CN112067647B - 一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，该方法以葡萄糖氧化酶和酸化高锰酸钾作为反应底物，通过1H‑NMR检测弛豫时间的变化来计算被测样本中葡萄糖含量。具体包括步骤a)：将被测样本以一定比例加入无水乙醇或其他等效有机试剂混匀后静置，使样本中干扰蛋白变性沉淀；步骤b)：取上层清液蒸发残留有机试剂；步骤c)：分为A、B组分别加入检测液及对照液进行反应；步骤d)：用核磁共振仪器检测A、B组间弛豫差；步骤e)：根据测得的弛豫时间差与该样本类别下已知模型计算被测样本的葡萄糖含量。通过本发明方法，可以有效检测多种液体生物样本中的葡萄糖含量，有助于进一步研究核磁共振技术在生物糖检测方向的应用。

Description

一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法
技术领域
本发明属于生物化学方法分析检测技术领域，具体涉及一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法。
背景技术
近年来弛豫核磁共振技术被广泛应用于食品科学、生物检测等领域，但受限于弛豫核磁共振分辨率较低，对样本中小分子含量的微弱变化并不敏感，具体地，应用于液体生物样本中葡萄糖含量的检测时，由于生物样本如血液、唾液、尿液中的葡萄糖水平一般较低，仅有0-30mM，直接进行弛豫核磁共振检测难以准确测定其含量，因此需要设计方法扩大样本中葡萄糖含量不同引起的可检出量。
在本领域中已知的一种检测方法是基于目标诱导的MNP聚集的磁弛豫转换分析，通过经修饰的磁性纳米颗粒（MNP）的特异性吸附，放大葡萄糖引起的液体样本弛豫变化。但在复杂的生物样本中，由于MNP易发生非特异性吸附，不受控制的聚集会严重影响测定的准确性。在此基础上，本领域已提出的另一种解决方法是无MNPs磁性测定法的开发。水溶液中的Fe3+/Fe2+可以形成水离子，并且在同浓度的水溶液中，Fe2+的T1高于Fe3+。然而生物样本中除葡萄糖以外的其他物质也存在各种不同类型的氧化还原反应，同样会引起Fe3+和Fe2+之间的弛豫转化，极大干扰此检测方法的特异性。
葡萄糖氧化酶与葡萄糖的反应具有高度特异性，而高锰酸钾作为反应产物过氧化氢常用的指示剂，目前还未见其在葡萄糖含量检测中的相关报道。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于进一步拓展弛豫核磁共振技术在生物检测方向上的应用，提出一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，更具体地，是以葡萄糖氧化酶和酸化高锰酸钾作为反应底物，并利用有机试剂除去生物样本中原有的蛋白质干扰，通过1H-NMR弛豫检测高锰酸钾纵向弛豫时间的变化来计算被测样本中葡萄糖含量。
技术方案：本发明的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法通过如下技术方案予以实现：
以葡萄糖氧化酶和酸化高锰酸钾作为反应底物，并利用有机试剂除去生物样本中原有的蛋白质干扰，通过1H-NMR弛豫检测高锰酸钾弛豫时间的变化来计算被测样本中葡萄糖含量，该方法具体包括如下步骤：
步骤a.将被测液体生物样本加入无水乙醇或其他具有相同效果的有机试剂混匀后静置，使样本中大蛋白变性沉淀：液体生物样本事先进行预冷，随后加入同样经预冷的无水乙醇或其他有机试剂，充分翻转混匀后在预冷温度下静置，等待发生变性的蛋白质充分沉淀；
步骤b.取上层清液蒸发残留有机试剂：将产生沉淀的样本液进行离心，取出分离的上清液，分为等量的两份记为A、B组，置于干燥箱充分蒸发；
步骤c.将A、B组分别加入标准检测溶液及对照组空白溶液进行反应：A组加入含有葡萄糖氧化酶及高锰酸钾的酸性溶液，空白对照组B组加入只含有等浓度高锰酸钾的酸性溶液，分别混匀；
步骤d.用核磁共振仪器检测A、B组弛豫时间之差：将最终反应完成的A、B组分别取样进行核磁共振检测其弛豫时间T1、T2或其他可表征样本弛豫的测量量，两组弛豫时间的差值记为ΔT；
步骤e.根据测得的弛豫时间差与该样本种类已知的数据模型对照得出被测生物样本的葡萄糖含量：将被测液体生物样本的A、B组ΔT作为输入量代入已知的数据模型，得出的输出量即为测得的葡萄糖含量。
其中：
所述被测液体生物样本包括全血、血清、尿液、唾液及含有葡萄糖且质地为液体的生物来源类样本，其中具有一些干扰检测的白蛋白、球蛋白、粘蛋白，在有机溶剂中发生变性，产生絮状或团块状沉淀物。
所述蒸发残留是将液体样本敞口置于干燥箱中直至其中有机溶剂在高于其沸点的环境中蒸发完全。
所述标准检测溶液是将固体葡萄糖氧化酶及高锰酸钾溶解于pH 5的乙酸缓冲液中。
所述的葡萄糖氧化酶，其含量根据被测生物样本中葡萄糖含量的量级不同而有所区别；所述的高锰酸钾，其含量根据被测生物样本所需的检测上限不同而有所区别。
所述对照组空白溶液是将高锰酸钾溶解于pH 5的乙酸缓冲液中，终浓度与标准检测溶液中的高锰酸钾浓度一致。
所述核磁共振仪器为满足1H-NMR弛豫信号测量要求的低场核磁共振仪器，所述取样测量的样本量根据仪器要求有所不同。
所述弛豫时间利用反转回复脉冲序列IR或多回波测量序列CPMG测得。
所述已知的数据模型是对基础成分与被测样本一致，即同属血清、尿液或唾液，并且其葡萄糖含量已知的指定生物样本进行如上步骤的检测后获得的一系列ΔT与对应的葡萄糖浓度联立得到的数据模型，每类生物样本都具有与之对应的不同数据模型。
所述被测样本的检测仪器需与建立数据模型使用的弛豫核磁共振检测仪器一致，具有相同的质子共振频率、测试温度，使用相同的测量脉冲序列、扫描次数、回波间隔的一系列测量参数。
所述已标定葡萄糖浓度的生物样本为基础成分与被测样本一致，如同属血清、尿液或唾液，每类生物样本都具有与之对应的不同数据模型，并且其葡萄糖含量已知。
本发明中涉及的生物化学反应，具体地说，是葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下水解产生过氧化氢，使高锰酸钾氧化，其中金属离子状态的改变引起溶液弛豫特性的变化，反应方程如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 819409DEST_PATH_IMAGE002
金属离子影响溶液弛豫速率的本质是顺磁性金属的未配对电子自旋产生的局域场影响静磁场均匀性，而金属离子价性改变的实质是其磁矩、离子半径和电子自旋弛豫的变化，因此只要反应带来金属离子的价性改变，就相应导致溶液弛豫速率的变化，这种变化可以通过1H-NMR弛豫测量量化。
本发明的弛豫核磁共振检测液体生物样本葡萄糖含量的方法，与现有测定液体样本的弛豫核磁共振技术相比，通过引入金属离子，有效放大了样本随葡萄糖含量不同引起的弛豫变化，对生物样本中0-30mM范围极低浓度的葡萄糖含量更加适用。
本发明采用的1H-NMR法测定葡萄糖含量的方法，是将生物样本掺入有机试剂沉淀无关组分，清液加入葡萄糖氧化酶及酸化高锰酸钾反应后进行NMR弛豫测量，与常规NMR弛豫直接检测葡萄糖含量相比，极大提高了低葡萄糖浓度下的检测能力。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供了一种通过核磁共振弛豫法检测液体生物样本中葡萄糖含量的方法，与现有检测液体样本的弛豫核磁共振技术相比，通过引入的反应物，本发明对葡萄糖含量的微弱变化更为敏感，即采用葡萄糖氧化酶-酸化高锰酸钾的氧化还原反应，通过NMR测定出弛豫时间的变化，进而通过数据模型计算出原样本中的葡萄糖浓度。本发明采用的NMR弛豫法高效、检出限低，更适用于生物样本中低葡萄糖含量的检测。
附图说明
图1为本发明液体生物样本中葡萄糖含量检测的工艺流程图。
图2为本发明的ΔT1与葡萄糖浓度对照的数据模型示例，显示了实施例1中用已知葡萄糖浓度的牛血清白蛋白溶液样本定标绘制的纵向弛豫时间之差ΔT1与葡萄糖浓度的对照模型。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
检测BSA溶液样本，其葡萄糖含量未知。
1.量取样本500uL，放置于4℃预冷，加入1000uL同样在4℃预冷的无水乙醇，翻转混匀，放置于4℃沉淀20分钟，室温离心（3500转/分钟，10分钟）；
2.将步骤1离心所得上清液，分A、B组各取150uL，置于干燥箱85℃蒸发至完全；
3.对步骤2所得的干燥物A、B组，分别加入与BSA溶液样本对应的数据模型同配比的标准检测溶液及标准空白溶液各1mL，振荡溶解混匀，静置1小时使其充分反应；
4.将步骤3所得的反应完成后的样本各取200uL装入7.5mm核磁共振测试管，使用Bruker mq60低场核磁共振测量仪，测量脉冲为IR，扫描次数8次，采样点数21，进行纵向弛豫时间测量；
5.将步骤4得到的样本A、B组间的纵向弛豫时间之差ΔT1代入BSA溶液样本及步骤4使用的核磁共振仪器对应的数据模型，得到与该ΔT1对应的葡萄糖浓度值，即为被测样本的葡萄糖浓度。
实施例2
标准检测溶液及标准空白溶液的制作，以检测葡萄糖浓度范围1-20mM的样本为例。
1.根据反应方程计算所需的高锰酸钾低限浓度并适量放大。称取0.15g高锰酸钾，室温溶解于4mL pH 5的乙酸缓冲液中；
2.称取5mg葡萄糖氧化酶，室温溶解于4ml pH 5的乙酸缓冲液中；
3.量取2mL步骤2的葡萄糖氧化酶溶液，加入40uL步骤1的高锰酸钾溶液，翻转混匀，取其中1mL用pH 5的乙酸缓冲液稀释至20mL，得到标准检测溶液；
4.量取20uL步骤1的高锰酸钾溶液，用pH 5的乙酸缓冲液稀释至20mL，翻转混匀，得到标准空白溶液。
实施例3
特定类别下数据模型的建立，以BSA溶液样本为例。
1.称取2g牛血清白蛋白，室温溶解于40mL pH 5的乙酸缓冲溶液中，得到50g/LBSA溶液；
2.称取0.18g无水葡萄糖，室温溶解于10mL步骤1的BSA溶液中，得到葡萄糖浓度为100mM的BSA溶液；
3.分别量取40，80，120，160，200，240，280，320，360，400，440，480，520，560，600，640，680，720，760，800uL步骤2的葡萄糖浓度为100mM的BSA溶液，用步骤1的BSA溶液定容至4mL，得到葡萄糖浓度分别为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20mM的BSA溶液，放置于4℃预冷；
4.分别量取500uL步骤3得到的各浓度BSA溶液，加入1000uL同样在4℃预冷的无水乙醇，翻转混匀，放置于4℃沉淀20分钟，室温离心（3500转/分钟，10分钟）；
5.将步骤4离心所得上清液，分A、B组各取150uL，置于干燥箱85℃蒸发至完全；
6.对步骤5所得的每一葡萄糖浓度样本的干燥物A、B组，分别加入用于检测葡萄糖浓度区间1-20mM的标准检测溶液及标准空白溶液各1mL，振荡溶解混匀，静置1小时使其充分反应；
7.将步骤6所得的反应完成后的样本各取200uL装入7.5mm核磁共振测试管，使用Bruker mq60低场核磁共振测量仪，测量脉冲为IR，扫描次数8次，采样点数21，进行纵向弛豫时间测量；
8.以葡萄糖浓度作为横坐标，每一葡萄糖浓度样本A、B组间的纵向弛豫时间之差作为纵坐标，绘制出BSA溶液样本葡萄糖含量检测的数据模型标准曲线，如附图2所示，记为与BSA检测对象及Bruker mq60低场核磁共振测量仪对应的数据模型。
上述实施例为本发明针对牛血清白蛋白溶液样本的一种实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，以葡萄糖氧化酶和酸化高锰酸钾作为反应底物，并利用有机试剂除去生物样本中原有的蛋白质干扰，通过1H-NMR弛豫检测高锰酸钾弛豫时间的变化来计算被测样本中葡萄糖含量，该方法具体包括如下步骤：
步骤a.将被测液体生物样本加入无水乙醇或其他具有相同效果的有机试剂混匀后静置，使样本中大蛋白变性沉淀：液体生物样本事先进行预冷，随后加入同样经预冷的无水乙醇或其他具有相同效果的有机试剂，充分翻转混匀后在预冷温度下静置，等待发生变性的蛋白质充分沉淀；
步骤b.取上层清液蒸发残留有机试剂：将产生沉淀的样本液进行离心，取出分离的上清液，分为等量的两份记为A、B组，置于干燥箱充分蒸发；
步骤c.将A、B组分别加入标准检测溶液及对照组空白溶液进行反应：A组加入含有葡萄糖氧化酶及高锰酸钾的酸性溶液，空白对照组B组加入只含有等浓度高锰酸钾的酸性溶液，分别混匀；
步骤d.用核磁共振仪器检测A、B组弛豫时间之差：将最终反应完成的A、B组分别取样进行核磁共振检测其弛豫时间T1、T2或其他可表征样本弛豫的测量量，两组弛豫时间的差值记为ΔT；
步骤e.根据测得的弛豫时间差与该样本种类已知的数据模型对照得出被测生物样本的葡萄糖含量：将被测液体生物样本的A、B组ΔT作为输入量代入已知的数据模型，得出的输出量即为测得的葡萄糖含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述被测液体生物样本包括全血、血清、尿液、唾液及含有葡萄糖且质地为液体的生物来源类样本，其中具有一些干扰检测的白蛋白、球蛋白、粘蛋白，在有机溶剂中发生变性，产生絮状或团块状沉淀物。
3.根据权利要求1所述的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述蒸发残留是将液体样本敞口置于干燥箱中直至其中有机溶剂在高于其沸点的环境中蒸发完全。
4.根据权利要求1所述的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述标准检测溶液是将固体葡萄糖氧化酶及高锰酸钾溶解于pH 5的乙酸缓冲液中。
5.根据权利要求4所述的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶，其含量根据被测生物样本中葡萄糖含量的量级不同而有所区别；所述的高锰酸钾，其含量根据被测生物样本所需的检测上限不同而有所区别。
6.根据权利要求1所述的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述对照组空白溶液是将高锰酸钾溶解于pH 5的乙酸缓冲液中，终浓度与标准检测溶液中的高锰酸钾浓度一致。
7.根据权利要求1所述的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述核磁共振仪器为满足1H-NMR弛豫信号测量要求的低场核磁共振仪器，取样测量的样本量根据仪器要求有所不同。
8.根据权利要求1所述的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述弛豫时间利用反转回复脉冲序列IR或多回波测量序列CPMG测得。
9.根据权利要求1所述的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述已知的数据模型是对基础成分与被测样本一致，即同属血清、尿液或唾液，并且其葡萄糖含量已知的指定生物样本进行如上步骤的检测后获得的一系列ΔT与对应的葡萄糖浓度联立得到的数据模型，每类生物样本都具有与之对应的不同数据模型。
10.根据权利要求1所述的一种检测液体生物样本葡萄糖含量的弛豫核磁共振方法，其特征在于，所述被测样本的检测仪器需与建立数据模型使用的弛豫核磁共振检测仪器一致，具有相同的质子共振频率、测试温度，使用相同的测量脉冲序列、扫描次数、回波间隔的一系列测量参数。
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