CN104181186B - 一种黄芪注射液1h-nmr指纹图谱的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄芪注射液的1H‑NMR指纹图谱的构建方法，属于中药注射液质量控制领域。本发明采用核磁共振技术获得黄芪注射液的指纹图谱及其特征峰，能同时表征黄芪注射液中初级和次级代谢产物共25种化学成分，准确反映黄芪注射液的整体质量特征，可用于黄芪注射液产品的质量控制，保证临床用药的安全有效。

Description

一种黄芪注射液1H-NMR指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及中药注射液的质量控制方法，特别涉及一种黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱的构建方法。
背景技术
黄芪注射液是记载于中药部颁标准第17册中的经典处方，标准编号为WS3-B-3335-98，是由黄芪药材经水提醇沉法制备而成，具有益气养元，扶正祛邪，养心通脉，健脾利湿。可用于心气虚损、血脉瘀阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虚湿困之肝炎等症。
中药注射液质量控制方法的深入研究对于保证其有效性和临床使用安全性具有重要意义。黄芪注射液含有多种化学成分，但部颁标准(WS3-B-3335-98)只规定了黄芪甲苷的鉴别及含量测定方法。已有文献采用皂苷类或黄酮类成分含量测定或液相色谱指纹图谱方法对其质量控制方法进行了研究，检测指标均为黄芪注射液中的次级代谢产物。然而，除次级代谢产物外，黄芪注射液中还含有大量的初级代谢产物，且其含量远远高于次级代谢产物，对于黄芪注射液的质量均一性有重要影响。由于这类成分大多为色谱柱上保留较差的强极性物质，因此现有色谱指纹图谱难以检测。综上所述，为提高黄芪注射液的质量可控性，确保安全用药，需建立一种能从整体上有效地表征黄芪注射液化学组成的指纹图谱。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，对黄芪注射液的核磁共振指纹图谱进行研究，提供一种简便、快速、重现性好的黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱构建方法，其可表征黄芪注射液中各种化学成分信息和整体质量特征，从而全面控制黄芪注射液的质量。
本发明提供的一种黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
取黄芪注射液水浴上直接蒸干，取干粉30-70mg用氘代甲醇与重水的混合溶液800-1000μl溶解，转移至离心管中，10000～16000rpm离心10-15分钟，移取上清液600μl于核磁管中用核磁共振仪测试，谱图导入核磁数据处理软件，获得黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A；
取黄芪注射液20-40ml，加等体积的乙酸乙酯萃取2-3次，合并萃取液，浓缩至溶剂尽，加氘代甲醇溶解，10000～16000rpm离心10-15分钟，移取上清液600μl于核磁管中用核磁共振仪测试，谱图导入核磁数据处理软件，获得黄芪注射液1H-NMR指纹图谱B。
所述的混合溶液中重水和氘代甲醇的体积比为1:1。
进一步的一种黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
1)按上述黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱的构建方法，构建得到黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A和B；
2)利用标准品对照，结合黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A和B中的核磁共振信号的化学位移、峰形及偶合常数，进行分析，确定指纹图谱A和B的特征峰；
指纹图谱B(次级代谢物)的特征峰为：黄芪甲苷(δ＝0.25±0.02，d，J＝4.2Hz)、黄芪皂苷III(δ＝0.37±0.02，s)、毛蕊异黄酮苷(δ＝8.21±0.02，S)、芒柄花苷(δ＝7.49±0.02，d，J＝8.4Hz)、异黄烷苷(δ＝6.46±0.02，d，J＝8.4Hz)、紫檀烷苷(δ＝7.46±0.02，d，J＝8.4Hz)、黄芪碱F(δ＝8.54±0.02，s)；
指纹图谱A(初级代谢物)的特征峰为：丙氨酸(δ＝1.49±0.02，d，J＝7.2Hz)、苏氨酸(δ＝1.33±0.02，d，J＝6.6Hz)、缬氨酸(δ＝1.06±0.02，d，J＝10.2Hz)、甘氨酸(δ＝3.60±0.02，s)、脯氨酸(δ＝2.20±0.02，m)、天冬酰胺(δ＝2.90±0.02，m)、甲酸(δ＝8.46±0.02，s)、醋酸(δ＝1.95±0.02，s)、富马酸(δ＝6.53±0.02，s)、苹果酸(δ＝2.66±0.02，d，J＝3.0Hz)、琥珀酸(δ＝2.42±0.02，s)、蔗糖(δ＝5.46±0.02，d，J＝4.2Hz)、α-D-葡萄糖(δ＝5.20±0.02，d，J＝4.2Hz)、β-D-葡萄糖(δ＝4.60±0.02，d，J＝7.8Hz)、腺苷(δ＝6.03±0.02，d，J＝6.6Hz)、尿苷(δ＝7.93±0.02，d，J＝7.8Hz)、胆碱(δ＝3.21±0.02，s)、葫芦巴碱(δ＝9.15±0.02，s)。
所述的混合溶液中重水和氘代甲醇的体积比为1:1。
上述方法构建的黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱，能同时表征黄芪注射液中初级和次级代谢产物25种化学成分，均可以在黄芪注射液生产或质量检测中应用，从而保证临床用药的安全有效。
附图说明
图1黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A
图2黄芪注射液1H-NMR指纹图谱B
图3不同厂家黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A主成分分析散点图
图4不同厂家黄芪注射液1H-NMR指纹图谱B PLS-DA分析散点图
图5同一生产厂家13种初级代谢物相对含量柱状图，图中横坐标：1葫芦巴碱；2甲酸；3腺苷；4尿苷；5富马酸；6蔗糖；7甘氨酸；8胆碱；9琥珀酸；10醋酸；11丙氨酸；12苏氨酸；13缬氨酸。
图6不同生产厂家初级代谢物相对含量柱状图，图中横坐标：厂家A1(1、2)；厂家A2(3、4)；厂家A3(5、6)；厂家B(7、8)；厂家C(9、10)；厂家D(11、12)；厂家E1(13、14)；厂家E2(15、16)；
图7同一生产厂家同一次级代谢物相对含量柱状图，图中横坐标：1毛蕊异黄酮苷；2芒柄花苷；3紫檀烷苷；4异黄烷苷；5黄芪甲苷；6黄芪皂苷III；7黄芪碱F
具体实施方式
实施例1黄芪注射液1H-NMR指纹图谱的建立
1)样本制备：
①取黄芪注射液10ml直接蒸干，取干粉50mg，用氘代甲醇：重水＝1：1溶解，转移至1.5ml离心管中，13000rpm离心10分钟，移取600μL上清液于5mm核磁管中，用于黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A分析；
②取黄芪注射液30ml，加等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，蒸干，加800μL氘代甲醇溶解，转移至1.5ml离心管中，13000rpm离心10分钟，移取600μL上清液于5mm核磁管中用，用于黄芪注射液1H-NMR指纹图谱B分析；
2)谱图采集：样品在25℃下于600MHz NMR仪上测定，测定频率1H-NMR 600.13MHz，扫描范围-5～15ppm，扫描次数64次，黄芪注射液初级代谢产物采用noesyppr1d序列，黄芪注射液次级代谢产物采用ZG30序列，以Methnol-d4进行锁场。
3)谱图预处理：谱图导入MestReNova(version 8.0.1,Mestrelab Research,Santiago de Compostella,Spain)，以TSP或氘代甲醇溶剂峰定标，手动进行基线和相位校正；获得黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A和B，见图1和图2，信号归属见表1。指纹图谱A中反映的是黄芪注射液的初级代谢产物，而指纹图谱B反映的是黄芪注射液的次级代谢产物。
表1黄芪注射液中的特征指纹峰归属
实施例2本方法用于黄芪注射液的质量评价
收集市售5个不同生产厂家(记为：A、B、C、D、E)的黄芪注射液共8个批次(A厂家：3批次；B厂家：1批；C厂家：1批；D厂家：1批；E厂家：2批)，按照本发明内容中所确定的方法进行1H-NMR分析，得到不同厂家黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱A和B； 以δ0.04ppm积分段对指纹图谱A(化学位移区间0.34-10.02)和指纹图谱B(化学位移区间0.76-9.92)进行分段积分，其中δ4.80～5.06(残余水峰)和δ3.30～3.34(残余甲醇峰)不进行积分，将积分后的数据导入SIMCA-P 11.0软件中进行PCA(主成分分析)和PLS-DA(偏最小二辨别乘法)分析。
由黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A(图3)和1H-NMR指纹图谱B(图4)的统计分析结果可见，不同厂家的黄芪注射液明显不同，而同一厂家不同批次间的差异较小；A、B、E三个厂家的黄芪注射液样本距离较近，且与C、D厂家的样本相距较远，说明A、B、E三个厂家的黄芪注射液化学组成相似，与C、D厂家的黄芪注射液化学差异较大。
实施例3不同生产厂家黄芪注射液初级代谢产物的相对含量比较
对黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A进行分析，以TSP为内标，通过积分面积计算13种初级代谢产物的相对含量。从图5可以看出不同厂家之间初级代谢产物的相对含量及比例存在较大差异，厂家B、C中初级代谢产物种类较少，而同一厂家不同批次的黄芪注射液中13种初级代谢产物的相对含量及比例接近。从图6可以看出，同一初级代谢产物在不同厂家及同一厂家不同批次之间均有差异。由该实施例可以看出，核磁共振指纹图谱可以用于黄芪注射液中初级代谢产物的均一性比较。
实施例4不同生产厂家黄芪注射液次级代谢产物的相对含量比较
对黄芪注射液次级代谢产物图谱进行分析，以毛蕊异黄酮苷的含量为标准，通过积分面积计算其他次级代谢产物的相对含量。从图7可以看出，同一成分在不同厂家和同一厂家不同批次样本中的含量差异均比较大，如B和C厂家均无黄芪碱F，而C厂家中紫檀烷苷与毛蕊异黄酮苷的含量比值较高。由该实施例可以看出，核磁共振指纹图谱可以用于黄芪注射液中次级代谢产物的均一性比较。

Claims (3)

1.一种黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)取黄芪注射液水浴上直接蒸干，取干粉30-70mg用氘代甲醇与重水的混合溶液800-1000μl溶解，转移至离心管中，10000～16000rpm离心10-15分钟，移取上清液600μl于核磁管中用核磁共振仪测试，谱图导入核磁数据处理软件，获得黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A；
取黄芪注射液20-40ml，加等体积的乙酸乙酯萃取2-3次，合并萃取液，浓缩至溶剂尽，加氘代甲醇溶解，10000～16000rpm离心10-15分钟，移取上清液600μl于核磁管中用核磁共振仪测试，谱图导入核磁数据处理软件，获得黄芪注射液1H-NMR指纹图谱B；
2)利用标准品对照，结合黄芪注射液1H-NMR指纹图谱A和B中的核磁共振信号的化学位移、峰形及偶合常数，进行分析，确定指纹图谱A和B的特征峰；
指纹图谱B的特征峰为：黄芪甲苷、黄芪皂苷III、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、异黄烷苷、紫檀烷苷和黄芪碱F；
指纹图谱A的特征峰为：丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、甲酸、醋酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、蔗糖、α-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、腺苷、尿苷、胆碱和葫芦巴碱。
2.根据权利要求1所述的一种黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述的混合溶液中重水和氘代甲醇的体积比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法构建的黄芪注射液的1H-NMR指纹图谱在黄芪注射液生产或质量检测中的应用。
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