WO2014021592A1 - 자기공명분광법을 이용한 세포증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법, 이에 이용되는 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커 - Google Patents

자기공명분광법을 이용한 세포증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법, 이에 이용되는 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커 Download PDF

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differentiation
magnetic resonance
cells
resonance spectroscopy
cell
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PCT/KR2013/006755
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문치웅
장무영
천송이
강복만
곽소영
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인제대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a repetitive measurement and method of non-invasive cellular signals for living cells that maintain vital activity.
  • cell cultures A series of processes in which cells, the most basic unit of the human body, are appropriately grown in the external environment and continuously expanded or differentiated into other cells with different characteristics by adding specific growth factors are called cell cultures.
  • cell culture technology has become an indispensable field.
  • it is widely used in preclinical tests to determine whether to approve a drug through evaluation of cytotoxicity and to apply it to researches revealing the mechanism of disease.
  • Cells differ in shape and properties depending on the species or tissue site from which they are derived, and accordingly, there are differences in the types of metabolites produced through metabolism.
  • stem cells capable of inducing differentiation into various tissue cells, there are metabolites which are specifically found depending on what cells are to be differentiated.
  • the experiment to check the differentiation of the cells is mostly to observe the reaction result with the reagent, staining, PCR (Polymerase Chain Reaction), etc. are all the techniques belong to this. Since the described methods are invasive methods that cannot reuse cells after the reaction, a large number of specimens are required per experiment in order to verify the reproducibility through repeated experiments in the experiment using the cells, and thus the required cost is high. In addition, the existing test method must accept the error caused by applying the test on other specimens, and there is a limitation of the objectivity and reliability of the test result.
  • Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS and NMR) and Magnetic Resonance Imaging (MRI) techniques are non-invasive and non-destructive measurements of biological signals and are currently the leading edge of MRI in the medical field. Tissue contrast and various contrast parameters make it a popular diagnostic device.
  • MRI and MRS have a low level of sensitivity to volume, so the resolution of small objects smaller than a certain size is not good.
  • an MR device with a higher magnetic field is required, and even in a cell having a micrometer ( ⁇ m) unit, it is difficult to apply it.
  • An object of the present invention is to provide a measurement method that enables the reuse of the cells by non-invasive measurement of living cell signals that are active by using magnetic resonance spectroscopy (MRS), a non-invasive device 1
  • the present invention provides a method for measuring the state of cells, which can drastically reduce the cost and time required for each experiment.
  • Another object of the present invention to provide a biomarker that can confirm the proliferation and differentiation information for each cell through quantitative analysis of the peak appearing in the magnetic resonance spectroscopy.
  • non-invasive measurement of the cell signal provides a measurement method that enables the reuse of the cell, significantly reducing the cost and time for one experiment.
  • Another object of the present invention is to increase the objectivity and reproducibility of the results of the test through repeated experiments.
  • the present invention provides a novel cell differentiation biomarker for each cell through quantitative analysis of peaks appearing in magnetic resonance spectroscopy, focusing on the type and amount of metabolites that appear according to the type of cells. Do it.
  • non-invasive equipment using magnetic resonance spectroscopy can be used to non-invasive measurement of the cell signal by providing a measurement method that enables the reuse of the cell can significantly reduce the cost and time for one experiment. .
  • the present invention analyzes the magnetic resonance spectroscopy data obtained from a cell sample of a constant concentration, the cell using magnetic resonance spectroscopy to calculate the proliferation and differentiation information of the cell by measuring the spectral signal of the metabolite derived from the cell sample Provide a way to measure status.
  • the peak value of the metabolite may be used as a biomarker for judging cartilage differentiation.
  • Such metabolites include Fatty acids, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA, and any one of them.
  • differentiation can be used to determine differentiation.
  • the cartilage differentiation may be determined using 1.30 ppm of fatty acids in the metabolites, or may be used as a biomarker for determining fat differentiation.
  • the spectrum of the magnetic resonance spectroscopy signal produced by the cells is normalized according to the number of cells, and the cell differentiation by analyzing the metabolites measured from the spectral data normalized according to the number of cells. It is desirable to determine the measurement biomarker.
  • the spectral analysis of the metabolite can be determined by quantitatively analyzing the integral value of the spectrum represented by the metabolite generated during the differentiation period of the cell.
  • the support may be any one of alginate, fibrin gel, agarose gel, PLGA, and the like.
  • non-invasive measurement of a cell signal provides a measurement method that enables reuse of the cell, thereby dramatically reducing the cost and time required for a single experiment. There is also.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a method of measuring cell state using magnetic resonance spectroscopy and a method of applying a proliferation / differentiation marker (biomarker) used therein.
  • Figure 2 is a schematic diagram of the test tube (NMR tube) containing the culture medium and the 3D support.
  • Figure 3 is a schematic diagram of a container containing a cell and a medium seeded in a high frequency coil for magnetic resonance measurement and a 3D support located inside the coil.
  • Figure 4 shows the magnetic resonance spectroscopic signal changes by cell concentration performed to obtain a human mesenchymal stem cell signal using magnetic resonance spectroscopy according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is magnetic resonance spectral data (spectrum) obtained from undifferentiated human mesenchymal stem cells according to an embodiment of the present invention.
  • ⁇ 6 is magnetic resonance spectral data (spectrum) obtained by inducing differentiation into chondrocytes from human mesenchymal stem cells for 4 days according to an embodiment of the present invention.
  • ⁇ 7 is magnetic resonance spectral data (spectrum) obtained by inducing differentiation into chondrocytes from human mesenchymal stem cells for 7 days according to an embodiment of the present invention.
  • spectral 8 is magnetic resonance spectral data (spectrum) obtained by inducing differentiation into chondrocytes from human mesenchymal stem cells for 11 days according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is magnetic resonance spectral data (spectrum) obtained by inducing differentiation into chondrocytes from human mesenchymal stem cells for 15 days according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 is a graph measuring the spectral peak change of fatty acids (fatty acid 1-6) shown in the magnetic resonance spectroscopy data of cartilage differentiation stem cells obtained according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 is a graph measuring the change of metabolites other than fatty acids shown in the magnetic resonance spectroscopic data of cartilage differentiated stem cells obtained according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12 is a graph measuring the change in fatty acids shown in the magnetic resonance spectroscopic data of the adipose differentiation stem cells obtained according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to a measurement method for evaluating the state of proliferation and differentiation of cells using magnetic resonance spectroscopy and to evaluate the state of cells more objectively by reusing the cells. It is a summary to provide a marker.
  • the present invention analyzes the magnetic resonance spectroscopy data repeatedly obtained at a specific time in the process of inducing differentiation from a stem cell sample of a constant concentration, the cell proliferation and differentiation information by measuring the metabolite signal from the cell sample To provide a method for measuring the state of the cell using magnetic resonance spectroscopy.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a method of measuring cell state using magnetic resonance spectroscopy and a method of applying a differentiation marker (biomarker) used therein.
  • a method for measuring cell states using magnetic resonance spectroscopy basically measures a magnetic resonance spectroscopic signal from a prepared cell using a magnetic resonance spectrometer and normalizes the magnetic resonance signal according to the measured cell concentration.
  • the differentiation markers hereinafter referred to as 'biomarkers'
  • 'biomarkers' determined by comparing metabolites representing changes in the spectrum measured during cell differentiation can be used to determine the differentiation and proliferation of cells.
  • the biomarker determined by measuring the integral value of the metabolite peak after normalizing each spectrum with the measured cell concentration when analyzing the magnetic resonance spectroscopy data acquired according to the proliferation and differentiation period quantitatively measures the proliferation and differentiation state of the cells.
  • By comparing the respective integration values it is possible to determine and compare the degree of proliferation / differentiation of the cells, that is, the state of the cells.
  • the procedure is performed except for determining the biomarker, and magnetic resonance spectroscopy data is again measured in the used cell to determine and compare the state of the cells.
  • the types of cells to which the non-invasive measurement method of cell proliferation and differentiation using magnetic resonance spectroscopy according to the present invention are applicable are not limited, and when the types of cells are different or the types of differentiation are different, If only the concentration of metabolites found is specified, various metabolites can be used as biomarkers to determine the degree of proliferation and differentiation of cells.
  • FIG. 2 is a general schematic diagram of the sample of the present invention, the sample used in the present invention, that is, the cell sample is in the 3D culture support 20 accommodated inside the magnetic resonance spectroscopy (NMR tube; 10)
  • the culture support 20 is where the cells are cultured, and the liquid filled around the support 20 is a medium 30 that supplies nutrients necessary for the survival of the cells. That is, the cell sample according to the present invention is supplied with nutrients provided by the medium 30 to maintain the viability, the solid material 40 is adjusted to the cell sample is located in the center of the magnetic resonance coil, the optimum magnetic resonance signal Substances such as 'agarose gel' may be filled in the lower part of the test tube in order to obtain.
  • NMR tube magnetic resonance spectroscopy
  • the method of culturing cells on the support 20 can be applied to the method of three-dimensional culture of the cells (scaffold) having a three-dimensional structure (scaffold)
  • various supports of suitable materials such as alginate, fibrin gel, and polymer material (PLGA) can be selected. It may also include a method of making the 3D support seeded with cells suspended in the medium to seed the cells after seeding the 3D support, and a method of using a rotating culture chamber to better penetrate the medium. .
  • the medium should be added in a sufficient amount so that the 3D support is completely submerged, and may vary depending on the type of cells, but the medium must be changed at regular intervals, and the type of medium may also be used for optimal growth of the cells. It may include selecting a kind that can be.
  • one embodiment of the present invention may be applied to the 3D culture method of culturing in Alginate bead as part of measuring the signal of living cells using magnetic resonance spectroscopy.
  • cells can be seeded by adjusting the number of cells contained per unit dose in the 3D support to a desired concentration, and as an example of overcoming the low sensitivity of the magnetic resonance device, spectral signal observation of cells in a magnetic field of 14.1T It may include the concentration of the cells to be at least 2x10 6 / ml.
  • concentration of the cells since the size and resolution of the signal vary according to the magnetic field strength of the magnetic resonance apparatus used, it is preferable to apply the optimum concentration by controlling the concentration of cells differently according to the apparatus.
  • the concentration of the seeded cells according to the conditions (magnetic field strength) of the magnetic resonance scanner used at the time of measurement is optimal (1 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 6 / ml in 14.1T) It will be described with an example of applying the experiment.
  • it may include a method for measuring magnetic resonance spectroscopy including both the 3D support and the medium, and the proliferation or differentiation for a period of time without a series of processes for separating the 3D support and the cell in order to acquire the signal of the cell non-invasively.
  • the container shown in Figures 2 and 3 are cultured together with the 3D support, the medium, the cells together and the magnetic resonance measurement is performed as it is cultured.
  • the process of separating the 3D supporter and the cell is indispensable, whereas the magnetic resonance measurement method according to an embodiment of the present invention measures all of the cells at once without processing the sample. Since there is no loss, the cells can be reused.
  • the concentration of cells cultured on a support formed of a material such as Alginate shown in FIG. 2 is shown in the magnetic resonance spectral spectrum at a level of 1 to 2 ⁇ 10 6 / ml or more when the 14.1T NMR apparatus is used. Sowing may be included.
  • the medium 30 is used to select the recommended medium according to the type of cells and the type of cells to be differentiated and generally should be replaced every 3 to 4 days.
  • a glass tube for medium suction is used, and after removing the existing medium by a suction method using a pump, new medium may be added.
  • the number of cells included per unit dose may be adjusted so that the concentration appropriate for the experiment may be freely controlled and sown.
  • Alginate bead is solidified in a state where the alginate, the medium and the cells are uniformly distributed together. As a result, the same amount of cells is sown in one baed.
  • the number of cells seeded in one bead and the number of beads used in the magnetic resonance spectroscopy measurement as shown in FIG. 2 may determine the total number of cells used in the experiment. Through this, even if the cell concentration used in magnetic resonance spectroscopy is different, if the total number of cells can be identified, it is possible to compare the expression levels of metabolites by normalizing each acquired spectrum to the level for the same cell concentration.
  • the cell counting method using a hematocytometer which can identify living and dead cells through simple staining, and does not require separate 3D support and cell separation, is an example. have.
  • Magnetic resonance spectroscopy for performing the method of measuring cell differentiation in FIG. 2 may be formed and applied to the structure shown in FIG. 3.
  • the configuration of the device is exemplary, the magnetic resonance spectroscopy technique to which the biomarker according to the present invention is applied is not limited thereto.
  • the amount of Alginate bead to be measured by a magnetic resonance spectrometer may be customized to the high frequency coil 50 according to the device as shown in FIG. 3.
  • the Alginate bead is contained in the measuring vessel 60 in accordance with the size of the high frequency coil 50 so that the signal is optimally distributed.
  • the high frequency coil 50 for measuring the MR signal may be used in various forms, for example, may be in various forms such as a solenoid, a surface, and a quorum.
  • the container 60 in FIG. 3 contains Alginate and a medium, and various containers can be used depending on the shape of the coil.
  • the alginate bead that is, the culture support 30, in which the cells are seeded, may be measured in the container 60 so as to be distributed over the entire coil portion in order to obtain the MR signal optimally.
  • Cell differentiation measuring method can be applied to a series of magnetic resonance devices that can acquire spectral data non-invasive and non-destructive, such as magnetic resonance spectroscopy and magnetic resonance imaging.
  • the signal can be measured by using an easy container other than the magnetic resonance spectroscopy tube for use in the magnetic resonance imaging device.
  • the magnetic resonance spectroscopy method is a non-invasive method, so that the meas- urement can be remeasured with respect to the same specimen after redistributing the completed specimen with the container for a desired period.
  • magnetic resonance spectroscopy is used to determine the differentiation and proliferation of cells in the cell differentiation state according to the present invention.
  • the metabolites proliferate during the proliferation / differentiation period of the cell.
  • Differentiation markers (biomarkers) and metabolites that show no change are determined by signals from the 3D support.
  • magnetic resonance spectroscopy is a method for observing changes in metabolites during cell proliferation and differentiation, and may be determined by comparing integral values with peaks appearing on a spectrum.
  • a method of acquiring data including the same amount of reference material at a concentration of 0 ppm and then normalizing the spectrum by fitting the reference material to the same size in each spectrum may be used.
  • the measurement of the cell in order to exclude a case in which the reference material is not included in the same amount or uses a reference material that may adversely affect the cell, the measurement of the cell to compare the signals between the spectra at the same level as described above It is preferable to use a method of normalizing each spectrum using the number of cells measured in the same sample so that the numbers can be identified and compared at the same cell concentration.
  • the normalization method using the number of cells measures the number of cells for each of the measured specimens.
  • normalization for quantitative analysis can be performed even if the seeding amount is not sown. Will be implemented.
  • a commonly used cell counting method such as a cell counting using a hematocytometer and a DNA assay may be used as a method for determining the number of cells in order to compare the results of quantitative analysis of magnetic resonance spectroscopy and cell proliferation / differentiation.
  • the determination of the proliferation / differentiation state of the cell sample according to the present invention can be performed through the change of metabolites determined by acquiring and comparing the magnetic resonance spectroscopy data according to the proliferation / differentiation period of the cells.
  • the metabolites used herein can be biomarkers that can indicate the proliferation / differentiation state of cells. Biomarkers using these metabolites can be applied to a variety of cells if the concentration of the measured cells is known to determine the degree of proliferation / differentiation by comparing the integration value of the metabolites with the biomarkers.
  • FIG. 4 is spectral data (spectrum) obtained after seeding at different concentrations of human mesenchymal stem cells in order to confirm low MR sensitivity of 3D cultured cells.
  • the optimal cell concentration at which magnetic resonance signals can be obtained can be determined.
  • the concentration of the cells to be seeded it can be realized by varying the number of cells included per unit dose as specified above, and the concentration is wide ranging from 1x10 6 to 1x10 7 / ml or more.
  • the cell proliferation criteria for magnetic resonance spectroscopy can be determined by measuring and analyzing metabolic changes according to the number of cells after seeding by varying the concentration of cells in the same amount of 3D support.
  • the case of using a magnetic resonance imaging apparatus of 14.1T 5x10 5 / ml or less in the signal only and the observed signal is not detected over a 2x10 6 / ml concentration of the cells derived from the cell culture medium and alginate and 3.22ppm
  • the signal intensity is increased enough to be observed with the naked eye.
  • the steady increase is more than 2x10 6 / ml can be used as a marker for evaluating the proliferation and differentiation of cells by calculating the integration value for each peak and comparing the amount of change.
  • the peak of 3.22ppm since it is a metabolite signal that does not overlap with the medium and Alginate signal, it can be utilized as a proliferation and differentiation marker.
  • 5 to 9 are spectral data (spectrum) of measuring cellular signals during cartilage differentiation period by applying the above-described 3D culture method according to the present invention.
  • FIG. 5 is the first spectrum applying the cell culture method for human mesenchymal stem cells (hMSCs)
  • Figure 6 is the spectrum of cartilage differentiation 4 days for hMSCs
  • Figure 7 is the spectrum of cartilage differentiation 7 days for hMSCs
  • Figure 8 Is the spectrum at day 11 of cartilage differentiation for hMSCs
  • FIG. 9 shows the spectrum at day 15 of cartilage differentiation for hMSCs.
  • the biomarker for measuring cell differentiation for magnetic resonance spectroscopy can be determined by quantitatively analyzing the integral value of each metabolite.
  • the spectral peaks always appear at the same position (ppm), and the amount of the metabolites is reflected in the integral value of the peaks on the spectrum.
  • Markers may have unique values depending on the type of cells and the degree of differentiation.
  • the spectral data (spectrum) obtained for the quantitative analysis according to the type of metabolite should be normalized.
  • a method of adding the same reference material appearing at 0 ppm and normalizing the remaining peaks based on the same amount may be applied.
  • the normalization method according to an embodiment of the present invention can be used to determine the number of cells without the addition of a reference to normalize the spectrum according to the number of cells.
  • normalization is possible even when unequal amounts of reference material are contained, and cell loss can be prevented by not including a reference material that can damage cells.
  • the normalization method through the number of such cells is possible to determine the proliferation / differentiation status even if the cells seeded at different concentrations (different experimental conditions) are the same as the types of cells used and the types of cells for differentiation. Has the advantage.
  • a differentiation marker capable of non-invasive cell differentiation can be determined through quantitative comparison of metabolite changes on the spectrum shown in FIGS. You can decide.
  • in order to analyze the cell signal it is necessary to remove a relatively large observed water (H 2 O) signal, which is solved by using the MR pulse sequence with water signal suppression function.
  • FIGS. 10 and 11 are graphs showing the metabolic change amount (integrated value of peaks) showing a change in spectral data (spectrum) obtained during the cartilage differentiation period shown in FIGS. 5 to 9. By grasping, the degree of differentiation can be observed.
  • the amount of fatty acid change was observed stepwise according to the differentiation period, and in the case of 1.30 ppm of fatty acid (fatty acid 2), the amount of fatty acid changed significantly compared to other metabolites.
  • magnetic resonance spectroscopy of specimens sown at the same concentration can determine the degree of cartilage differentiation by observing 1.30 ppm of fatty acids according to the differentiation period.
  • metabolites which are reduced in amount immediately after cartilage differentiation and then remain constant can be found. These metabolites can be used as differentiation markers to determine cartilage differentiation.
  • the phosphocholine shown in Figure 11 is also observed to increase step by step during the cartilage differentiation period can be used as a differentiation marker that can indicate the cartilage differentiation state according to the differentiation induction period. Therefore, metabolites such as Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, and GABA can be used as biomarkers for judging cartilage differentiation.
  • FIG. 12 is another embodiment of the present invention is a figure showing the amount of change in the peak integral value of the fat metabolism spectrum showing a change in the spectrum changed during the differentiation of human mesenchymal stem cells to fat in the metabolites change By grasping, the degree of differentiation can be observed.
  • cartilage differentiation and fat differentiation can be distinguished by measuring the metabolite according to an embodiment of the present invention, and in the case of fatty acid 2, it can be used as a distinguishing marker for distinguishing differentiation types.
  • the conventional magnetic resonance spectroscopic reference material may exhibit the toxicity necessary to quantitative analysis or damage to living cells, so that damage to cells by applying the normalization method using the cell number according to an embodiment of the present invention Can be prevented.
  • Cell differentiation marker for magnetic resonance spectroscopy determined according to an embodiment of the present invention can be applied to other differentiation other than cartilage and adipose differentiation performed in the present invention.
  • the metabolites used as biomarkers for magnetic resonance may vary according to cell types, and the same applies to cells intended for differentiation. That is, since cell differentiation markers for magnetic resonance spectroscopy are found to have more diverse metabolites depending on the type of cells and the differentiated cells, all metabolites showing changes in relation to proliferation / differentiation in magnetic resonance spectroscopy data measured during cell culture. It can be applied as a cell differentiation marker for magnetic resonance spectroscopy according to the present invention.
  • the examples described above as examples and experimental examples of the present invention explained that one of the metabolites obtained from a cell sample inducing differentiation from human mesenchymal stem cells to chondrocytes can be applied as a biomarker.
  • any metabolite selected from Fatty acids, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA can be used as a biomarker, and is a biomarker that determines cartilage differentiation using 1.30ppm fatty acid. It has been described that it can be used as a biomarker to determine fat differentiation using fatty acids.
  • the present invention is not limited thereto, and since there are various metabolites that can be found according to the type of cells and differentiation, more various metabolites can be applied as biomarkers. It can also be applied as a biomarker.
  • a magnetic resonance spectroscopy signal is measured from a cell using a magnetic resonance spectroscopy device, and the magnetic resonance signal is normalized according to the measured concentration of the cell to determine a metabolite that exhibits a change in the spectrum measured during cell differentiation.
  • Implementing the gist to determine the degree of proliferation and differentiation of cells by comparison will all be included in the gist of the present invention.

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Abstract

본 발명은 비침습적인 세포 신호 측정 및 그 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자기공명분광을 이용한 세포의 증식 및 분화 상태를 확인하고, 아울러 세포의 재사용이 가능함으로써 보다 객관적으로 세포 상태를 평가할 수 있으며, 비침습적인 장비인 자기공명분광(Magnetic Resonance Spectroscopy;MRS)을 이용하여 세포 신호를 비침습적으로 측정함으로써 해당 세포의 재사용이 가능한 측정 방법을 제공하여 1회 실험에 드는 비용과 시간을 비약적으로 단축할 수 있는 효과가 있다.

Description

자기공명분광법을 이용한 세포증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법, 이에 이용되는 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커
본 발명은 생명활동을 유지하는 살아있는 세포에 대한 비침습적인 세포 신호의 반복적 측정 및 그 방법에 관한 것이다.
인체의 가장 기본적인 단위인 세포를 외부환경에서 적절한 조건을 맞추어주며 지속적으로 증식시키거나 특정한 성장인자를 첨가하여 특성이 다른 타(他)세포로 분화시키는 일련의 과정들을 통틀어 세포 배양이라고 칭한다. 현대 과학에서 세포 배양 기술은 필수불가결한 분야로 자리 잡고 있으며 특히 의공학 분야에서는 임상전 시험으로 세포 독성 평가를 통하여 약품 허가 여부를 판단하고, 질병의 기전을 밝히는 연구에 적용하는 등 폭 넓게 쓰이고 있다.
세포는 유래된 종(種)이나 조직의 부위에 따라서 모양 및 특성이 다르며 그에 따라 물질대사를 통하여 생성하는 대사체(Metabolite)의 종류도 차이가 있다. 특히 다양한 조직 세포로 분화를 유도하는 것이 가능한 줄기 세포의 경우, 분화될 세포가 무엇인가에 따라 특이적으로 발견되는 대사체들이 존재한다.
일반적으로 세포의 분화 여부를 확인하는 실험은 시약과 반응한 결과물을 관찰하는 것이 대부분인데 염색, PCR(Polymerase Chain Reaction) 등이 모두 이에 속하는 기법이다. 기술된 방법들은 반응 후에 세포를 재사용할 수 없는 침습적인 방법이기 때문에 세포를 이용한 실험에서 반복 실험을 통한 재현성을 검증하기 위해서는 1회 실험당 많은 수의 시편이 요구되며 그에 따른 필요비용도 높아진다. 또한 기존의 실험 방법은 다른 시편에 대한 실험을 적용함으로써 나타나는 오차를 감수하여야 하며 이로 인한 실험 결과의 객관성 및 신뢰성 저하라는 한계점이 존재한다.
자기공명분광(Magnetic Resonance Spectroscopy; 이하 MRS 및 NMR) 및 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging; 이하 MRI) 기법은 생체 신호를 비침습적, 비파괴적으로 측정할 수 있는 기술이며 현재 의학 분야에서 MRI의 높은 연부 조직 대조도와 다양한 조영 파라미터가 있다는 강점으로 인해 진단 기기로써 각광받고 있다. 그러나 MRI 및 MRS는 체적(volume)에 대한 민감도(Sensitivity)가 낮은 수준이기에 일정 크기 이하의 작은 물체에 대한 해상도가 좋지 않다. 이를 극복하기 위해서는 더 높은 자장의 MR 장치가 필요하며, 이마저도 마이크로미터(㎛)의 단위인 세포에는 적용이 어려운 실정이다.
본 발명의 목적은 비침습적인 장비인 자기공명분광(Magnetic Resonance Spectroscopy;MRS)을 이용하여 생명활동을 하는 살아있는 세포 신호를 비침습적으로 측정함으로써 해당 세포의 재사용을 가능하게 하는 측정 방법을 제공하여 1회 실험에 드는 비용과 시간을 비약적으로 단축할 수 있는 세포 상태의 측정방법을 제공하는 데 있다.
아울러, 본 발명의 다른 목적은 자기공명분광에서 나타나는 피크의 정량분석을 통하여 각 세포에 대한 증식 및 분화정보를 확인할 수 있는 바이오마커를 제공하는 데 있다.
또한, 비침습적 장비인 자기공명분광을 이용하여 세포 신호를 비침습적으로 측정함으로써 해당 세포의 재사용을 가능하게 하는 측정 방법을 제공하여 1회 실험에 드는 비용과 시간을 비약적으로 단축할 수 있으며, 동일한 시편에 대한 반복실험을 통하여 연구결과의 객관성 및 재현성을 증가시킬 수 있도록 하는 데 본 발명의 또 다른 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 세포의 종류에 따라 나타나는 대사체의 종류와 그 양이 정해진 것에서 착안하여 자기공명분광에서 나타나는 피크의 정량분석을 통하여 각 세포에 대한 새로운 세포 분화 바이오마커를 제공할 수 있도록 한다. 이를 통해, 비침습적 장비인 자기공명분광을 이용하여 세포 신호를 비침습적으로 측정함으로써 해당 세포의 재사용을 가능하게 하는 측정 방법을 제공하여 1회 실험에 드는 비용과 시간을 비약적으로 단축할 수 있게 된다.
특히, 본 발명은 일정한 농도의 세포 시료에서 획득되는 자기공명분광데이터를 분석하되,상기 세포 시료에서 파생된 대사체의 스펙트럼신호를 측정하여 세포의 증식 및 분화정보를 산출하는 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법을 제공할 수 있도록 한다.
이 경우, 상기 대사체의피크값을 연골분화를 판단하는 바이오마커로 이용할 수 있으며, 이러한 대사체로는 Fatty acids, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA 등이 있고, 이들 중 어느 하나를 선택하여 사용하거나 또는 전체적인 변화 양상을 이용하여 분화를 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에서는 상술한 상기 대사체 중 1.30ppm의 지방산을 이용하여 연골분화를 판단하거나, 지방분화를 판단하는 바이오마커로 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 세포상태측정방법에서는, 상기 세포에서 산출된 자기공명분광신호의 스펙트럼을 세포의 수에 따라 정규화하고, 상기 세포의 수에 따라 정규화된 스펙트럼 데이터에서 측정된 대사체를 분석하여 세포분화측정 바이오마커를 결정함이 바람직하다. 이 경우 대사체의 스펙트럼 분석은, 세포의 분화기간에 발생한 대사체가 나타내는 스펙트럼의 적분값을 정량분석하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 세포상태측정방법에서 상기 자기공명분광의 낮은 민감도를 극복하기 위한3 차원(3 Dimensional; 3D) 배양에서 기틀을 잡아주는 지지체(Scaffold)에 파종되는 세포의 농도는 1×106~1×107/ml의 범위 또는 그 이상의 범위도 포함하여 이용할 수 있으며, 상기 세포 시료는배지와 세포가 혼합된 혼합액:지지체 용액=1:1 의 비율로 혼합하여 고형화한 것을 이용할 수 있다. 이 경우 상기 지지체는, Alginate, fibrin gel, agarose gel, PLGA 등상용화되어 있는 세포 배양 지지체 중 어느 하나를 이용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 자기공명분광에서 나타나는 피크의 정량분석을 통하여 각 세포에 대한 증식 및 분화정보를 확인하는 것이 가능한 바이오마커를 제공할 수 있는 효과가 있다.
특히, 비침습적인 장비인 자기공명분광을 이용하여 세포 신호를 비침습적으로 측정함으로써 해당 세포의 재사용을 가능하게 하는 측정 방법을 제공하여 1회 실험에 드는 비용과 시간을 비약적으로 단축할 수 있는 효과도 있다.
즉, 1회 사용량의 시편만 필요하므로 기존의 방법과 비교하여 시간을 절약할 수 있고, 동일한 시편에 대한 반복 실험을 통하여 연구 결과의 객관성 및 재현성을 증가시킬 수 있으며, 자기공명분광 측정 시에 필수적인 기준물질의 사용 없이 측정할 수 있으며, 세포의 농도로 NMR 스펙트럼을 정량화함으로써 기준물질의 독성에 의한 세포 손실을 제거할 수 있으며, 기준물질 주입 시 생길 수 있는 기준물질 함유량의 오차로 인해 나타나는 실험 결과의 정확도 저하 및 이로 인해 재시험을 해야 하는 문제점 등을 해결할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법과 이에 이용되는 증식/분화마커(바이오마커)의 적용방법을 도시한 순서도이다.
도 2는 세포가 배양된 3D 지지체와 배지가 담긴 시험관(NMR tube)의 모식도이다.
도 3은 자기공명측정용 고주파 코일과 코일 내부에 위치한 3D 지지체에 파종된 세포와 배지를 담은 용기의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시 예에 따라 자기공명분광법을 사용하여 인간의 중간엽 줄기세포 신호를 획득하기 위해 시행한 세포 농도 별 자기공명분광 신호 변화를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따라 분화되지 않은 인간의 중간엽 줄기세포로부터 얻은 자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다.
도 6은 본 발명의 일실시 예에 따라 인간의 중간엽 줄기세포로부터 4일간 연골세포로 분화를 유도하여 얻은자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다.
도 7은 본 발명의 일실시 예에 따라 인간의 중간엽 줄기세포로부터 7일간 연골세포로 분화를 유도하여 얻은자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다.
도 8은 본 발명의 일실시 예에 따라 인간의 중간엽 줄기세포로부터 11일간 연골세포로 분화를 유도하여 얻은자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다
도 9는 본 발명의 일실시 예에 따라 인간의 중간엽 줄기세포로부터 15일간 연골세포로 분화를 유도하여 얻은자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다
도 10은 본 발명의 일 실시 예에 따라 얻은 연골분화 줄기세포의 자기공명 분광 데이터에서 나타난 지방산(fatty acid 1~6)의 스펙트럼 피크 변화를 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시 예에 따라 얻은 연골분화 줄기세포의 자기공명 분광 데이터에서 나타난 지방산 이외의 대사체의 변화를 측정한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시 예에 따라 얻은 지방분화 줄기세포의 자기공명 분광 데이터에서 나타난 지방산의 변화를 측정한 그래프이다.
{도면 부호의 설명}
10: 자기공명분광용 시험관 (NMR tube)
20: 배양 지지체 (Scaffold)
30: 배지
40: 고형재
50: 신호측정용 고주파 코일
60: 용기
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명에 따른 구성 및 작용을 구체적으로 설명한다. 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어 도면 부호에 관계없이 동일한 구성요소는 동일한 참조부여를 부여하고, 이에 대한 중복설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 자기공명분광을 이용한 세포의 증식 및 분화 상태를 확인하고 아울러 세포의 재사용이 가능함으로써 보다 객관적으로 세포 상태를 평가하는 측정 방법에 관한 것이며 자기공명분광 데이터를 통한 세포의 분화에 따른 종류별 바이오마커를 제공하는 것을 요지로 한다.
이를 위해 본 발명은 일정한 농도의 줄기세포 시료로부터 분화가 유도되는 과정에서 특정된 시간에 반복 획득되는 자기공명분광데이터를 분석하되, 상기 세포 시료로부터 대사체의 신호를 측정하여 세포의 증식 및 분화정보를 산출하는, 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법을 제공할 수 있도록 한다. 즉, 세포의 종류에 따라 나타나는 대사체의 종류와 그 양이 정해진 것에서 착안하여 자기공명분광에서 나타나는 피크의 정량분석을 통하여 각 세포에 대한 새로운 세포 분화 바이오마커를 제공할 수 있도록 한다.
도 1은 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법과 이에 이용되는 분화마커(바이오마커)의 적용방법을 도시한 순서도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법은 기본적으로 준비된 세포로부터 자기 공명 분광기기를 이용하여 자기공명분광신호를 측정하고 측정된 세포의 농도에 따라 자기공명 신호를 정규화하며, 세포의 분화과정에서 측정한 스펙트럼 상에서 변화를 나타내는 대사체의 비교를 통해 결정된 분화마커(이하, '바이오마커'라 한다.)를 이용하여 세포의 분화, 증식 상태를 판단할 수 있도록 한다.
즉, 증식, 분화 기간에 따라 획득한 자기공명 분광데이터를 분석할 때 측정된 세포 농도로 각 스펙트럼을 정규화한 후에 대사체 피크의 적분값을 측정하여 결정된 바이오마커는 세포의 증식 및 분화상태를 정량적으로 나타낼 수 있게 된다. 따라서, 다른 상황이나 조건에서 준비된 세포 시료라 할지라도 그 종류가 같고 당시에 측정된 세포의 농도를 알고 있으며 분화하고자 하는 세포의 종류를 알고 있다면 분화하는 과정에서 얻은 대사체의 스펙트럼을 세포의 수로 정규화하여 각각의 적분값을 비교하는 것으로 세포의 증식/분화의 정도, 즉 세포의 상태를 판단 및 비교할 수 있게 된다.
또한, 최초 바이오마커 결정 시험 실험을 거치고 난 후에는 바이오마커를 결정하는 과정을 제외하고 진행하게 되며, 사용하였던 세포에서 다시 자기공명분광 데이터를 측정하여 세포의 상태를 판단 및 비교할 수 있게 된다.
따라서, 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법을 적용할 수 있는 세포의 종류는 제한되지 않으며, 세포의 종류가 다르거나 분화의 종류가 다를 시에는 해당 세포에서 발견되는 대사체의 농도만 특정이 된다면 다양한 대사체를 세포의 증식 및 분화의 정도를 판단하는 바이오마커로 활용할 수 있게 된다.
도 2 및 도 3은 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법에 이용되는 세포 시료 및 측정방법의 원리를 설명한 것이다. 다만, 이하에서 설명하는 측정방법 및 원리는 하나의 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 실시예들에 구체적으로 나타난 세포시료의 종류나 분화의 종류 그리고 자기 분광데이터를 얻기 위해 인가되는 자기장의 강도나 세포의 농도 등은 다양하게 변경하여 적용할 수 있는 것이다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부한 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
도 2는 본 발명의 대상이 되는 시료의 전체적인 모식도로, 기본적으로 본 발명에 사용되는 시료, 즉 세포 시료는 자기공명분광용 시험관(NMR tube;10)내부에 수용되는 3D 배양 지지체(20)에 배양되는 것이며,상기 배양 지지체(20)는 세포가 배양되는 곳이고, 상기 지지체(20)의 주변에 채워진 액체는 세포의 생존에 필요한 영양분을 공급하는 배지(30)이다. 즉, 본 발명에 따른 세포 시료는 배지(30)에서 제공하는 영양분을 세포가 공급받아 생존력을 유지하며, 고형재(40)는 세포 시료가 자기공명코일 중앙에 위치하도록 조정하여 최적의 자기공명 신호를 획득하도록 하기 위해 'agarose gel'과 같은 물질을 시험관의 하부에 채워 넣을 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 상기 지지체(20) 상에 세포를 배양하는 방법에서 자기공명 기기의 낮은 민감도를 극복하기 위하여 입체적인 구조를 가지는 지지체(scaffold)에 세포를 3 차원배양하는 방법을 적용할 수 있으며 세포의 종류에 따라 alginate, fibrin gel 및 고분자 물질(PLGA) 등 적합한 재질의 지지체를 다양하게 선택할 수 있다. 3D 지지체에 세포를 파종(seeding)한 후 배지를 공급해주기 위하여 세포를 파종한 3D 지지체를 배지에 부유하게 하는 방법 및 배지를 보다 잘 스며들게 하기 위하여 회전력이 있는 배양 챔버를 사용하는 방법도 포함될 수 있다.
또한, 세포의 생존을 유지하기 위해서 배지는 3D 지지체가 완전히 잠기도록 충분한 양으로 첨가해주어야 하며 세포의 종류에 따라 다를 수는 있으나 일정한 간격으로 배지 교환을 수행해주어야 하며 배지의 종류 또한 세포가 최적으로 성장할 수 있는 종류를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 일 실시 예로 자기공명분광을 이용하여 살아있는 세포의 신호를 측정하기 위한 일환으로 Alginate bead에서 배양하는 3D 배양 방법을 적용할 수 있다.
또한, 3D 지지체에 단위 용량당 포함되는 세포의 수를 원하는 농도로 조절하여 세포를 파종할 수 있으며, 자기공명 기기의 낮은 민감도를 극복한 일 예로 14.1T의 자장에서 세포의 분광 신호 관찰이 가능하도록 세포의 농도를 2x106/ml 이상이 되도록 하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 측정 방법은 사용되는 자기공명기기의 자장세기에 따라 신호의 크기와 해상도가 달라지므로 기기에 따라 세포의 농도를 다르게 조절하여 최적농도를 적용함이 바람직하다. 본 실험 예에서 사용하는3D 배양 지지체에는 측정 시 사용하는 자기공명기기의 조건(자장의 세기)에 따라 파종되는 세포의 농도를 최적 농도(14.1T에서는 1×106 ~ 2×106/ml)를 적용하여 실험을 실시한 예를 들어 설명하기로 한다.
특히, 비침습적으로 세포의 신호를 획득하기 위하여 3D 지지체와 세포를 분리하는 일련의 과정 없이 일정기간 동안 증식 혹은 분화된 세포와 3D 지지체 및 배지를 모두 포함하여 자기공명 분광을 측정하는 방법을 포함할 수 있다. 도 2 및 도 3에 나타난 용기에는 3D 지지체와 배지, 세포를 모두 함께 배양하며 배양한 용기 그대로 자기공명측정을 수행한다. 일반적으로 사용되는 생화학적 측정 방법의 경우, 3D 지지체와 세포를 분리하는 과정이 필수불가결한데 비하여, 본 발명의 실시예에 따른 자기공명 측정법으로는 시료의 가공처리 없이 모두 한 번에 측정하여 세포의 손실이 없으므로 세포의 재사용이 가능하다.
도 2에 도시된 Alginate 등의 물질로 형성되는 지지체에 배양되는 세포의 농도는 14.1T NMR 장치를 사용하는 경우, 1~2x106/ml의 수준 이상에서 자기공명 분광 스펙트럼에 나타나므로 상기 명시한 농도로 파종하는 것을 포함할 수 있다.
상기 배지(30)는 세포의 종류 및 분화할 세포의 종류에 따라 추천되는 배지를 선택하여 사용하며 일반적으로 3~4일마다 교체해주어야 한다.
배지(30)를 교환하기 위해서는 배지 흡입용 유리관을 사용하며, 펌프를 이용한 흡입 방식으로 기존의 배지를 제거한 후, 새로운 배지를 첨가할 수 있다.
도 2의 배지(30)를 상술한 지지체의 구성물질 중 Alginate bead를 이용하는 경우를 예로 들면, Alginate bead는 배지와 세포 혼합액: alginate 용액 = 1:1의 비율로 먼저 혼합한 후, 염화칼슘에서 고형화 과정을 거쳐서 세포를 지지할 수 있을 때까지 형태를 고정한 후에 염화칼슘을 제거하는 세척 과정을 거친다음, 배양 용기에서 완전히 잠길 만큼 배지를 첨가하여 세포를 배양할 수 있도록 한다.
특히, 이 경우 Alginate 용액에 세포 및 배지가 혼합될 시에 단위용량당 포함되는 세포의 수를 조절하여 실험에 알맞은 농도를 자유롭게 조절하여 파종할 수 있다.
Alginate, 배지, 세포를 함께 균일하게 분포한 상태에서 Alginate bead를 고형화 하므로, 결론적으로 한 개의 baed에 동일한 양의 세포가 파종된다.
이를 통하여 bead 하나에 파종된 세포의 수를 파악하고, 도 2와 같이 자기공명분광 측정 시에 사용된 bead의 개수를 알면 실험에 사용된 전체 세포 수를 파악할 수 있다. 이를 통하여 자기공명분광 측정 시에 사용된 세포 농도가 다르더라도 전체 세포 수를 파악할 수 있다면 각각 개별적으로 획득한 스펙트럼을 같은 세포 농도에 대한 수준으로 정규화함으로서 대사체의 발현 수준을 비교하는 것이 가능하다.
세포의 수를 파악하기 위한 방법으로는 간단한 염색을 통하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 파악할 수 있고, 별도의 3D 지지체와 세포의 분리 과정을 필요로 하지 않는 Hematocytometer를 이용한 세포 카운팅 방법을 한 가지 예로 들 수 있다.
도 2에서의 세포 분화 측정 방법을 수행하기 위한 자기 공명 분광 기기는 도 3에 도시된 구조로 형성하여 적용될 수 있다. 물론, 본 기기의 구성은 예시적인 것으로, 본 발명에 따른 바이오마커가 적용되는 자기공명분광기법은 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시 예에 따른 세포 분화 측정 방법을 수행하기 위하여 자기공명 분광 기기로 측정할 Alginate bead의 양은 도 3과 같이 기기에 따른 고주파 코일(50)에 맞춤으로 형성할 수 있다. 이를 테면, 최적으로 신호가 획득되도록 고주파 코일(50)의 크기에 맞추어 Alginate bead를 측정 용기(60)에 담아 코일 전체에 골고루 분포되도록 한다.
MR 신호 측정용 고주파 코일(50)은 다양한 형태의 것을 이용할 수 있으며, 이를테면 Solenoid, Surface, Quardrature 형태 등 다양한 형태가 될 수 있다.
도 3에서의 용기(60)는 Alginate와 배지를 담는 것이며 코일의 형태에 따라 다양한 용기를 사용할 수 있다. 또한, 세포가 파종된 Alginate bead, 즉 배양지지체(30)는 최적으로 MR 신호를 획득하기 위하여 코일 전체 부분에 분포되도록 용기(60)에 담아 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에 따른 세포 분화 측정 방법은 자기공명분광 기기 및 자기공명영상 기기와 같이 비침습적이고 비파괴적으로 스펙트럼 데이터를 획득할 수 있는 일련의 자기공명기기에 대해 적용될 수 있다. 또한, 자기공명영상 기기에 이용할 수 있도록 자기공명분광용 시험관이 아닌 다른 형태의 용이한 용기를 사용하여 신호를 측정할 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따른, 자기공명 분광 측정 방법은 비침습적인 방법이므로 측정을 완료한 시편을 용기와 함께 원하는 기간 동안 재배양한 후 같은 시편에 대하여 재측정할 수 있는 장점이 구현되게 된다.
아울러, 본 발명에 따른 세포 분화상태의 측정에 이용되는 자기공명분광 측정법으로 세포의 분화 및 증식을 구별하기 위해서 측정 결과인 스펙트럼에서 나타나는 대사체 피크의 종류와 크기를 확인하는 방법을 이용하게 된다.
특히, 분화에 따라 변화하는 것이 확인된 기준 대사체를 세포의 분화를 관찰하는 바이오마커로 사용할 수 있게 된다.
구체적으로는, 자기공명분광 스펙트럼 상에서 동일한 물질은 항상 같은 위치(ppm)에서 나타나고, 포함된 양이 피크의 크기에 반영되는 사실에 기반을 두어 세포의 증식/분화 기간 동안 변화를 보인 대사체를 증식/분화 마커(바이오마커)로 결정하고, 변화를 보이지 않는 대사체를 3D 지지체의 신호로 결정하게 된다.
이 경우 자기공명 분광으로 세포의 증식 및 분화 기간 동안 대사체의 변화를 관찰하기 위한 방법으로 스펙트럼 상에서 나타난 피크에 적분값을 계산하여 비교하여 판단할 수 있다.
또한, 자기공명 분광의 정량적 분석을 위해서 다음과 같은 데이터의 정규화 방법을 적용한다.
우선, 농도 0 ppm에서 나타나는 기준물질을 동일한 양으로 포함하여 데이터를 획득한 후, 각각의 스펙트럼에서 기준물질을 동일한 크기로 맞춤으로서 스펙트럼을 정규화하는 방법을 이용할 수 있다.
다만, 본 발명에서는 기준물질이 동일한 양으로 포함되지 않거나 세포에 악영향을 줄 수 있는 기준물질을 사용하는 경우를 배제하기 위하여 앞서 명시한 방법과 같이 스펙트럼 간의 신호를 같은 수준에서 비교할 수 있도록 측정한 세포의 수를 확인하여 같은 세포 농도에서 비교할 수 있도록 같은 시료에서 측정된 세포 수를 이용하여 각 스펙트럼을 정규화하는 방법을 이용하는 것이 바람직하다.
이렇게 세포 수를 이용하여 정규화하는 방법은 측정한 각 시편에 대하여 세포 수를 측정하므로 세포 파종 시에 손실이 생겨 당초에 결정된 양으로 파종되지 않을 경우에도 정량 분석을 위한 정규화를 수행할 수 있는 장점이 구현되게 된다.
이외에도, 자기공명분광의 정량적 분석 결과와 세포 증식/분화의 관계를 비교확인하기 위해 세포 수를 파악하기 위한 방법으로는 Hematocytometer를 사용한 세포 카운팅 및 DNA assay 등 일반적으로 쓰이는 세포 카운팅 방법을 이용할 수 있다.
일 회 실험 시에 각 배지(alginate bead)에 파종되는 세포의 농도는 동일하므로 세포 카운팅은 한 개의 배지(Alginate bead)에만 수행하여도 실험에 사용된 전체 세포 수를 파악할 수 있다.
본 발명에 따른 세포 시료의 증식/분화 상태의 파악은세포의 증식/분화 기간에 따라 자기공명 분광 데이터를 획득하고 비교하여 결정된 대사체의 변화를 통해 할 수 있다. 여기에서 사용된 대사체는세포의 증식/분화 상태를 나타낼 수 있는 바이오마커가 될 수 있다. 이러한 대사체를이용한 바이오마커는 측정된 세포의 농도를 알고 있는 경우라면 다양한 세포에 적용되어 대사체의 적분 값과 상기 바이오마커의비교로 증식/분화의 정도를 파악할 수 있다.
또한 대사체는 세포의 종류에 따라 다르게 나타나므로 세포의 종류 파악이 가능하며 세포 분화 과정에서 목적으로 하는 세포로의 분화 여부도 파악할 수 있다.
이하에서는 세포에 대한 다양한 측정 데이터 결과를 통해 상술한 본 발명의 요지를 구체적으로 설명하기로 한다.
도 4는 3D 배양된 세포에 대한 낮은 MR 민감도(sensitivity)를 확인하기 위하여 인간의 중간엽 줄기 세포의 농도를 달리하며 파종한 후 획득한 분광 데이터(스펙트럼)이며, 도 4의 데이터에 따라 세포의 자기공명 신호 획득이 가능한 최적의 세포 농도는 결정될 수 있다.
파종되는 세포의 농도를 다르게 하기 위해서는 상기 명시한 대로 단위 용량당 포함되는 세포의 수를 다르게 함으로써 실현할 수 있으며 그 농도는 1x106 ~ 1x107/ml 또는 그 이상까지 광범위하다.
또한 같은 양의 3D 지지체에 세포의 농도만 달리하여 파종한 후 세포의 수에 따른 대사체 변화를 측정,분석함으로서 자기공명분광용 세포 증식 측정 기준이 결정될 수 있다.
도 4에 의하면 14.1T의 자기공명기기를 사용한 경우, 5x105/ml 이하에서는 세포 배지 및 alginate로부터 파생된 신호만이 관찰되고 세포의 신호는 검출되지 않다가 2x106/ml 이상의 농도에서는 3.22ppm과 2.35ppm에서 육안으로 관찰할 수 있을 만큼 신호의 세기가 커진 것을 관찰할 수 있다. 또한, 2x106/ml 이상에서는 꾸준한 증가를 보이므로 각 피크에 대하여 적분 값을 계산하고 변화량을 비교함으로서 세포의 증식 및 분화를 평가할 수 있는 마커로 사용될 수 있다. 특히, 3.22ppm의 피크인 Phosphocholine과 같은 경우 배지 및 Alginate 신호와 겹치지 않는 대사체 신호이므로 증식 및 분화 마커로서 활용이 가능하게 된다.
도 5 내지 도 9는 본 발명에 따라 상술한 3D 배양 방법을 적용하여 연골 분화 기간에 세포 신호를 측정한 분광 데이터(스펙트럼)이다.
도 5는 hMSCs(human mesenchymal stem cells)에 대한 세포배양방법을 적용한 첫 번째 스펙트럼이며, 도 6은 hMSCs에 대한 연골분화 4일째의 스펙트럼, 도 7은 hMSCs에 대한 연골분화 7일째의 스펙트럼, 도 8은 hMSCs에 대한 연골분화 11일째의 스펙트럼, 도 9는 hMSCs에 대한 연골분화 15일째의 스펙트럼을 도시한 것이다.
이러한 연골 분화 기간에 세포 신호를 측정한 분광 데이터(스펙트럼)에서, 각각의 대사체의 적분 값을 정량 분석함으로써 자기공명분광용 세포 분화 측정 바이오마커는 결정될 수 있게 된다.
즉, 자기공명 분광법에서 대사체의 종류가 같으면 항상 같은 위치(ppm)에서 분광 피크가 나타나고, 대사체의 양이 스펙트럼 상의 피크의 적분 값에 반영되는 것에 기반을 두어 본 발명의 자기공명분광용 바이오 마커는 세포의 종류와 분화 정도에 따라 고유한 값을 가질 수 있다.
대사체의 종류에 따른 정량분석을 위하여 획득된 분광 데이터(스펙트럼)는 정규화 과정을 거쳐야 함은 상술한 바 있다. 이러한 정규화 방법으로 0ppm에서 나타나는 기준물질을 동일한 양으로 첨가하고 이를 기준으로 나머지 피크를 정규화하는 방법을 적용할 수 있다.
한편, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 정규화 방법은 기준물질의 첨가 없이 세포의 수를 파악하여 세포 수에 따라 스펙트럼을 정규화하는 방법을 사용할 수 있다. 명시한 정규화 방법을 사용하면 동일하지 않은 양의 기준물질이 들어갔을 경우에도 정규화가 가능하며, 세포에 손상을 줄 수 있는 기준물질을 포함하지 않음으로써 세포 손실을 방지할 수 있다. 이러한 세포의 수를 통하여 정규화하는 방법은 서로 다른 농도(서로 다른 실험 조건)로 파종된 세포라도 사용된 세포의 종류와 분화를 목적으로 하는 세포의 종류가 같다면 증식/분화 상태를 파악하는 것이 가능한 장점을 갖는다.
본 발명에 따르면 상기 기술한 방법을 적용하여 세포의 농도로 정량화하는 방법을 통하여 도 5 내지 도 9에 나타난 스펙트럼 상에서 대사체 변화의 정량적 비교를 통하여 비침습적으로 세포 분화를 판단할 수 있는 분화마커를 결정할 수 있다. 한편, 세포 신호를 분석하기 위해서는 상대적으로 매우 크게 관찰되는 물(H2O) 신호를 제거할 필요성이 있으며 이는 물 신호 억제 기능이 있는 MR Pulse sequence를 사용함으로써 해결한다.
도 10과 도 11은 도 5 내지 도 9에 나타낸 연골 분화 기간에 획득한 분광 데이터(스펙트럼)에서 변화를 보인 대사체 변화량(피크의 적분 값)을 그래프로 나타낸 그림이며 각 대사체들의 변화 양상을 파악함으로써 분화 정도를 관찰할 수 있다.
도 10에 의하면 분화 기간에 따라 단계적으로 지방산의 변화량이 관찰되었으며, 1.30ppm의 지방산(지방산 2)과 같은 경우 다른 대사체에 비하여 큰 폭으로 변화하였다. 이를 통하여 같은 농도로 파종된 시편의 자기공명분광 측정을 통해 분화한 기간에 따른 1.30ppm의 지방산을 관찰하여 연골 분화의 정도를 파악할 수 있다.
또한 도 11에 의하면 연골 분화 직후에는 양이 감소하였다가 이후에 일정하게 유지되는 대사체를 발견할 수 있다(Alanine, Leucine). 이러한 대사체들은 연골 분화를 판가름하는 분화마커로 사용될 수 있다. 한편, 도 11에 나타난 phosphocholine도 연골 분화 기간 동안 단계적으로 증가하는 것이 관찰되었으므로 분화 유도 기간에 따른 연골 분화 상태를 나타낼 수 있는 분화마커로 사용될 수 있다. 따라서, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA 등의 대사체는, 대사체의피크값을 연골분화를 판단하는 바이오마커로 이용할 수 있게 된다.
도 12는 또 다른 본 발명의 일 실시 예로 인간의 중간엽 줄기 세포로부터 지방으로 분화되는 기간에 변화된 스펙트럼에서 변화를 보인 지방대사체 스펙트럼의 피크 적분 값의 변화량을 나타낸 그림으로 각 대사체들의 변화 양상을 파악함으로써 분화 정도를 관찰할 수 있다.
도 12에 따르면 대부분의 지방산이 증가한 것을 관찰할 수 있으며 특히 지방산 b에서 가장 큰 변화를 보였는데 이는 도 10에 나타난 지방산 2(Fatty acid 2)와 같은 성분인 1.30ppm의 지방산이다.
도 10에서 지방산 2는 약 2 배가량의 변화를 보인데 비하여 도 12의 지방산 b는 도 10와 같은 분화 기간에서 약 16배가량의 증가를 보였으므로 연골 분화에 비하여 지방 분화에서 지방산이 더 크게 증가한다는 것을 파악할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 실시 예에 따른 대사물질 측정으로 연골 분화와 지방 분화를 구분할 수 있으며 지방산 2의 경우 분화 종류를 구분하는 구분 마커로 활용될 수 있다.
상기 기술한 도 5와 도 12를 비교함에 있어서 자기공명분광용 기준물질을 토대로 정량화하지 않고 세포의 농도로 정량화하는 방법을 적용할 수 있다.
즉, 세포의 수를 통하여 정규화 과정을 거친 후에 정량 분석되었으므로 분화 기간이 같을 경우에 세포의 수 및 세포의 증가량이 다르더라도 정량적인 비교가 가능하다.
또한 기존의 자기공명분광용 기준물질은 정량적 분석에 필수적인 요소이나 살아있는 세포에 타격을 줄 수 있는 독성을 나타낼 수 있으므로 본 발명의 일 실시 예에 따른 세포 수를 이용한 정규화 방법을 적용하여 세포에 대한 손상을 방지할 수 있다.
본 발명의 일실시 예에 따라 결정된 자기공명분광용 세포 분화마커는 본 발명에서 실시한 연골, 지방 분화가 아닌 여타 다른 분화에 대해서도 적용이 가능하다.
또한 다른 분화 과정에서 발견된 여타 대사체도 분화마커로 활용될 수 있다.
또한 세포의 종류에 따라 자기공명용 바이오마커로 사용되는 대사체는 달라질 수 있으며, 이는 분화를 목적으로 하는 세포에 대해서도 동일하게 적용된다. 즉, 자기공명분광용 세포분화마커는 세포의 종류 및 분화되는 세포의 종류에 따라 더욱 다양한 대사체가 발견되므로, 세포 배양 중 측정한 자기공명분광 데이터에서 증식/분화와 연관되어 변화를 보이는 모든 대사체는 본 발명에 따른 자기공명분광용 세포분화마커로 적용될 수 있다.
즉, 본 발명의 실시예 및 실험예로 상술한 예는 인간의중간엽 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 유도한 세포 시료로부터 획득된 대사체 중 하나를 바이오마커로 적용할 수 있음을 설명하였다. 이를테면, Fatty acids, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA 중 선택되는 어느 하나의 대사체를바이오마커로 이용할 수 있음을 서술하였으며 1.30ppm의 지방산을 이용하여 연골분화를 판단하는 바이오마커로, 1.30ppm의 지방산을 이용하여 지방분화를 판단하는 바이오마커로 이용될 수 있음을 설명하였다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 세포의 종류 및 분화의 종류에 따라 발견될 수 있는 다양한 대사체가 존재하므로 더욱 다양한 대사체가 바이오마커로 적용될 수 있으며, 하나의 대사체가 아닌 여려 대사체의 변화 양상의 조합 자체 또한 바이오마커로 적용될 수 있다.
이에 따라 본 발명에서는 세포로부터 자기 공명 분광기기를 이용하여 자기공명분광 신호를 측정하고, 측정된 세포의 농도에 따라 자기공명 신호를 정규화하여, 세포의 분화과정에서 측정한 스펙트럼 상에서 변화를 나타내는 대사체의 비교를 통해 세포의 증식 및 분화의 정도를 판단하는 요지를 구현하는 것은 모두 본 발명의 요지에 포함된다 할 것이다.
또한 본 발명에 따르면 세포의 손실 없이 같은 시편으로 지속적인 실험이 가능하고, 별도의 염색 및 화학적 반응 과정 없이 자기공명분광 데이터를 획득하는 것으로 세포 상태의 판별이 가능하므로 실험의 재현성을 향상시키며, 실험 과정의 간소화, 실험 비용의 절감을 유도할 수 있다.
전술한 바와 같은 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시예에 관해 설명하였다. 그러나 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 변형이 가능하다. 본 발명의 기술적 사상은 본 발명의 기술한 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims (9)

  1. 세포로부터 자기 공명 분광기기를 이용하여 자기공명분광 신호를 배양 기간 동안 특정 주기에 따라 반복 측정하는 1단계;
    측정된 세포의 농도에 따라 자기공명 신호를 정규화하는 2단계;
    상기 세포의 분화과정에서 측정한 스펙트럼 상에서 변화를 나타내는 대사체의 비교를 통해 세포의 증식 및 분화의 정도를 판단하는 바이오마커를 결정하는 3단계;
    를 포함하는 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 2단계 및 3단계는,
    상기 세포의 분화 과정에서 얻은 대사체의 스펙트럼을 세포의 수로 정규화하며,
    정규화한 대사체 피크의 적분값을 비교하여 세포의 증식 및 분화의 정도를 판단하는 바이오마커로 결정하는 단계인 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 세포는,
    지지체(scaffold)에 세포를 3D 배양하는 방법을 적용하는 것을 특징으로 하는 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 3단계의 상기 바이오마커는,
    인간의 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 유도한 세포 시료로부터 획득된 대사체 중의 하나 또는 둘 이상의 대사체, 또는 대사체들의 변화양상의 조합자체를 바이오마커로 이용하는,
    자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 3단계의 상기 바이오마커는,
    Fatty acids, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA 중 선택되는 대사체 중의 하나 또는 이들 대사체들의 변화양상의 조합자체를 바이오마커로 이용하는,
    자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 3단계는,
    1.30ppm의 지방산을 이용하여 연골분화를 판단하는 바이오마커로 이용하는 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 3단계는,
    1.30ppm의 지방산을 이용하여 지방분화를 판단하는 바이오마커로 이용하는 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
  8. 세포시료에서 얻어지는 자기공명분광데이터를 분석하여 세포의 증식 및 분화 정보를 확인하는 청구항 1의 측정방법에 이용되는 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커는,
    세포 배양 중 측정한 자기공명분광 데이터에서 증식 및 분화와 연관되어 변화를 보이는 다수의 대사체 중 어느 하나 또는 이들 조합을 증식 및 분화 정도를 판단기준으로 하는 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커.
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