CN104297277B - 复方丹参滴丸1h-nmr指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种复方丹参滴丸1H‑NMR指纹图谱的测定方法，具体包括如下步骤：1)样品预处理：复方丹参滴丸溶解于纯水后加二氯甲烷混合离心，取上层水溶液冻干后溶解，备用；2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的激发频率、扫描次数和接受增益等；3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H‑NMR指纹图谱。
Description
技术领域：
本发明涉及一种药物制剂的检测，特别是一种复方丹参滴丸的核磁共振氢谱的检测方法。
背景技术：
复方丹参滴丸为天士力公司开发的活血化瘀、理气止痛中药，用于胸中憋闷、心绞痛，其主要成分为丹参、三七、冰片，其药理作用包括1增加冠脉血流量，2增加心肌耐缺氧保护缺血心肌，3抗血小板聚集防止血栓形成，4改善微循环。现有复方丹参滴丸的制备方法主要包括：将丹参、三七水煮提取得到提取液，将提取液浓缩得到浸膏，将浸膏和滴丸基质混合，放入滴丸机中，投料比为：提取物浸膏：基质=1：5.5，加入另一成分冰片90℃混匀，化料时间1.5小时，以液体石蜡为冷凝剂，冷凝液温度1℃，滴距7cm，滴速每分钟35滴制成复方丹参滴丸。
复方丹参滴丸生产过程中的质量控制和检测是一项复杂的工作，由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难以确保中药产品质量稳定性，中药指纹图谱建立的可以全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。
核磁共振是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下，吸收射频辐射而产生能跃迁的谱学技术。在核磁共振技术中，核磁共振氢谱(1H-NMR)目前研究得最为充分，且灵敏度和测试效率较高，应用范围广，积累的数据也最为丰富。1H-NMR指纹图谱测试具有以下优点：不因为色谱分离而损失样品中的组分；不破坏样品的结构和性质；对所有组分的灵敏度一致，无偏向性。同时，1H-NMR指纹图谱还可以提供化学位移、偶合常数、峰裂分情况以及峰面积等大量重要的结构信息。因此，1H-NMR作为一种波谱型指纹图谱与传统色谱型指纹图谱相比，在表征复方中药体系方面更具全面性和整体性。目前，1H-NMR指纹图谱与模式识别方法相结合已广泛应用于生物体液样品的代谢组学分析，以及中草药和食品质量监控与安全性等相关研究中。
但1H-NMR指纹图谱能否应用于复方丹参滴丸，在应用过程中会遇到哪些问题，应用条件是什么等问题是摆在研究者面前的重大课题，本发明人经过研究，有效的将核磁共振技术应用于复方丹参滴丸，有效的提高了产品的质量控制水平，同时找到了适合的测定方法和条件。
发明内容：
本发明将将核磁共振技术应用于复方丹参滴丸研究出了一种复方丹参滴丸的测定方法，所述方法采用1H-NMR技术在一定条件下测定复方丹参滴丸，以获得其1H-NMR图谱，通过获得的图谱和标准指纹图谱的比较，确定复方丹参滴丸的质量是否符合标准，本发明的测定方法，步骤如下：
1)样品预处理：取生产过程中得到的复方丹参滴丸，溶解于纯水后加二氯甲烷混合离心，取上层水溶液，加入D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，0.03～0.1g/mL，再加入二氯甲烷，涡旋混合，离心取上层水溶液，冻干，加入0.2-1倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
更优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声10～30min溶解0.03～0.1g/mL，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，冻干，加入0.2-1倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
特别优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声10～30min溶解，0.03～0.1g/mL，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，冻干，加入0.3-0.8倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
进一步特别优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声20min溶解，0.0625g/mL，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，冻干加入0.3-0.6倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
最优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
1)样品预处理：5粒25mg/粒复方丹参滴丸加入2mL纯水中，超声20min溶解，再加入3mL二氯甲烷，涡旋混合5min，4500转/min离心15min，取上层水溶液0.8mL冻干，加入0.45mL含0.05%TMSP的D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以100%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
本发明的另外一种测定方法，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，得0.25-1.25g/mL待测样品，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，加入1/7-1/10倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet、noesygppr1d在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
优选的，本发明的另外一种测定方法，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，得0.5-1g/mL待测样品，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，加入1/7-1/10倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)32-64次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以90%纯水-10%D2O溶液锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet、noesygppr1d在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
更优选的，本发明的另外一种测定方法，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声15min溶解，得0.75g/mL待测样品，再加入1.5倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合5min，于4500转/min离心15min，取上层水溶液，加入1/9所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)32-64次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以90%纯水-10%D2O溶液锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet、noesygppr1d在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
本发明应用1H-NMR技术建立复方丹参滴丸的指纹图谱，以相似度为指标，判别不同批次产品质量的一致性和稳定性，为其质量评价和控制提供一种新方法。本发明选取2008～2011年生产的不同批次复方丹参滴丸50份作为研究对象，样品经CH2Cl2处理后，以D2O为溶剂，在298K下采用预饱和水峰压制脉冲序列zgpr测定其1H-NMR指纹图谱。用MetresNova软件在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理，利用Excel软件进行相似度分析。结果发现，1H-NMR指纹图谱中芳香区和饱和脂肪区范围的质子信号表征了复方丹参滴丸中主要化学成分，50批复方丹参滴丸的相似度在0.9732～0.9956之间。因此，本发明所建立的复方丹参滴丸1H-NMR指纹图谱专属性强，准确可行，能全面、客观地反映其质量特征，可用于复方丹参类中药复方制剂的质量评价和控制。
本发明的复方丹参滴丸测定方法，尤其是测定条件等关键技术是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1仪器与试药
AVANCE III400超导核磁共振波谱仪(质子激发频率：400MHz)，配置BBO正向(Plus)观察宽带探头和VTU控温系统(德国Bruker公司)，LGJ-10D压盖型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)。美国Wilmad WG-5000核磁管(5mm)。D2O(氘代度>99.8%，含0.05%TMSP)购自青岛腾龙微波科技有限公司，娃哈哈纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司，二氯甲烷(分析纯)购自天津市福晨化学试剂厂。50批复方丹参滴丸由天士力制药集团股份有限公司提供(生产批号见表1)。2方法与结果
2.1供试样品处理
取5粒复方丹参滴丸置于10mL玻璃试管中，加入2mL纯水，超声15min溶解，再加入3mL二氯甲烷，涡旋5min，于4500rpm下离心15min，取上层水溶液0.8mL，冻干后用含0.05%TMSP的D2O溶解混匀，并转移至5mm核磁管中，加封后用于1H-NMR检测。
2.21H-NMR测试条件
实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128。
2.31H-NMR指纹图谱的测定
供试品在400MHz NMR上采用德国Bruker公司的Topspin3.0软件系统进行操控测试，以100%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.7处压制水峰，在2.2项的测试条件下测定1H-NMR图谱，得到一组FID信号。经过傅里叶变换、窗函数拟合、相位与基线校正后，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
2.4图谱与分析数据的处理
用MetresNova软件在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理，利用Excel软件进行相似度分析。
2.5双定性相似度计算方法[9,10]
N个数值组成的行(x1,x2,…,xn)称为N维向量，简记为大写字母X。如果存在两个向量X及Y则X，Y之间的向量夹角按照(1)式计算。如果cosθ越接近1则说明两个向量越相似。因此，将供试品的各指纹峰峰面积构成样品指纹向量X=(x1,x2,…,xn)，对照指纹图谱的各指纹峰峰面积构成对照指纹向量Y=(y1,y2,…,yn)，其中xi与yi为各指纹峰面积，计算X与Y的夹角余弦(公式1)，称为定性相似度S，该指标能清晰地反映样品化学成分与对照指纹图谱化学成分在分布比例上的相似程度，其特点是受大峰影响严重，很难反映小峰丢失。
若将对照指纹向量Y作P0=(1,1,…,1)，样品X作 Ps与P0间的夹角余弦见(2)式，称为比率定性相似度S’，它对所有指纹峰具有等权性，丢失1个大峰或一个很小峰都会使S’下降相同值，其特点是反映大峰变动不灵敏。因此，将S与S’构成双定性相似度Sm(公式3)，可灵敏地监测大峰或小峰的变动与缺失。
2.6方法学考察
2.6.1精密度实验取同一份复方丹参滴丸供试品溶液，在上述1H-NMR测试条件下连续6次测定指纹图谱，用2.4项下的方法处理图谱，得到一系列峰面积积分值。计算6组数据之间的相似度，结果均在0.99以上，表明仪器精密度良好。
2.6.2重复性实验取同一批次复方丹参滴丸供试品溶液6份，测试1H-NMR指纹图谱，计算6组数据之间的相似度，结果均在0.99以上，表明该方法的重复性良好。
2.6.3稳定性实验稳定性实验取同一份复方丹参滴丸供试品溶液，分别在室温放置0、2、6、24h后测试1H-NMR指纹图谱，计算上述各时间点所对应指纹图谱各段峰面积积分值之间的相似度，结果均在0.99以上，表明供试品溶液在室温实验条件下稳定性良好。
2.7指纹图谱相似度分析结果
将50批复方丹参滴丸样品按2.1项下方法制备成供试品溶液，采用2.2，2.3及2.4项下方法测定和处理指纹图谱，复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱见图1。选择平均矢量作为对照指纹图谱，采用公式3计算50批样品的Sm值，结果复方丹参滴丸的相似度0.9732～0.9956之间，结果见表1。
复方丹参滴丸由丹参、三七及冰片组成，其1H-NMR信号峰分部分布在δ0.0～10.0之间，主要分为3个特征区域：δ0.0～3.0的饱和脂肪区，δ3.0～5.5的糖基质子区以及δ5.5～10.0的芳香区。低场区δ5.5～10.0的芳香质子信号主要来自丹参中丹参酚酸类物质，如迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A等化合物。δ3.0～5.5的质子信号主要来自复方丹参滴丸中糖和糖苷类化合物。高场区δ0.0～3.0的饱和质子信号主要来源于三七中的三萜类物质，如三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等。根据上述分析，本次实验还考察了药材阴性对照液与复方丹参滴丸的相关性(见图2)，发现在复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱中，芳香区和饱和脂肪区范围的质子信号表征了其的主要成分特征及相对比例，而中药制剂的化学成分及其比例差异性则反应了其质量的变化。本实验对50批复方丹参滴丸指纹图谱进行研究，其相似度计算结果表明，尽管在化学位移和相对积分面积方面有一些差异，但是不同批次样品间指纹图谱主要峰群的整体面貌基本一致。
本发明首次建立了复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱，与传统的液相色谱指纹图谱相比具有对所有含氢组分灵敏度一致，无偏向性的特点，同时还可以提供化学位移、偶合常数、峰裂分情况以及峰面积等大量重要的结构信息，因此它能够更加全面表征了中药复方制剂中的多种复杂化学成分，可为复方丹参滴丸的质量评价以及质量标准的制定提供依据。
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附图说明：
图1复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱
图2药材阴性对照与复方丹参滴丸相关性考察
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
一种复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱测定方法，其步骤如下：
1)样品预处理：5粒25mg/粒复方丹参滴丸加入2mL纯水中，超声20min溶解，再加入3mL二氯甲烷，涡旋混合5min，4500转/min离心15min，取上层水溶液0.8mL冻干，加入0.45mL含0.05%TMSP的D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以100%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
实施例2
一种复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱测定方法，其步骤如下：
1)样品预处理：2粒25mg/粒复方丹参滴丸加入2mL纯水中，超声20min溶解，再加入3mL二氯甲烷，涡旋混合5min，4500转/min离心15min，取上层水溶液0.8mL冻干，加入0.16mL含0.05%TMSP的D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以100%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
实施例3
一种复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱测定方法，其步骤如下：
1)样品预处理：8粒25mg/粒复方丹参滴丸加入2mL纯水中，超声20min溶解，再加入3mL二氯甲烷，涡旋混合5min，4500转/min离心15min，取上层水溶液0.8mL冻干，加入0.8mL含0.05%TMSP的D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以100%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
实施例4
一种复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱测定方法，其步骤如下：
1)样品预处理：5粒25mg/粒复方丹参滴丸加入2mL纯水中，超声10min溶解，再加入2mL二氯甲烷，涡旋混合2min，3000转/min离心5min，取上层水溶液0.8mL冻干，加入0.45mL含0.05%TMSP的D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以100%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
实施例5
一种复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱测定方法，其步骤如下：
1)样品预处理：5粒25mg/粒复方丹参滴丸加入2mL纯水中，超声30min溶解，再加入6mL二氯甲烷，涡旋混合10min，6000转/min离心30min，取上层水溶液0.8mL冻干，加入0.45mL含0.05%TMSP的D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以100%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
实施例6
一种复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱测定方法，其步骤如下：
1)样品预处理：5粒25mg/粒复方丹参滴丸加入2mL纯水中，超声20min溶解，再加入3mL二氯甲烷，涡旋混合5min，4500转/min离心15min，取上层水溶液0.8mL冻干，加入0.24mL含0.05%TMSP的D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以100%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
实施例7
一种复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱测定方法，其步骤如下：
1)样品预处理：5粒25mg/粒复方丹参滴丸加入2mL纯水中，超声20min溶解，再加入3mL二氯甲烷，涡旋混合5min，4500转/min离心15min，取上层水溶液0.8mL冻干，加入0.64mL含0.05%TMSP的D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以100%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
实施例8
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声20min溶解，0.0625g/mL，再加入1倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2min，于3000转/min离心5min，取上层水溶液，冻干加入0.3倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
实施例9
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声20min溶解，0.0625g/mL，再加入3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合10min，于6000转/min离心30min，取上层水溶液，冻干加入0.6倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
实施例10
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声15min溶解，得0.75g/mL待测样品，再加入1.5倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合5min，于4500转/min离心15min，取上层水溶液，加入1/9所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)32-64次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以90%纯水-10%D2O溶液锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet、noesygppr1d在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
实施例11
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，得0.25g/mL待测样品，再加入1倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2min，于3000转/min离心5min，取上层水溶液，加入1/7倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet、noesygppr1d在δ4.65处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
实施例12
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，得1.25g/mL待测样品，再加入3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合10min，于6000转/min离心30min，取上层水溶液，加入1/10倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet、noesygppr1d在δ4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱。
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
实施例13
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，得0.5g/mL待测样品，再加入1倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2min，于3000转/min离心5min，取上层水溶液，加入1/7倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)32次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以90%纯水-10%D2O溶液锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet、noesygppr1d在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
实施例14
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，得1g/mL待测样品，再加入3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合10min，于6000转/min离心30min，取上层水溶液，加入1/10倍所取上层溶液体积的含0.05%TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)64次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以90%纯水-10%D2O溶液锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet、noesygppr1d在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
Claims (8)
1.一种复方丹参滴丸的质量测定方法，其特征在于，用1H-NMR技术测定复方丹参滴丸的指纹图谱，具体步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，0.03～0.1g/mL，再加入二氯甲烷，涡旋混合，离心取上层水溶液，冻干，加入0.2-1倍所取上层溶液体积的含0.05％TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)32-64次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声10～30min溶解0.03～0.1g/mL，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，冻干，加入0.2-1倍所取上层溶液体积的含0.05％TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声10～30min溶解，0.03～0.1g/mL，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，冻干，加入0.3-0.8倍所取上层溶液体积的含0.05％TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声20min溶解，0.0625g/mL，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，冻干加入0.3-0.6倍所取上层溶液体积的含0.05％TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤如下：
1)样品预处理：5粒25mg/粒复方丹参滴丸加入2mL纯水中，超声20min溶解，再加入3mL二氯甲烷，涡旋混合5min，4500转/min离心15min，取上层水溶液0.8mL冻干，加入0.45mL含0.05％TMSP的D2O溶解混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)16次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以100％D2O锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
6.一种复方丹参滴丸的质量测定方法，其特征在于，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，得0.25-1.25g/mL待测样品，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，加入1/7-1/10倍所取上层溶液体积的含0.05％TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：在实验室条件下，调整核磁共振波谱仪的扫描次数和接受增益；
3)图谱的测定：使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet和noesygppr1d在δ4.65～4.75处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
7.如权利要求6所述的测定方法，其特征在于，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声溶解，得0.5-1g/mL待测样品，再加入1-3倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合2～10min，于3000～6000转/min离心5～30min，取上层水溶液，加入1/7-1/10倍所取上层溶液体积的含0.05％TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)32-64次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以90％纯水-10％D2O溶液锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet和noesygppr1d在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：用软件计算样品图谱与标准图谱的相似度，用于评价待测样品复方丹参滴丸的质量。
8.如权利要求7所述的测定方法，其特征在于，步骤如下：
1)样品预处理：复方丹参滴丸加入纯水中，超声15min溶解，得0.75g/mL待测样品，再加入1.5倍样品体积二氯甲烷，涡旋混合5min，于4500转/min离心15min，取上层水溶液，加入1/9所取上层溶液体积的含0.05％TMSP的D2O混匀，备用；
2)测定条件：实验温度为298K；谱宽(SWH)6410.256Hz；采样数据点(TD)32768；扫描次数(NS)32-64次；延迟时间(D1)2s；接受增益(RG)128；
3)图谱的测定：以90％纯水-10％D2O溶液锁场，使用预饱和脉冲序列zgpr、zgcpgppr、wet和noesygppr1d在δ4.7处压制水峰，在上述测定条件下，得到复方丹参滴丸的1H-NMR指纹图谱；
4)相似度计算：所得的1H-NMR图谱在δ0.0～10.0范围进行分段积分，以0.04ppm为最小间隔积分，得到249个数据点，即每段化学位移下的相对峰面积积分值，并建立数据库，根据双定性相似度计算原理进行相似度分析。
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