CN103713004A - 一种中药注射液的核磁共振检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核磁共振方式介导的丹红注射液的中药注射液检测方法，针对该中药注射液中氨基酸、有机酸和糖类化合物建立质子核磁共振(¹H-NMR)指纹图谱的定性、定量检测方法。该方法具有简便易行、稳定性好、精密度高、重现性好、专属性强等特点，在全面检测丹红注射液质量方面具有广阔的应用前景。

Description

一种中药注射液的核磁共振检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药注射液的检测方法，特别是涉及丹红注射液用核磁共振方式介导的检测方法，属于医药技术领域。 

背景技术

丹红注射液组方以丹参750份、红花250份组成，其中丹参为主药，红花为辅药的复方制剂。具有活血化瘀，通脉舒络，祛痰生新，除邪不伤正的功效。临床上用于治疗瘀血闭阻所致的胸痹及中风、冠心病、心绞痛、心肌梗塞等症。相关文献和专利已报道了有关丹红注射液的质量检测方法，建立了丹红注射液的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，尽管该方法具有许多优点，但仍然存在以下缺陷：①色谱分离损失：常用ODS色谱柱在分离过程中损失极性较大的水溶性成分。②缺乏通用型检测器：只能在同一张谱图下检测出某类或某几类化学成分。③标准品难分离：不易获得，为化学成分的鉴定和定量分析带来了困难，同时也提高了工业生产成本。因此，丹红注射液中的氨基酸、有机酸和糖类化合物是HPLC指纹图谱技术的检测盲点。 

近年由于核磁谱仪获得长足的进步，质子定量核磁(¹H-qNMR)的灵敏度、精确度、分析速度以及不确定度等方面已达到或接近HPLC的水平。在美国和欧洲¹H-qNMR方法因其特有优势而获得越来越多的关注，主要应用于药物的发现，药物含量测定和植物代谢产物的定量分析，在食品工业中用于食品产地的辨别、成分分析、真伪判定、质量评价等方面。继美国和欧洲等国将qNMR方法收录2008版药典之后，我国2010版药典也将qNMR方法收载于附录中。但在我国，定量核磁技术在药物或食品分析领域中的应用尚属起步阶段。与HPLC指纹图谱相比，以¹H-qNMR为基础的指纹图谱技术具有以下优势：①无需样品预分离，可避免由于预处理造成的成分丢失。②无需进行柱色谱分离，保持原有平衡环境，对样品无损伤，不破坏其结构和性质。③可提供详尽的分子结构信息，具有特征性和 可解析性。④无需标准对照品。质子信号峰与各个化学组分的氢原子一一对应，响应值和灵敏度无偏向性，质子信号峰的相对积分面积可反映各个化学组分的相对含量，不需额外制定标准曲线，具有可定量性。⑤随着400M-600M Hz核磁谱仪的普及和自动化的提高，仪器不再局限于科研院所，越来越多的药厂拥有一台甚至多台仪器，为该方法在工业生产中的应用提供了硬件保障。 

因此，本发明采用定性、定量的质子核磁共振指纹图谱技术，建立一种针对丹红注射液中氨基酸、有机酸和糖类化合物的质量检测方法，在工业生产中与HPLC指纹图谱联合使用，实现对丹红注射液产品的全面质量检测。 

发明内容

本发明目的是提供了一种名为丹红注射液的中药注射液的¹H-NMR指纹图谱质量检测方法，可以有效解决丹红注射液中氨基酸、有机酸和糖类化合物的含量测定问题，为丹红注射液全面质量检测奠定基础。 

本发明的技术方案是通过下列关键步骤实现的： 

①丹红注射液供试样品溶液的制备 

丹红注射液样品冻干后精密称取18mg，加入0.6ml D₂O，含内标3-三甲基硅基丙酸钠-d4(TSP)0.01g/ml，即得丹红注射液样品溶液，转移至5mm核磁管中，加封直接用于¹H-NMR测试。 

②标准品溶液的制备 

分别精密称取异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天门冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甲酸各5mg，溶于0.6ml D₂O(含内标TSP0.004g／ml)，即得标准品溶液，转移至5mm核磁管中，加封直接用于¹H-NMR测试。 

③¹H-NMR指纹图谱的测定 

将核磁管置于核磁共振仪中，采用水峰抑制脉冲序列测定丹红注射液样品溶液的¹H-NMR指纹图谱和标准品溶液的¹H-NMR图谱。优化的测试参数及条件为：抑水峰序列zgcppr，观测频率600.23MHz，测定温度298K，谱宽12019.2Hz， 90°脉冲宽度13μs，采样数据点65536，扫描次数16次，延迟时间2s，接受增益128。 

④质子信号峰的解析与鉴定 

丹红注射液对照品溶液的¹H-NMR图谱上质子信号峰分布在60-9.0之间(图1)，其中60.0-3.2是氨基酸和有机酸质子特征信号区，63.3-5.5是糖基质子特征信号区。根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，结合丹红注射液对照样品的二维核磁图谱信息和标准品溶液的¹H-NMR图谱(图2-图18)，鉴定出7个氨基酸类、4个有机酸类和6个糖类化合物，分别为： 

氨基酸类： 

异亮氨酸0.93(t)，1.00(d)，1.25(m)，1.45(m)，1.97(m) 

缬氨酸0.98(d)，1.03(d) 

苏氨酸1.31(d，6.7)，3.58(m)，4.25(m) 

丙氨酸1.47(d，7.4)，3.78(m) 

焦谷氨酸2.04(m)，2.41(m)，2.51(m)，4.18(m) 

脯氨酸2.00(m)，2.34(m)，3.34(m)，3.42(m)，4.14(m) 

天门冬氨酸2.76(dd)，2.97(dd)，3.99(m) 

有机酸类： 

乙酸1.92(s) 

琥珀酸2.42(s) 

丙二酸3.19(s) 

甲酸8.42(s) 

糖类： 

葡萄糖5.24(d)，4.56(d)，3.88(m)，3.81(m)，3.75(m)，3.69(m)，3.52(m)，3.48(m)，3.37(m)，3.24(m) 

果糖4.10(m)，4.04(m)，3.99(m)，3.89(m)，3.79(m)，3.67(m)，3.54(m) 

半乳糖5.26(d)，4.57(d)，4.07(m)，3.98(m)，3.92(m)，3.84(m)，3.79(m)， 3.73(m)，3.67(m)，3.48(m) 

鼠李糖5.18(d，1.7Hz)，3.91(m)，3.79(m)，3.43(m)，3.85(m)，3.92(m)，3.59(m)，3.37(m)，3.43(m) 

阿拉伯糖5.24(d)，4.51(d)，4.09(m)，4.04(m)，3.99(m)，3.94(m)，3.87(m)，3.80(m)，3.65(m)，3.50(m) 

芸香糖5.42(d)，4.50(d) 

⑤¹H-NMR多成分的含量测定 

选择17个化合物中独立的特征质子信号峰作为定量峰，3-三甲基硅基丙酸钠-d4(TSP)为内标化合物，应用以下公式测定丹红注射液中异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天门冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、芸香糖、甲酸的含量。 

$C_m=\frac{N_{\mathrm{TSP}}}{N_m}\·C_{\mathrm{TSP}}\frac{{A_0}_m}{{A_0}_{\mathrm{TSP}}}\·\frac{1-\exp (-t/T_{1\mathrm{TSP}})}{1-\exp (-t/T_{1m})}$

其中Cm和C_TSP分别为化合物和TSP的浓度，Am和A_TSP分别是化合物定量峰和TSP甲基峰的积分面积，Nm和N_TSP分别代表化合物定量峰和TSP甲基峰的质子个数，Tm和T_TSP分别是化合物和TSP的弛豫时间。 

⑥综合待测产品的¹H-NMR指纹图谱相似度信息和含量测定的结果评价注射液产品的质量。 

采用MetresNova软件对得到的¹H-NMR指纹图谱进行相位调整、基线校正、分段积分等数据处理。计算不同批次样品指纹图谱与对照指纹图谱的夹角余弦值、相关系数相似度；根据⑤项下方法测定氨基酸、有机酸和糖类等17个化合物的含量。 

本发明的原理是建立起丹红注射液的¹H-NMR指纹图谱，在一张图谱上同时完成了对丹红注射液中的氨基酸、有机酸和糖类成分的定性、定量检测，弥补了常用HPLC指纹图谱对上述成分无法检测的缺陷。本发明具有方法简便易行、稳定性好、精密度高、重现性好、专属性强等特点，在全面检测丹红注射液质量方 面具有广阔的应用前景。 

附图说明

图1为丹红注射液对照品溶液的¹H-NMR指纹图谱。 

图2-图18分别为异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、乙酸、丙氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、丙二酸、脯氨酸、天门冬氨酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甲酸、芸香糖标准品溶液的¹H-NMR图谱。 

图19为10批丹红注射液样品溶液¹H-NMR指纹图谱。 

具体实施方式

实施例1：丹红注射液¹H-NMR标准指纹图谱的建立 

1.1仪器与试药 

BRUKER AVANCE III600型超导核磁共振波谱仪，质子激发频率600.23MHz，配置BBFO正相观察宽带探头和BVT3200数字控温仪；美国Wilmad WG-5000核磁样品管；D₂O氘代度>99.8％，美国Norell公司生产；3-三甲基硅基丙酸钠-d4(TSP)氘代度>98％，Sigma-Aldrich公司生产；实验用丹红注射液为市售产品，规格为每支装10ml，生产厂家山东菏泽步长制药有限公司，10批样品批号分别为12051069，12051076，12051006，12051007，12061020，12061036，12061042，12061050，12071001，12071045。 

1.2丹红注射液供试品溶液的制备 

取丹红注射液样品于-80℃冰箱中迅速冷冻，再将其放入真空冷冻干燥箱中冻干后精密称取18mg，加入0.6ml D₂O(含内标TSP0.01g／ml)，转移至5mm核磁管中，加封直接用于¹H-NMR测试。 

1.3¹H-NMR指纹图谱的测定 

将核磁管置于核磁共振仪中，采用水峰抑制脉冲序列zgcppr测定丹红注射液样品溶液的¹H-NMR指纹图谱。观测频率600.23MHz，测定温度298K，谱宽12019.2Hz，90°脉冲宽度13μs，采样数据点65536，扫描次数16次，延迟时间2s，接受增益128。 

1.4¹H-NMR指纹图谱质子信号峰的鉴定 

¹H-NMR指纹图谱经过相位校正、基线校正和化学位移校正后，根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，结合丹红注射液对照样品的二维核磁图谱信息和标准品溶液的¹H-NMR图谱鉴定出异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天门冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、芸香糖、甲酸共17个氨基酸、有机酸和糖类化合物。选择各个化合物中特征质子信号峰作为定量峰(表1)。 

1.5方法学考察 

仪器精密度试验：取同一份丹红注射液供试品溶液，在上述¹H-NMR测试条件下连续6次测定指纹图谱，连续测定三天，17个化合物的特征质子信号峰积分面积RSD在0.20—1.62％，说明该方法日内和日间精密度良好。 

重复性试验：取同一批次丹红注射液供试品溶液6份，测试¹H-NMR指纹图谱，17个化合物的特征质子信号峰积分面积RSD在1.21-3.28％，表明该方法的重现性良好。 

稳定性试验：取同一份丹红注射液供试品溶液，分别在0，2，4，6h测试 ¹H-NMR指纹图谱，17个化合物的特征质子信号峰积分面积RSD在0.37-3.10％，表明供试品溶液在常温实验条件下稳定性良好。 

表1¹H-NMR定量质子信号峰和方法学考察 

1.6¹H-NMR指纹图谱相似度分析 

取10批丹红注射液待测产品，按上述方法测定¹H-NMR指纹图谱(图19)。应用MetresNova软件在60～9.0范围进行分段积分，以0.04为最小间隔积分，得到224个数据点，即每段化学位移值下的相对峰面积积分值，与制定的标准指纹图谱进行比较，采用相关系数法和夹角余弦值法计算定性相似度，相似度大于0.95则认为注射液合格。结果参见表2。 

表210批丹红注射液样品相似度考察 

1.7¹H-NMR测定丹红注射液中17个氨基酸、有机酸和糖类化合物的含量 

选择17化合物中独立的特征质子信号峰作为定量峰，应用2010版《中国药典》二部附录IX K中的核磁共振波谱绝对定量方法，引入内标基准物质3-三甲基硅基丙酸钠-d4(TSP)后，分别测定10批丹红注射液待测样品中的异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天门冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、芸香糖、甲酸的含量，结果参见表3。 

表3十批丹红注射液固含物的平均值(mg／ml) 

Claims (7)

1.一种中药注射液的核磁共振质量检测方法，制备该中药注射液的原料由丹参750份和红花250份组成，其特征在于质量检测方法包括以下步骤：

1)精密称取中药注射液冻干后的样品，加入含化学名称为3-三甲基硅基丙酸钠-d4，简写为含TSP的内标物的D₂O重水溶解，得中药注射液样品溶液；

2)分别精密称取异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天门冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甲酸，溶于含内标TSP的D₂O重水即得标准品溶液，转移至5mm核磁管中，加封直接用于¹H-NMR测试；

3)将核磁管置于核磁共振仪中，采用水峰抑制脉冲序列测定中药注射液样品溶液的¹H—NMR指纹图谱和标准品溶液的¹H—NMR图谱；

4)根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，结合中药注射液对照样品的二维核磁图谱信息和标准品溶液的¹H—NMR图谱，解析并鉴定中药注射液¹H—NMR指纹图谱上的质子特征信号峰；

5)选择17个化合物中独立的特征质子信号峰作为定量峰，TSP为内标化合物，测定中药注射液中异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天门冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、芸香糖、甲酸的含量；

6)综合待测产品的¹H—NMR指纹图谱相似度信息和含量测定的结果评价注射液产品的质量，即得。

2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：步骤1)中精密称取18mg中药注射液样品的冻干粉，加入含内标TSP0.02g／ml的0.6ml D₂O，即得中药注射液样品溶液。

3.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：步骤2)中分别精密称取异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天门冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甲酸各5mg，溶于含内标TSP0.004g／ml的0.6mlD₂O，即得标准品溶液。

4.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于步骤3)中优化的核磁测试参数和条件为：抑水峰序列zgcppr，观测频率600.23MHz，测定温度298K，谱宽12019.2Hz，90°脉冲宽度13μs，采样数据点65536，扫描次数16次，延迟时间2s，接受增益128。

5.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：步骤4)中鉴定出7个氨基酸类、4个有机酸类和6个糖类共17个化合物，分别为异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天门冬氨酸、丙二酸、甲酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和芸香糖。

6.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：步骤5)中按照以下公式计算17个成分的含量：

$C_m=\frac{N_{\mathrm{TSP}}}{N_m}\·C_{\mathrm{TSP}}\frac{{A_0}_m}{{A_0}_{\mathrm{TSP}}}\·\frac{1-\exp (-t/T_{1\mathrm{TSP}})}{1-\exp (-t/T_{1m})}$

其中C_m和C_TSP分别为化合物和TSP的浓度，A_m和A_TSP分别是化合物定量峰和TSP甲基峰的积分面积，N_m和N_TSP分别代表化合物定量峰和TSP甲基峰的质子个数，T_m和T_TSP分别是化合物和TSP的弛豫时间。

7.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：步骤6)中采用MetresNova软件对得到的¹H—NMR指纹图谱进行相位调整、基线校正、分段积分等数据处理，分别采用夹角余弦值、相关系数法评价不同批次样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，17个化合物含量总和达丹红注射液固含物的40％以上。

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