CN104880478A - 一种检测甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用固体核磁共振内标法测定三类新药甘油磷酸胆碱(GPC)中GPC含量的方法。主要步骤如下：在试样中添加内标六甲基苯，采用Bruker Avance III 400MHz核磁共振波谱仪及宽带固体CP/MAS探头，采集样品的¹³C NMR谱图，进行谱峰归属，通过GPC、六甲基苯所含的甲基基团的¹³C峰面积进行计算GPC的含量。本发明对GPC的结构鉴定和定量分析同步完成，解决了我国三类新药GPC基准物质含量测定的技术问题，对于三类新药GPC开发及维护消费者利益，促进我国GPC药业健康发展，具有十分重要的意义，也可为后续研究核磁定量分析其他药物提供参考。

Description

一种检测甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的方法

技术领域

本发明属于三类新药甘油磷酸胆碱(Glycerophosphocholine，GPC，以下简称GPC)开发技术领域；具体涉及一种利用固体核磁共振内标法测定GPC药物中GPC含量的方法。

背景技术

随着世界人口老龄化的速度加快，老年痴呆症已成为危及老年人生命的第四大病因，严重威胁中老年人的身体健康和生活质量。因此老年性痴呆症的预防和治疗已成为医药研究的重大课题。甘油磷酸胆碱(简称GPC)是机体内磷脂代谢的产物之一，也是重要的神经传递介质乙酰胆碱(Acetylcholine)的生物合成前体。在体内，GPC最重要的生理功能在于穿过血脑屏障，为乙酰胆碱和磷脂酰胆碱的生物合成提供必要的胆碱。在GPC的生产和使用方面，国外以大豆磷脂为原料，通过酶解磷脂酰胆碱制备出甘油磷酸胆碱，并将GPC作为一种脑缺血型中风、阿尔茨海默式痴呆以及多发性脑梗死性痴呆的药物应用于临床上，同时在保健市场上，50％含量的GPC的产品也已经面世。在我国，目前还没有国家标准的制剂申请注册。开发三类新药GPC，可以降低其生产成本，减低药价，从而为患者提供更好的治疗。在新药的研制开发过程中，确定基准物质的含量是该过程的重要环节。赵艳艳等通过化学鉴别法、薄层色谱法以及红外吸收光谱图建立了GPC的鉴别标准，并建立了测定其含量的HPLC-ELSD法。利用HPLC测定其含量，前期处理复杂，需要保证GPC从药物中完全解离出来，测试步骤较多，耗时较长，定量时需要高纯度物质做对照。因此，开发一种简易可行，能够有效进行GPC含量测定的技术方法对于药物开发及维护消费者利益，促进我国三类新药行业健康发展，具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明是针对GPC定量分析方面存在的技术难题，提供一种采用固体核磁共振内标法对GPC药物中GPC含量进行分析的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的方法，其包括如下步骤：

步骤一、选择内标物；

步骤二、对待测物及内标物的各个¹³C峰进行归属，与有机化合物核磁共振碳谱数据库中相应的核磁共振碳谱进行比对确认，并明确每个¹³C峰所对应的原子个数；

步骤三、准确称取待测物及内标物，为保证积分的准确性，待测物中甘油磷酸胆碱的甲基与内标物的甲基的摩尔比控制在1：1，以保证待测物的甲基峰和内标的甲基峰面积相差不大，减少测定误差；研磨混匀后，进行固体¹³C NMR检测；

步骤四、记录试样的固体¹³C NMR谱，并在傅立叶变换、相位调整、基线校正及化学位移定标后积分，记录甘油磷酸胆碱甲基基团的峰面积A_G和内标物六甲基苯的甲基基团的峰面积A_H。对每一信号进行多次(不少于5次)积分，取平均值或去掉极值后取平均值进行后面的计算，以提高积分的准确性和重现性；

步骤五、利用所记录的固体¹³C NMR谱，计算甘油磷酸胆碱的含量，公式为：

$w_{\mathrm{GPC}}=\frac{w_H}{w_G}\×\frac{{6A}_G}{{3A}_H}\×\frac{M_G}{M_H}\×100...\left(1\right)$

式(1)中：

w_GPC—待测药品中GPC的质量分数；

w_G—试样中GPC药品的质量分数；

w_H—试样中内标物六甲基苯的质量分数；

A_G—GPC的甲基基团峰面积；

A_H—六甲基苯的甲基基团峰面积；

6—六甲基苯中甲基基团数；

3—GPC中甲基基团数；

M_G—GPC的摩尔质量，M_G＝257.5g/mol；

M_H—六甲基苯的摩尔质量，M_H＝162.2g/mol；

实验结果精确至0.1％(按质量分数计)。

所述内标物的选择标准为：纯度不低于99.7％，至少含有一个甲基，并在¹³C NMR谱图中表现为尖锐的单峰，且与所测样品的谱峰之间不产生干扰。

作为优选方案，所述固体¹³C NMR检测实验条件如下：¹³C观察频率为100.62MHz，谱宽为38265.305Hz，¹³C 90°脉冲宽度为3.30μs，质子去耦脉冲宽度为100μs，采样时间为0.0134s，弛豫延迟时间为25s，转速为5000Hz，采样次数为1428次，¹³C化学位移以甘氨酸羰基碳信号(相对于TMSδ176.03)为标准设定。

作为优选方案，进行固体¹³C NMR检测前，将样品过800μm筛后备用。

作为优选方案，所述内标物为六甲基苯，也可以使用3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸钠盐、丙氨酸等。

作为优选方案，对于过筛后样品中不能通过筛子的部分先进行研磨后，再次过筛。

核磁共振内标法用于定量分析的基础是各化学环境中不同¹³C的吸收面积只与所包含的¹³C原子数有关，不需要引入任何校正因子就可直接根据各共振峰的积分值推算所代表的自旋核的数量。由于NMR法测定药品含量时通常无需专用的药品基准物质，而仅以已知含量的普通化学物质做参比，就可得到药品的绝对含量，所以特别适用于对新药基准物质的含量测定。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的方法无需复杂的样品前处理，无需分离，直接固体进样，定量时无需化合物的纯品作为对照标准，可以对无对照品的药品进行含量分析和质量控制，结构鉴定和定量分析可同步完成，操作简单，分析速度快，成本低，解决了基准物质含量测定的技术问题，对于三类新药GPC开发及维护消费者利益，促进我国GPC药业健康发展，具有十分重要的意义，也可为后续研究核磁定量分析其他药物提供参考。

附图说明

图1为实施例1试样的固体¹³C NMR谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明中使用的仪器为BrukerAvance 400MHz核磁共振波谱仪及宽带固体CP/MAS探头；内标物为六甲苯(阿达玛斯试剂有限公司)；三类新药GPC(上海恩力检测技术有限公司提供)。

实施例1

2.1实验条件

设定¹³C观察频率为100.62MHz，谱宽为38265.305Hz，¹³C 90°脉冲宽度为3.30μs，质子去耦脉冲宽度为100μs，采样时间为0.0134s，弛豫延迟时间为25s，转速为5000Hz，采样次数为1428次，¹³C化学位移以甘氨酸羰基碳信号(相对于TMSδ为176.03)为标准设定。

2.2供试品样品制备

精确称取研磨后的GPC药物及六甲苯粉末各适量，将样品过800μm筛。样品不能通过筛子部分，再用螺旋式磨粉机研磨，直至全部通过800μm筛。充分混匀样品。

2.3内标及定量峰的选择

采用NMR进行定量时应首先对待测物及内标物的各个碳峰进行归属，与有机化合物核磁共振碳谱数据库中相应的核磁共振碳谱进行比对确认，并明确每个碳峰所对应的原子个数。内标纯度不低于99.7％，至少含有一个甲基，并在¹³C NMR谱图中表现为尖锐单峰；吸收峰与所测的样品峰之间应避免干扰。本发明选取六甲基苯为内标，样品的甲基峰与内标的甲基峰完全分离，表明两者未发生化学反应及产生缔合，因此，本发明选用样品的甲基峰(δ54.39)与内标的甲基峰(δ16.96)来进行定量计算。影响NMR定量测定准确性的关键在于对选定¹³C峰的准确积分。为保证积分的准确性，待测物中甘油磷酸胆碱的甲基与内标物的甲基的摩尔比控制在1：1，使样品峰和内标峰面积相差不大，以减少测定误差。本发明中，待测药品与内标物六甲基苯的质量比为7.31:1。测试结果如图1所示，δ54.39、δ16.96分别为GPC及六甲基苯的甲基的峰，峰面积分别为0.72及1.00。

2.4记录光谱

调整好核磁共振波谱仪至最佳状态，以得到合适的光谱。建议弛豫时间至少为15s。对于傅立叶变换核磁共振波谱仪，将FID(自由感应衰减)变换成光谱，并在相位调整、基线校正及化学位移定标后开始子程序的积分。记录GPC和内标物六甲基苯的甲基团的峰面积。

2.5结果计算

待测药物中GPC含量w_G以干药物粉末计，数值用％表示，按式(1)计算：

$w_{\mathrm{GPC}}=\frac{w_H}{w_G}\×\frac{{6A}_G}{{3A}_H}\×\frac{M_G}{M_H}\×100...\left(1\right)$

式中：

w_GPC—待测药品中GPC的质量分数；

w_G—试样中GPC药品的质量分数；

w_H—试样中内标物六甲基苯的质量分数；

A_G—GPC的甲基基团峰面积；

A_H—六甲基苯的甲基基团峰面积；

6—六甲基苯中甲基基团数；

3—GPC中甲基基团数；

M_G—GPC的摩尔质量，M_G＝257.5g/mol；

M_H—六甲基苯的摩尔质量，M_H＝162.2g/mol；

实验结果精确至0.1％(按质量分数计)。

本实施例中待测药品的GPC含量为31.7％，与不同实验室间HPLC协作标定的结果(未发表资料)相近，提示采用固体核磁共振内标法定量可以满足药品基准物质定量的要求。但固体核磁共振内标法测定更快速、简便。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种检测甘油磷酸胆碱药物中甘油磷酸胆碱含量的方法，其特征在于，

步骤一、选择内标物；

步骤二、对待测物及内标物的各个¹³C峰进行归属，与有机化合物核磁共振碳谱数据库中相应的核磁共振碳谱进行比对确认，并明确每个¹³C峰所对应的原子个数；

步骤三、准确称取待测物及内标物，为保证积分的准确性，待测物中甘油磷酸胆碱的甲基与内标物的甲基的摩尔比控制在1：1，以保证待测物的甲基峰和内标的甲基峰面积相差不大，减少测定误差；研磨混匀后，进行固体¹³C NMR检测；

步骤四、记录试样的固体¹³C NMR谱，并在傅立叶变换、相位调整、基线校正及化学位移定标后积分，记录甘油磷酸胆碱甲基基团的峰面积A_G和内标物六甲基苯的甲基基团的峰面积A_H。对每一信号进行不少于5次积分，取平均值或去掉极值后取平均值进行后面的计算，以提高积分的准确性和重现性；

步骤五、利用所记录的¹³C NMR谱，计算甘油磷酸胆碱的含量，公式为：

$w_{\mathrm{GPC}}=\frac{w_H}{w_G}\×\frac{{6A}_G}{{3A}_H}\×\frac{M_G}{M_H}\×100...\left(1\right)$

式(1)中：

w_GPC—待测药品中GPC的质量分数；

w_G—试样中GPC药品的质量分数；

w_H—试样中内标物六甲基苯的质量分数；

A_G—GPC的甲基基团峰面积；

A_H—六甲基苯的甲基基团峰面积；

6—六甲基苯中甲基基团数；

3—GPC中甲基基团数；

M_G—GPC的摩尔质量，M_G＝257.5g/mol；

M_H—六甲基苯的摩尔质量，M_H＝162.2g/mol；

实验结果精确至0.1％(按质量分数计)；

所述内标物的选择标准为：纯度不低于99.7％，至少含有1个甲基；内标物的甲基基团在¹³C NMR谱图中表现为尖锐的单峰，与所测样品的谱峰之间不产生干扰。

2.如权利要求书1所述的检测甘油磷酸胆碱药物中甘油磷酸胆碱含量的方法，其特征在于，所述固体¹³C NMR检测实验条件如下：¹³C观察频率为100.62MHz，谱宽为38265.305Hz，¹³C 90°脉冲宽度为3.30μs，质子去耦脉冲宽度为100μs，采样时间为0.0134s，弛豫延迟时间为25s，转速为5000Hz，采样次数为1428次，¹³C化学位移以甘氨酸羰基碳信号相对于TMSδ为176.03为标准设定。

3.如权利要求书1所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的方法，其特征在于，进行固体¹³C NMR检测前，将样品过800μm筛后备用。

4.如权利要求书1所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的方法，其特征在于，所述内标物可以为六甲基苯、3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸钠盐或丙氨酸。

5.如权利要求书3所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的方法，其特征在于，对于过筛后样品中不能通过筛子的部分先进行研磨后，再次过筛。