CN107102021A - 一种海马1h‑nmr指纹图谱的构建方法和用途 - Google Patents

一种海马1h‑nmr指纹图谱的构建方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海马1H‑NMR指纹图谱的构建方法，主要通过采用核磁共振技术来获得动物药材海马的1H‑NMR指纹图谱；并通过化学成分指认鉴别，利用对照品对照并结合核磁共振谱峰化学位移及偶合常数进行分析，确定海马指纹图谱的特征峰，表征其所含化学成分；该方法可用于海马药材的品质评价和质量控制。本发明的有益效果是：通过核磁共振技术所构建的海马1H‑NMR指纹图谱，可同时表征20种化学成分，包括氨基酸、有机酸、生物碱等多种成分，较全面地反映了海马的化学成分和质量特征；并通过测定不同样品的核磁共振图谱，从化学结构组成方面分析对比，可准确有效评价和控制海马的质量。

Description

一种海马1H-NMR指纹图谱的构建方法和用途
技术领域
本发明涉及中药指纹图谱的构建方法，特别涉及一种海马的1H-NMR指纹图谱的构建方法，及其在海马质量控制方面的应用。
背景技术
海马是近陆浅海小型鱼类的一种，作为中药有很强的医学药用价值，能够温肾壮阳、散结消肿，在龟龄集、复方皂矾丸等经典复方中发挥治疗作用，但目前海马药材市场混乱，良莠不齐，缺乏可靠的质量监控手段，不利于原料药材的质量控制。
2015版《中国药典》收载药用海马五种，包括海龙科动物线纹海马（Hippocampuskelloggi Jordan et Snyder）、刺海马（Hippocampus histrix Kaup）、大海马（Hippocampus kuda Bleeker）、三斑海马（Hippocampus trimaculatus Leach）和小海马（海蛆，Hippocampus japonicus Kaup），而鉴别方法仅限于性状、显微鉴别，缺乏专属性成分研究和具体的表征方法分析，对药材质量评价存在一定难度。核磁共振图谱具有单一性，全面性，定量性和易辨性，能够提供大量的特征信号，从多方面多角度来描述样品的结构特征，因此应用核磁共振技术可以对含氢化合物进行测定，监测到多数有机化合物，能够在整体水平进行样品分析，对海马化学成分进行全面表征。本发明的目的在于采用核磁共振技术建立一种方法简单、操作便捷，可以对海马进行全面检测分析，从而实现有效质量控制的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有药材质量控制所面临的局限性，提供一种能够从整体水平较全面地表征海马化学成分信息的1H-NMR指纹图谱构建方法，并实现对海马的质量控制。主要内容如下：
一种海马1H-NMR指纹图谱的构建方法，包含以下步骤：
（1）称取海马粉末于离心管中，分别加入超纯水、甲醇、氯仿，涡旋，超声提取，离心后取上层清液至圆底烧瓶，减压浓缩蒸干；
（2）用氘代甲醇与缓冲重水溶解提取物，离心后移取上清液于核磁管中；
（3）将样品在25℃下于600MHz NMR仪上测定，采用noesygppr1d脉冲序列，测定频率600.13 MHz，扫描次数64次，谱宽12345.7Hz，脉冲时间14.0s，采样时间2.6542s，弛豫时间1.0s，采样数据点65536，FID分辨率0.188Hz，以Methnol-d4进行锁场。
其中，缓冲重水为KH2PO4溶于D2O，以1mol·L-1 氘代氢氧化钠溶液调节至pH=6.0的含0.05% 3-（三甲基硅基）丙酸钠盐的溶液。
对由上述构建方法得到的海马1H-NMR图谱进行化学成分指认鉴别，利用对照品对照并结合核磁共振谱峰化学位移及偶合常数进行分析，确定海马指纹图谱的特征峰包括：异亮氨酸（=0.960.02，t，J=7.2Hz；=1.030.02，d，J=6.6Hz）、亮氨酸（=0.970.02，t，J=6.6Hz）、缬氨酸（=1.010.02，d，J=7.2Hz；=1.060.02，d，J=7.2Hz）、乳酸（=1.330.02，d，J=7.2Hz；=4.060.02，q，J=7.2Hz）、丙氨酸（=1.490.02，d，J=7.2Hz）、乙酸（=1.930.02，s）、谷氨酸（=2.100.02，m；=2.380.02，m）、琥珀酸（=2.450.02，s）、肌酸（=2.750.02，s）、胆碱（=3.220.02，s）、甜菜碱（=3.280.02，s）、牛磺酸（=3.410.02，t，J=6.6Hz）、甘氨酸（=3.510.02，s）、甘油（=3.540.02，dd，J=6Hz，11.4Hz；=3.630.02，dd，J=4.2Hz，11.4Hz）、乳糖（=5.190.02，d，J=3.6Hz）、延胡索酸（=6.530.02，s）、酪氨酸（=6.850.02，d，J=8.4Hz；=7.180.02，d，J=8.4Hz）、腺嘌呤（=8.180.02，s）、肌苷（=8.220.02，s）、甲酸（=8.470.02，s）。
上述海马指纹图谱构建方法可用于海马的品质评价和质量控制，具体包括：
（1）可用于区分不同海马品种，包括以下步骤：收集不同品种海马样本，按照上述方法对各海马进行测试和图谱处理，得到不同品种海马的1H-NMR指纹图谱；以步长δ0.02ppm对各海马指纹图谱进行分段积分，积分段为δ-0.11～9.01，其中δ4.75～5.05（残余水峰）、δ3.29～3.33（残余甲醇峰）不进行积分，将积分后的数据导入SIMCA-P 13.0软件中进行PCA（主成分）分析。
（2）可用于测定不同海马的化学成分含量及均一性，包括以下步骤：收集不同品种海马样本，按照上述方法对各海马进行测试和图谱处理，得到不同海马的1H-NMR指纹图谱；对不同海马1H-NMR指纹图谱进行比较分析，以3-（三甲基硅基）丙酸钠盐峰面积为“1”，作为内标，计算各化学成分的相对含量。
其中所用海马为线纹海马，刺海马，大海马，三斑海马，小海马中的一种或多种。
本发明的有益效果是，通过核磁共振技术所构建的海马1H-NMR指纹图谱，可同时表征20种化学成分，包括氨基酸、有机酸、生物碱等多种成分，较全面地反映了海马的化学成分和质量特征；因此可通过测定不同样品的核磁共振图谱，从化学结构组成方面分析对比，有效评价和控制海马的质量。
附图说明
图1为海马的1H-NMR指纹图谱；
图2为不同品种海马的PCA散点图；
图3为不同品种海马的化学成分相对含量比较图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的内容做进一步说明，但不应理解为本发明的范围仅限于此，凡基于本发明的方法和内容所实现的技术均属于本发明的范围。
（一）海马1H-NMR指纹图谱的构建方法
1)样品制备
①称取海马粉末200mg于离心管中，分别加入超纯水、甲醇各1.5mL，氯仿3mL，涡旋，超声提取25min，3500rpm离心25min，取上层清液至圆底烧瓶，减压浓缩蒸干。
②将KH2PO4溶于D2O，以1mol·L−1 氘代氢氧化钠溶液调节至pH=6.0，得到含0.05% 3-（三甲基硅基）丙酸钠盐的溶液作为缓冲重水；用氘代甲醇400μL与缓冲重水400μL溶解提取物，13000rpm离心15min，移取上清液600μL于核磁管内，用于海马1H- NMR指纹图谱分析。
2)谱图采集：样品在25℃下于600MHz NMR仪上测定，采用noesygppr1d脉冲序列，测定频率600.13 MHz，扫描次数64次，谱宽12345.7Hz，脉冲时间14.0s，采样时间2.6542s，弛豫时间1.0s，采样数据点65536，FID分辨率0.188Hz，以Methnol-d4进行锁场。
3)谱图预处理：将谱图导入软件MestReNova (version 10.0，MestrelabResearch，Santiago de Compostella，Spain)，以3-（三甲基硅基）丙酸钠盐定标，进行基线调整和相位校正，指认图谱信息。海马的核磁共振氢谱见附图1，信号归属见表1。
表1 海马1H-NMR图谱特征指纹峰归属
编号 化合物 δ 1H
1 异亮氨酸 0.96（t,7.2Hz），1.03（d,6.6Hz）
2 亮氨酸 0.97（t,6.6Hz）
3 缬氨酸 1.01（d,7.2Hz），1.06（d,7.2Hz）
4 乳酸 1.33（d,7.2Hz），4.06（q,7.2Hz）
5 丙氨酸 1.49（d,7.2Hz）
6 乙酸 1.93（s）
7 谷氨酸 2.10（m），2.38（m）
8 琥珀酸 2.45（s）
9 肌酸 2.75（s）
10 胆碱 3.22（s）
11 甜菜碱 3.28（s）
12 牛磺酸 3.41（t,6.6Hz）
13 甘氨酸 3.51（s）
14 甘油 3.54（dd,6Hz,11.4Hz），3.63（dd,4.2Hz,11.4Hz）
15 乳糖 5.19（d,3.6Hz）
16 延胡索酸 6.53（s）
17 酪氨酸 6.85（d,8.4Hz），7.18（d,8.4Hz）
18 腺嘌呤 8.18（s）
19 肌苷 8.22（s）
20 甲酸 8.47（s）
（二）海马1H-NMR图谱构建方法的用途
（1）本方法用于区分不同海马品种
收集市售5个不同品种海马（记为：A线纹海马，B刺海马，C大海马，D三斑海马，E小海马）共30个样本（每个品种各6个），按照本发明内容所述方法对不同批次的海马进行核磁共振测试和图谱处理，得到不同品种海马的1H-NMR指纹图谱。以步长δ0.02ppm对海马核磁图谱进行分段积分，积分段为δ-0.11～9.01，其中δ4.75～5.05（残余水峰）、δ3.29～3.33（残余甲醇峰）不进行积分，将积分后的数据导入SIMCA-P 13.0软件中进行PCA（主成分）分析。
由附图2不同品种海马的PCA散点图可见，不同品种海马有明显分开的趋势，说明各品种海马化学成分存在一定差异，各有不同的组成结构倾向。其中A、C、D三个品种海马组内聚集程度较好，说明这三个品种海马质量均一稳定；B、E两个品种海马分别有3个、2个点在图上距离较远，说明B、E两个品种海马中存在成分差异较大的个体。
（2）本方法用于比较不同海马的化学成分含量及均一性
对（1）中得到的各品种海马1H-NMR指纹图谱进行比较分析，以3-（三甲基硅基）丙酸钠盐峰面积为“1”，作为内标，计算17种化学成分的相对含量。从附图3可以看出A组各种化学成分含量普遍较高，B、C两组则整体较低，而E组各样本间离散程度较大，组间存在较大差异。
由此可以看出，1H-NMR指纹图谱能够对其化学成分含量及均一性进行比较，以对海马质量进行控制。

Claims (7)

1.一种海马1H-NMR指纹图谱的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）称取海马粉末于离心管中，分别加入超纯水、甲醇、氯仿，涡旋，超声提取，离心后取上层清液至圆底烧瓶，减压浓缩蒸干；（2）用氘代甲醇与缓冲重水溶解提取物，离心后移取上清液于核磁管中；（3）将样品在25℃下于600MHz NMR仪上测定，采用noesygppr1d脉冲序列，测定频率600.13MHz，扫描次数64次，谱宽12345.7Hz，脉冲时间14.0s，采样时间2.6542s，弛豫时间1.0s，采样数据点65536，FID分辨率0.188Hz，以Methnol-d4进行锁场。
2.根据权利要求1所述的一种海马1H-NMR指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤（2）中缓冲重水为KH2PO4溶于D2O，以1mol·L−1 氘代氢氧化钠溶液调节至pH=6.0的含0.05%3-（三甲基硅基）丙酸钠盐的溶液。
3.根据权利要求1或2所述的一种海马1H-NMR指纹图谱的构建方法，其特征在于，对得到的海马1H-NMR图谱进行化学成分指认鉴别，利用对照品对照并结合核磁共振谱峰化学位移及偶合常数进行分析，确定海马指纹图谱的特征峰包括：异亮氨酸（=0.960.02，t，J=7.2Hz；=1.030.02，d，J=6.6Hz）、亮氨酸（=0.970.02，t，J=6.6Hz）、缬氨酸（=1.010.02，d，J=7.2Hz；=1.060.02，d，J=7.2Hz）、乳酸（=1.330.02，d，J=7.2Hz；=4.060.02，q，J=7.2Hz）、丙氨酸（=1.490.02，d，J=7.2Hz）、乙酸（=1.930.02，s）、谷氨酸（=2.100.02，m；=2.380.02，m）、琥珀酸（=2.450.02，s）、肌酸（=2.750.02，s）、胆碱（=3.220.02，s）、甜菜碱（=3.280.02，s）、牛磺酸（=3.410.02，t，J=6.6Hz）、甘氨酸（=3.510.02，s）、甘油（=3.540.02，dd，J=6Hz，11.4Hz；=3.630.02，dd，J=4.2Hz，11.4Hz）、乳糖（=5.190.02，d，J=3.6Hz）、延胡索酸（=6.530.02，s）、酪氨酸（=6.850.02，d，J=8.4Hz；=7.180.02，d，J=8.4Hz）、腺嘌呤（=8.180.02，s）、肌苷（=8.220.02，s）、甲酸（=8.470.02，s）。
4.权利要求3所述的海马指纹图谱构建方法的用途，其特征在于，可用于海马的品质评价和质量控制。
5.根据权利要求4所述的海马指纹图谱构建方法的用途，其特征在于，可用于区分不同海马品种，包括以下步骤：收集不同品种海马样本，按照上述方法对各海马进行测试和图谱处理，得到不同品种海马的1H-NMR指纹图谱；以步长δ0.02ppm对海马核磁图谱进行分段积分，积分段为δ-0.11～9.01，其中δ4.75～5.05（残余水峰）、δ3.29～3.33（残余甲醇峰）不进行积分，将积分后的数据导入SIMCA-P 13.0软件中进行PCA（主成分）分析。
6.根据权利要求4所述的海马指纹图谱构建方法的用途，其特征在于，可用于比较不同海马的化学成分含量及均一性，包括以下步骤：收集不同海马样本，按照上述方法对各海马进行测试和图谱处理，得到不同海马的1H-NMR指纹图谱；对不同海马1H -NMR指纹图谱进行比较分析，以3-（三甲基硅基）丙酸钠盐峰面积为“1”，作为内标，计算各化学成分的相对含量。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的海马指纹图谱构建方法的用途，其特征在于，所述海马样本为线纹海马，刺海马，大海马，三斑海马，小海马中的一种或多种。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109596660A (zh) * 2019-01-07 2019-04-09 山西大学 一种沁州黄小米的鉴别方法
CN109596661A (zh) * 2019-01-07 2019-04-09 山西大学 一种小米1h-nmr指纹图谱的构建方法和应用
CN109613190A (zh) * 2018-12-05 2019-04-12 中国科学院亚热带农业生态研究所 一种基于氨基酸组成的肉产品种类及品质鉴别方法
CN110346396A (zh) * 2019-07-18 2019-10-18 甘孜藏族自治州林业科学研究所 一种基于1h-nmr的甘松药材质量评价方法
CN111272894A (zh) * 2020-02-28 2020-06-12 山西大学 一种地龙1h nmr指纹图谱的构建方法与应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001033243A1 (en) * 1999-10-29 2001-05-10 Pharmacia Italia S.P.A. Use of double-quantum 1h-nmr spectroscopy for the identification of ligands interacting with target biomolecules
US7306952B2 (en) * 2002-06-26 2007-12-11 Washington University In St. Louis Molecular fingerprinting of triglycerides in biological samples by electrospray ionization tandem mass spectrometry
US20130265047A1 (en) * 2011-03-18 2013-10-10 Case Western Reserve University Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Fingerprinting
CN103674996A (zh) * 2012-10-24 2014-03-26 河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司 一种鉴别丹参药材或衍生品的方法
CN104181186A (zh) * 2014-09-03 2014-12-03 山西大学 一种黄芪注射液1h- nmr指纹图谱的构建方法
CN105954311A (zh) * 2016-06-22 2016-09-21 四川好医生攀西药业有限责任公司 美洲大蠊及其提取物的1h-nmr指纹图谱的构建方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001033243A1 (en) * 1999-10-29 2001-05-10 Pharmacia Italia S.P.A. Use of double-quantum 1h-nmr spectroscopy for the identification of ligands interacting with target biomolecules
US7306952B2 (en) * 2002-06-26 2007-12-11 Washington University In St. Louis Molecular fingerprinting of triglycerides in biological samples by electrospray ionization tandem mass spectrometry
US20130265047A1 (en) * 2011-03-18 2013-10-10 Case Western Reserve University Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Fingerprinting
CN103674996A (zh) * 2012-10-24 2014-03-26 河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司 一种鉴别丹参药材或衍生品的方法
CN104181186A (zh) * 2014-09-03 2014-12-03 山西大学 一种黄芪注射液1h- nmr指纹图谱的构建方法
CN105954311A (zh) * 2016-06-22 2016-09-21 四川好医生攀西药业有限责任公司 美洲大蠊及其提取物的1h-nmr指纹图谱的构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赵羽: "不同产地三七的1HNMR指纹图谱对比分析", 《分析试验室》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109613190A (zh) * 2018-12-05 2019-04-12 中国科学院亚热带农业生态研究所 一种基于氨基酸组成的肉产品种类及品质鉴别方法
CN109596660A (zh) * 2019-01-07 2019-04-09 山西大学 一种沁州黄小米的鉴别方法
CN109596661A (zh) * 2019-01-07 2019-04-09 山西大学 一种小米1h-nmr指纹图谱的构建方法和应用
CN110346396A (zh) * 2019-07-18 2019-10-18 甘孜藏族自治州林业科学研究所 一种基于1h-nmr的甘松药材质量评价方法
CN111272894A (zh) * 2020-02-28 2020-06-12 山西大学 一种地龙1h nmr指纹图谱的构建方法与应用

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