗较少，提高了生产效率也降低了费用成本。

4、CO2是一种不活泼的气体，萃取过程中不发生化学反应，且属于不燃性气体，无味、无臭、无毒、安全性非常好；CO2气体价格便宜，纯度高，容易制取，且在生产中可以重复循环使用，从而有效地降低了成本。

5、本发明对丹参药材中丹参酮IIA的提取率高，达0.40～0.47mg/g，提取物纯度可达40～45％wt；丹酚酸B的提取率达0.40～0.47mg/g。

本发明提取三七工艺的三七提取率可高达17.8mg/g(以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的总量计)。

本发明复方丹参片在体内起效迅速、血药浓度达峰时间短，生物利用度高。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1 一种复方丹参片的制备工艺

1、利用万能粉碎机，将丹参药材粉碎过24目筛，粉末装入萃取釜，采用二氧化碳为超临界溶剂，然后打开CO2钢瓶(需保持出口压力在5.0MPa以上)，同时调节萃取温度为38℃，设定萃取压力为25MPa，通过调节变频调速器调节CO2流量为14kg/h，然后关闭CO2钢瓶，使超临界CO2流体在设定的压力、温度、流量进行萃取循环，萃取时间设定为2h，含溶解丹参酮II A的高压二氧化碳流体经节流阀降压到低于二氧化碳临界压力以下进入解析釜，由解析I与解析II两步完成，其中解析I步骤温度控制在23℃、压力6.8Mpa、解析2.5h，解析II步骤温度控制在21℃、压力5Mpa、解析2h，析出丹参酮II A，丹参酮II A定期从解析釜底部放出。

2、项1所得药渣加入药渣2倍重量的水在-0.1Mpa减压提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩，在-0.1Mpa、60℃干燥，得水溶性丹参酚酸类浸膏，丹参药渣弃去。

3、三七药材经万能粉碎机粉碎后加入为其10倍重量、体积百分浓度为70％的乙醇加热回流2次，每次1.5小时，合并提取液，即得三七醇提取液。三七醇提取液高速离心后分取上清液，用滤纸抽滤，滤液选用D101型大孔吸附树脂三七醇提取液进行吸附分离。D101型大孔吸附树脂吸附容量为选用0.95～0.99g.g^-1，洗脱溶媒选用体积百分浓度为65％的乙醇溶液，用65％乙醇上柱对三七醇提取液预吸附75分钟，然后用水洗除去糖等杂质至Molish反应呈阴性，再用所述的乙醇洗脱树脂。再用D941型大孔弱碱性阴离子交换树脂进行脱色处理，洗脱液采用体积百分浓度为70％的乙醇。对三七提取液的液相进行减压浓缩，回收乙醇，即得三七提取物的浸膏。

4、取丹参酮II A晶体细粉30g、丹参酚酸类成分浸膏细粉70g、与三七总皂苷浸膏细粉60g、研细的冰片24g、乳糖170g、低取代羟丙甲纤维素20g、质量百分浓度为60％聚乙二醇80ml，过20目筛制粒，外加润滑剂硬脂酸镁3g，压片，包薄膜衣，即得。

经检测，本例复方丹参片，丹参酮II A(C17H15NO5)的提取率为0.43mg/g；解析II产物中丹参酮II A含量为11.57％；解析I产物中丹参酮II A含量为44.11％，丹酚酸B(C36H30O16)的提取率为0.52mg/g；三七总皂苷(人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的总量计)提取率为17.8mg/g。薄膜衣片经检测，丹参酮II A(C17H15NO5)的含量为：15.7mg/片；丹酚酸B(C36H30O16)45.64mg/片；三七总皂苷49.49mg/片；冰片24.07mg/片。

实施例2 一种复方丹参片的制备工艺

1、利用万能粉碎机，将丹参药材粉碎过24目筛，粉末装入萃取釜，采用二氧化碳为超临界溶剂，然后打开CO2钢瓶(需保持出口压力在5.0MPa以上)，同时调节萃取温度为42℃，设定萃取压力为32MPa，通过调节变频调速器调节CO2流量为18kg/h，然后关闭CO2钢瓶，使超临界CO2流体在设定的压力、温度、流量进行萃取循环，萃取时间设定为2h，含溶解丹参酮II A的高压二氧化碳流体经节流阀降压到低于二氧化碳临界压力以下进入解析釜，由解析I与解析II两步完成，其中解析I步骤温度控制在25℃、压力6Mpa、解析1.5h，解析II步骤温度控制在22℃、压力6Mpa、解析1h，由于二氧化碳溶解度急剧下降而析出丹参酮II A，丹参酮II A定期从解析釜底部放出。

2、项1所得药渣加入药渣2倍重量的水在-0.1Mpa减压提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩，在-0.1Mpa、60℃干燥，得水溶性丹参酚酸类浸膏，丹参药渣弃去。

3、三七药材经万能粉碎机粉碎后加入为其12倍重量、体积百分浓度为70％的乙醇加热回流2次，每次1.5小时，合并提取液，即得三七醇提取液。三七醇提取液用大孔吸附树脂三七醇提取液进行吸附分离。D101型大孔吸附树脂吸附容量为选用0.95～0.99g.g^-1，洗脱溶媒选用体积百分浓度为65％的乙醇溶液，用该65％乙醇ZTC1+1天然澄清剂进行初步澄清处理后分取上清液，用滤纸抽滤，滤液选用D101型上柱对三七醇提取液预吸附75分钟，然后用水洗除去糖等杂质至Molish反应呈阴性，再用上述乙醇洗脱树脂。再用D941型大孔弱碱性阴离子交换树脂进行脱色处理，洗脱液采用体积百分浓度为70％的乙醇。对三七提取液的液相进行减压浓缩，回收乙醇，即得三七提取物的浸膏。

4、取丹参酮II A晶体细粉30g、丹参酚酸类成分浸膏细粉70g、与三七总皂苷浸膏细粉60g、研细的冰片24g、乳糖170g、低取代羟丙甲纤维素20g、质量百分浓度为60％聚乙二醇80ml，过20目筛制粒，外加润滑剂硬脂酸镁3g，压制成1000片，包薄膜衣，即得。

经检测，本例复方丹参片，丹参酮II A(C17H15NO5)的提取率为0.42mg/g；解析II产物中丹参酮II A含量为11.38％；解析I产物中丹参酮II A含量为43.55％，丹酚酸B(C36H30O16)的提取率为0.66mg/g；三七总皂苷(人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的总量计)为17.2mg/g。薄膜衣片经检测，丹参酮II A(C17H15NO5)的含量为：15.4mg/片；丹酚酸B(C36H30O16)46.12mg/片；三七总皂苷50.21mg/片；冰片23.37mg/片。

实施例3-5：按如下用量及工艺参数制备复方丹参片，其余同实施例1。

复方丹参片中各原辅料及用量，以重量份计：

对丹参药材中丹参酮II A的萃取：

经检测，实施例3-5制得的复方丹参片，丹参酮II A(C17H15NO5)的提取率为0.4～0.47mg/g；丹酚酸B(C36H30O16)的提取率为0.5～0.7mg/g；三七总皂苷(人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的总量计)提取率为17～18mg/g。

为了更好地理解本发明，现做如下实验验证本发明复方丹参片。

复方丹参片2010年《中国药典》质量标准：

【性状】本品为薄膜衣片，出去包衣后显棕色至棕褐色；气芳香，味微苦。

【鉴别】(1)分别取本发明实施例1-5制得的复方丹参片置显微镜下观察：树脂道碎片含黄色分泌物(三七)

(2)分别取本发明实施例1-5制得的复方丹参片各1片、共计5片，研碎，加乙醚10ml，超声处理5分钟，滤过，药渣备用，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参酮II A对照品、冰片对照品，分别加醋酸乙酯制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(19∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与丹参酮II A对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以1％香草醛硫酸溶液，在110℃加热数分钟，在与冰片对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取[鉴别](2)项下的备用药渣，加甲醇25ml，加热回流15分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml，微热使溶解，加水饱和的正丁醇25ml振摇提取，取正丁醇提取液，用氨试液25ml洗涤，弃去氨溶液，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次25ml，正丁醇液浓缩至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。再取三七皂苷R1对照品及人参皂苷Rb1、Rg1对照品，分别加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述五种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(1→10)，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

【检查】符合片剂项下有关的各项规定(附录I D)。

【含量测定】丹参酮IIA照高效液相色谱法(附录VII D)测定。

色谱条件与系统使用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(73∶27)为流动相；检测波长为270nm理论板数按丹参酮II A计不低于2000.

对照品溶液的制备取丹参酮II A对照皮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含丹参酮II A40ug的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本发明实施例1-5制得的复方丹参片各2片，共计10片，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHz)15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液置棕色瓶中，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液个10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明复方丹参片每片含丹参以丹参酮II A(C9H18O3)计，规格(1))不少于0.2mg；规格(2)不少于0.6mg。

丹酚酸B照高效液相色谱法(附录VII D)测定。

色谱条件与系统使用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-甲酸-水(10∶30∶1∶59)为流动相；检测波长为286nm理论板数按丹酚酸B计应不低于4000。

对照品溶液的制备取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含丹酚酸B60ug的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本发明实施例1-5制得的复方丹参片各2片，共计10片，精密称定，研细，取约0.15g，精密称定，置50ml量瓶中，加水适量，超声处理(功率250W，频率33KHz)30分钟，放冷，加水至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液个10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每片含丹参以丹参酸B(C36H30O16)计，规格(1))不少于5.0mg；规格(2)不少于15mg。

【功能主治】活血化瘀，理气止痛。用于气滞血瘀所致的胸痹，症见胸闷、心前区刺痛；冠心病心绞痛见上述症候者。

【用法与用量】口服。一次3片规格(1)或1片规格(2)，一日3次。

【规格】(1)薄膜衣小片每片中0.32g(相当于饮片0.6g)；

(2)薄膜衣大片每片中0.8g(相当于饮片1.8g).

【贮藏】密封。

参照复方丹参片中丹参酮II A、丹酚酸B的鉴别与含量测定方法，参照三七药材有效成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1的测定方法，优化色谱条件，并通过系统的方法学验证，本发明在提取工艺的每一个中间环节，建立了能够表征各个有效成分的质量控制方案；另外，参照冰片的含量测定方法建立起复方丹参片中冰片的含量测定方法(采用气相色谱法)。将各个环节质量控制方案订入内控质量标准。

超临界二氧化碳萃取物丹参酮II A的质量控制：

1、性状、外观：呈桔红色结晶体

2、鉴别：取超临界二氧化碳结晶体适量，加乙酸乙酯制成每1ml含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取丹参酮II A对照品加醋酸乙酯制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(19∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与丹参酮II A对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

3、含量测定：测定法方照2010年《中国药典》质量标准。

3、1色谱条件与系统使用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(73∶27)为流动相；检测波长为270nm理论板数按丹参酮II A计不低于2000.

3、2对照品溶液的制备取丹参酮II A对照皮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含丹参酮II A40ug的溶液，即得。

3、3供试品溶液的制备取本发明实施例1超临界方法处理丹参后的提取物约1g，精密称定，研细，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHz)15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液置棕色瓶中，即得。

3、4测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液个10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

3、5测定结果：通过计算提取物的重量与投入药材细粉的重量得：本发明实施例2提取工艺丹参酮II A(C17H15NO5)的提取率为0.42mg/g，由此可见超临界萃取技术对于脂溶性成分的提取具有提取率高、提取物有效成分含量丰富等优势。通过对丹参超临界萃取物的高效液相色谱(HPLC)法分析表明，其中解析II产物中丹参酮II A含量为11.38％；解析I产物中丹参酮II A含量为43.55％，后者总丹参酮类成分得到较好富集。

水溶性丹参酚酸类成分的质量控制：

1、外观：为棕黄色或黄色浸膏

2、鉴别：在含量测定的色谱图中，供试液丹酚酸B主峰保留时间应与对照品溶液住峰保留时间一致。

3、含量测定：丹酚酸B照高效液相色谱法(附录VII D)测定。

色谱条件与系统使用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-甲酸-水(10∶30∶1∶59)为流动相；检测波长为286nm理论板数按丹酚酸B计应不低于4000。

3、1对照品溶液的制备取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含丹酚酸B 60ug的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本发明实施例2提取的丹参酚酸类浸膏细粉18mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水制成每1ml含900ug的溶液，即得。

3、2测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液个10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

3、3测定结果：通过计算减压干燥后浸膏的重量与投入药材细粉的重量得：此提取工艺丹酚酸B的提取率为0.66mg/g；采用HPLC法测得干燥浸膏丹酚酸B含量为72.5％，说明此种水提药渣工艺对药渣中极性成分丹酚酸B的提取率与纯度都较高。

三七总皂苷的质量控制：

1、性状：淡黄色浸膏，味苦，微甘。

2、取浸膏粉末适量加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为供试品溶液。再取三七皂苷R1对照品及人参皂苷Rb1、Rg1对照品，分别加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述四种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(1→10)，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

3人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1含量的测定

3、1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水梯度洗脱为流动相，检测波长为203nm，理论塔板数以人参皂苷Rg1峰计算应不低于4000；

线性梯度洗脱流动相配比变化表

3、2对照品溶液的制备称取人参皂苷Rg1对照品，人参皂苷Rb1对照品及三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 0.4mg，人参皂苷Rb1 0.4mg，三七皂苷R1 0.1mg的混合溶液，即得；

3、3供试品溶液的制备取实施例2制得的三七总皂苷浸膏细粉25mg置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；

3、4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算即得。

3、5测定结果：通过计算减压干燥后浸膏的重量与投入药材细粉的重量得：三七的提取率(以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的总量计)为17.2mg/g。

冰片的含量测定：照《中国药典》附录VI E气相色谱法测定。

1、色谱条件取系统使用性试验以聚乙二醇20000(PEG20M)为固定相，涂布浓度为10％；柱柱温为140℃，理论板数按龙脑峰计算应不低于2000.

2、对照品溶液的制备取龙脑对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml含5mg的溶液，即得。

3、供试品溶液的制备取本发明实施例2制得的细粉约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

4、测定法分别精密称取对照品溶液和供试品溶液各1ul，注入气象色谱仪，测定，即得。本品含龙脑(C₁₀H₁₈O)不得少于55.0％

对脂溶性部位主要成分丹参酮II A和水溶性部位的丹酚酸B分别进行鉴别定性含量测定，说明本发明产品的一致性及均衡性好，从而本发明产品的疗效好。

为了更好地理解本发明，现选取复方丹参片中的三七总皂苷中的人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1三个有效成分对通本发明制得的复方丹参片与传统工艺制得的复方丹参片作药效学和药代动力学试验，进一步阐述发明具有的有益效果。下面试验旨在进一步说明药物的作用，而非对本发明的限制：

1 材料与方法

1.1药品：人参皂苷Rg1(中国药品生物制品检定)，批号：110703-200639；人参皂苷Rb1(中国药品生物制品检定)，批号：110704-200635；三七皂苷R1(中国药品生物制品检定)，批号110745-200625；本发明实施例1制得的复方丹参片(规格：50mg/片)，复方丹参片(传统工艺)：由天圣制药集团重庆药物研究有限公司开发含三七总皂苷(规格：复方)。

1.2仪器与试剂Agilent 1200高效液相色谱仪；Quat Pump泵；VWD紫外一可见检测器；Agilent全自动进样器；Agilent色谱工作站。移液器：GILSON；FZQ一2型涡旋混合器(江苏泰县医疗器械厂)；TGL一16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)乙腈、甲醇均为色谱纯，甲酸、盐酸，冰醋酸，乙酸乙酯，磷酸均为分析纯，水为纯化水。

1.3实验动物成年Beagle犬6只，体重(9±0.6)，雌雄各半。

1.4色谱条件照《中国药典》2010年版一部复方丹参片丹参酮II A含量测定和三七药材中人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1含量测定色谱条件。

1.5三七总皂苷的检测：血浆样品处理取血浆样品0.5ml，加入1％冰醋酸50μl，涡旋混匀，再加入(3mol/L)盐酸溶液300μl，边加边涡旋，加入乙酸乙酯萃取4次，每次2ml，分离乙酸乙酯层，合并，于37℃水浴下N₂吹干，残渣用甲醇200μl溶解，离心，取上清液备用。进样10μl，记录人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，三七皂苷R1的峰面积。采用外标标准曲线法以峰面积分别计算三种皂苷的量，最后得到三七总皂苷的量。

1.6给药方法采用双周期自身交叉设计，Bea～e犬6条随机分为2组。一组静注，另一组口服，7d后交叉。给药剂量分别为：灌胃114.7mg·kg^-1。给药前禁食12h，不禁水，给药后12h内禁食、禁水。

1.7样品采集与处理给药前采集空白血样，于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，9.0h在下肢静脉取血5ml。将采集到的血样置含肝素离心管中，离心(2 000r·min)10min，取上层血浆-20℃储存。

1.8数据处理将测得的血药浓度时间数据以BAPP2.3生物利用度数据处理通用程序中的模型拟合与统计矩法计算药物的药代动力学参数。Cmax、Tmax(实测值计算)，AUC按梯形面积法计算，时间范围取0-∞h。绝对生物利用度计算，以口服组AUC0一∞比静脉组AUC0一∞。

2 结果

2.1标准曲线精密吸取空白血浆0.5ml，置于具塞离心管中，每管分别加入不同浓度人参皂苷Rg1(母液0.24mg·ml-1等比稀释成各浓度溶液)，使血浆成9.6，4.8，2.4，1.2，0.6μg/ml系列浓度；人参皂苷Rb1(母液0.27mg·ml-1等比稀释成各浓度溶液)，使血浆成10.8，5.40，2.70，1.35，0.675μg/ml系列浓度；三七皂苷R1溶液(母液10.5mg·ml-1等比稀释成各浓度溶液)，使血浆成4.20，2.10，1.05，0.525，0.2625μg/ml系列浓度，自“加入1％冰醋酸50μl”起，按血浆样品制备方法进行处理。取上清液10μl注入液相色谱仪测定，分别以人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，三七皂苷R1峰面积为纵坐标(Y)和血浆中各物质的浓度为横坐标(X)进行线性回归，即得标准曲线的回归方程：人参皂苷Rg1：Y＝414.7X+9.220，R＝0.9997，人参皂苷Rg1浓度在0.6-9.6μg/ml之间呈良好的线性关系；人参皂苷Rb1：Y＝235.0X+26.715，R＝0.9998，人参皂苷Rb1浓度在0.675-10.8μg/ml之间呈良好的线性关系；三七皂苷R1Y＝198.0X+17.28，R＝0.9997，三七皂苷R1浓度在0.2625-4.20之间呈良好的线性关系。

2.2药代动力学研究Beagle犬I3服两种工艺复方丹参片后主要药代动力学参数(n＝6)见表1：

表1 主要药代动力学参数

生物利用度计算：按以下公式计算口服给药后三七总皂苷的绝对生物利用度：

$F=\frac{\mathrm{AUCig}\×\mathrm{XOiv}}{\mathrm{AUCiv}\×\mathrm{Xoig}}\×100\%$

表2 绝对生物利用度的比较

药代动力学结果表明，复方丹参片制备的不同工艺，犬血浆中三七总皂苷的药代动力学过程均符合二房室模型。传统工艺三七总皂苷的绝对生物利用度为63.8％，精品化工艺三七总皂苷的绝对生物利用度为70.1％。提示精品化工艺制作的复方丹参片更有利于药物快速在体内起效。精品化工艺制作的复方丹参片犬血浆中三七总皂苷的最大血药浓度为所需时间为2.987h，而传统工艺达峰时间为3.158h，工艺精品化后，复方丹参片具有血药浓度达峰时间短，起效快等特点，优于传统工艺。

Claims (5)

1.一种复方丹参片的制备工艺，按如下步骤：

（1）、在丹参药材中提取得到丹参酮ⅡA晶体、丹参酚酸类浸膏：

将丹参药材粉碎，采用超临界CO2萃取得到丹参酮ⅡA结晶体，所述超临界CO2流体从萃取釜底部进入，所述萃取温度为38～42℃、时间为1.5～2.5h、压力为25～32Mpa，然后将流体降压到低于二氧化碳临界压力进入解析釜，由解析Ⅰ与解析Ⅱ两步完成，解析釜Ⅰ压力为6～6.8Mpa，温度为20～25℃，解析时间1.5～2.5h；解析釜Ⅱ压力为5～6Mpa，温度为20～25℃，解析时间1～2h，通过两步解析出制得丹参酮ⅡA，丹参酮ⅡA从解析釜底部放出，二氧化碳气体经过热交换器冷凝成二氧化碳液体再循环使用；将所述萃取后的药渣采用水提得到提取液，再减压干燥得丹参酚酸类浸膏；

（2）、三七总皂苷浸膏的提取：

将三七药材粉碎后加10～12倍三七药材重量的体积百分浓度为70%的乙醇加热回流2次，每次1.5小时，提取液初步澄清处理，滤液经大孔树脂纯化、乙醇溶液作为洗脱液，得三七总皂苷乙醇溶液，经过减压浓缩，真空干燥得三七总皂苷浸膏，三七药渣弃去；所述初步澄清处理是先在转速为4000转/分下进行高速离心、离心20分钟后取上清液，按照重量比1:50加入ZTC1+1天然澄清剂，进行初步澄清处理；

所述三七总皂苷浸膏制备过程中大孔树脂纯化处理是先采用D101型大孔吸附树脂对所述初步澄清处理后的三七醇提取液进行吸附分离、再采用D941型大孔弱碱性阴离子交换树脂进行脱色处理； 

所述采用D101型大孔吸附树脂吸附分离是用体积百分浓度为65~75%乙醇上柱对初步澄清处理后的三七醇提取液预吸附45~75分钟，然后用水洗除去糖等杂质至Molish反应呈阴性，再用体积百分浓度为65~75%的乙醇洗脱树脂，所述D101型大孔吸附树脂吸附容量为0.95~0.99 g.g^-1；

所述采用D941型大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色处理中上柱液溶剂和洗脱剂均采用体积百分浓度为70%的乙醇；

（3）、将所述丹参酮ⅡA晶体粉28～32份、丹参酚酸类成分浸膏粉68～72份、三七总皂苷浸膏粉58～62份、研细的冰片20～26份、填充剂160～180份、崩解剂15～25份和有效量质量百分浓度为 60%的聚乙二醇粘合剂混匀，过20目筛制粒，再加入润滑剂硬脂酸镁2～5份，压制成片、包薄膜衣制得；

所述崩解剂为低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚维酮中的一种或多种；所述填充剂为乳糖、微晶纤维素、淀粉中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：所述丹参酚酸类浸膏的制备是在所述萃取后的药渣中加入其2～3倍重量的水，-0.1MPa减压回流提取3次，每次2小时，合并提取液、在压力-0.1Mpa，温度为60℃条件下干燥，得水溶性丹参酚酸类浸膏；所述崩解剂为低取代羟丙基纤维素，所述填充剂为乳糖。

3.如权利要求1或2所述的制备工艺，其特征在于：所述萃取温度为40℃、时间为2h、压力为28Mpa；解析Ⅰ温度为23℃、时间为2.5h、压力为6.8Mpa，解析Ⅱ温度为21℃、时间为1.5h、压力为5Mpa。

4.如权利要求1或2所述的制备工艺，其特征在于：所述对丹参药材的粉碎粒度为24目，丹参药材的水分含量为7.0％，以质量百分含量计，CO2流量在14kg／h～18g／h。

5.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于：所述对丹参药材的粉碎粒度为24目，丹参药材的水分含量为7.0％，以质量百分含量计，CO2流量在15g／h。