KR101333665B1 - 자기공명분광법을 이용한 세포증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법, 이에 이용되는 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비침습적인 세포 신호 측정 및 그 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자기공명분광을 이용한 세포의 증식 및 분화 상태를 확인하고, 아울러 세포의 재사용이 가능함으로써 보다 객관적으로 세포 상태를 평가하는 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 자기공명분광에서 나타나는 피크의 정량분석을 통하여 각 세포에 대한 증식 및 분화정보를 확인할 수 있는 바이오마커를 제공할 수 있으며, 비침습적인 장비인 자기공명분광(Magnetic Resonance Spectroscopy;MRS)을 이용하여 세포 신호를 비침습적으로 측정함으로써 해당 세포의 재사용이 가능한 측정 방법을 제공하여 1회 실험에 드는 비용과 시간을 비약적으로 단축할 수 있는 효과가 있다.

Description

자기공명분광법을 이용한 세포증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법, 이에 이용되는 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커{Non-invasive marker of cell proliferation/differentiation in cells using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy}

본 발명은 비침습적인 세포 신호 측정 및 그 방법에 관한 것이다.

인체의 가장 기본적인 단위인 세포를 외부환경에서 적절한 조건을 맞추어주며 지속적으로 증식시키거나 특정한 성장인자를 첨가하여 특성이 다른 타(他)세포로 분화시키는 일련의 과정들을 통틀어 세포 배양이라고 칭한다. 현대 과학에서 세포 배양 기술은 필수불가결한 분야로 자리 잡고 있으며 특히 의공학 분야에서는 임상전 시험으로 세포 독성 평가를 통하여 약품 허가 여부를 판단하고, 질병의 기전을 밝히는 연구에 적용하는 등 폭 넓게 쓰이고 있다.

세포는 유래된 종(種)이나 조직의 부위에 따라서 모양 및 특성이 다르며 그에 따라 물질대사를 통하여 생성하는 대사체(Metabolite)의 종류도 차이가 있다. 특히 다양한 조직 세포로 분화를 유도하는 것이 가능한 줄기 세포의 경우, 분화될 세포가 무엇인가에 따라 특이적으로 발견되는 대사체들이 존재한다.

일반적으로 세포의 분화 여부를 확인하는 실험은 시약과 반응한 결과물을 관찰하는 것이 대부분인데 염색, PCR(Polymerase Chain Reaction) 등이 모두 이에 속하는 기법이다. 기술된 방법들은 반응 후에 세포를 재사용할 수 없는 침습적인 방법이기 때문에 세포를 이용한 실험에서 반복 실험을 통한 재현성을 검증하기 위해서는 1회 실험당 많은 수의 시편이 요구되며 그에 따른 필요비용도 높아진다. 또한 기존의 실험 방법은 다른 시편에 대한 실험을 적용함으로써 나타나는 오차를 감수하여야하며 이로 인한 실험 결과의 객관성 및 신뢰성 저하라는 한계점이 존재한다.

자기공명분광(Magnetic Resonance Spectroscopy; 이하 MRS 및 NMR) 및 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging; 이하 MRI) 기법은 생체 신호를 비침습적, 비파괴적으로 측정할 수 있는 기술이며 현재 의학 분야에서 MRI의 높은 연부 조직 대조도와 다양한 조영 파라미터가 있다는 강점으로 인해 진단 기기로써 각광받고 있다. 그러나 MRI 및 MRS는 체적(volume)에 대한 민감도(Sensitivity)가 낮은 수준이기에 일정 크기 이하의 작은 물체에 대한 해상도가 좋지 않다. 이를 극복하기 위해서는 더 높은 자장의 MR 장치가 필요하며, 이마저도 마이크로미터(㎛)의 단위인 세포에는 적용이 어려운 실정이다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 자기공명분광에서 나타나는 피크의 정량분석을 통하여 각 세포에 대한 증식 및 분화정보를 확인할 수 있는 바이오마커를 제공하는 데 있다.

또한, 비침습적인 장비인 자기공명분광(Magnetic Resonance Spectroscopy;MRS)을 이용하여 세포 신호를 비침습적으로 측정함으로써 해당 세포의 재사용을 가능하게 하는 측정 방법을 제공하여 1회 실험에 드는 비용과 시간을 비약적으로 단축할 수 있는 세포 상태의 측정방법을 제공하는 데 본 발명의 또 다른 목적이 있다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 세포의 종류에 따라 나타나는 대사체의 종류와 그 양이 정해진 것에서 착안하여 자기공명분광에서 나타나는 피크의 정량분석을 통하여 각 세포에 대한 새로운 세포 분화 바이오마커를 제공할 수 있도록 한다. 이를 통해, 비침습적 장비인 자기공명분광을 이용하여 세포 신호를 비침습적으로 측정함으로써 해당 세포의 재사용을 가능하게 하는 측정 방법을 제공하여 1회 실험에 드는 비용과 시간을 비약적으로 단축할 수 있게 된다.

특히, 본 발명은 일정한 농도의 세포 시료에서 획득되는 자기공명분광데이터를 분석하되,상기 세포 시료에서 파생된 대사체의 스펙트럼신호를 측정하여 세포의 증식 및 분화정보를 산출하는 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법을 제공할 수 있도록 한다.

이 경우, 상기 대사체의피크값을 연골분화를 판단하는 바이오마커로 이용할 수 있으며, 이러한 대사체로는Fatty acids, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA 중 선택되는 어느 하나가 이용될 수 있다.

또한, 상술한 상기 대사체는 1.30ppm의 지방산을 이용하여 연골분화를 판단하거나, 지방분화를 판단하는 바이오마커로 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 세포상태측정방법에서는, 상기 세포분화배지에서 산출된 자기분광신호의 스펙트럼을 세포의 수에 따라 정규화하고, 상기 세포의 수에 따라 정규화된 세포분화배지에서의 대사체의 양이 반영되는 스펙트럼을 분석하여 세포분화측정 바이오마커를 결정함이 바람직하다. 이 경우 대사체의 스펙트럼의 분석은, 세포분화배지의 분화기간에 발생한 대사체가 나타내는 스펙트럼의 적분값을 정량분석하여 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 세포상태측정방법에서 상기 자기공명분광의 낮은 민감도를 극복하기 위한3 차원(3 Dimensional; 3D) 배양에서 기틀을 잡아주는 지지체(Scaffold)에 파종되는 세포의 농도는 1×10⁶~1×10⁷/ml의 범위 또는 그 이상의 범위도 포함하여 이용할 수 있으며, 상기 세포 시료는배지와 세포가 혼합된 혼합액:지지체 용액=1:1 의 비율로 혼합하여 고형화한 것을 이용할 수 있다. 이 경우 상기 지지체는, Alginate, fibrin gel, agarose gel, PLGA 등상용화되어 있는 세포 배양 지지체 중 어느 하나를 이용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 자기공명분광에서 나타나는 피크의 정량분석을 통하여 각 세포에 대한 증식 및 분화정보를 확인하는 것이 가능한바이오마커를 제공할 수 있는 효과가 있다.

특히, 비침습적인 장비인 자기공명분광(Magnetic Resonance Spectroscopy;MRS)을 이용하여 세포 신호를 비침습적으로 측정함으로써 해당 세포의 재사용을 가능하게 하는 측정 방법을 제공하여 1회 실험에 드는 비용과 시간을 비약적으로 단축할 수 있는 효과도 있다. 즉, 1회 사용량의 시편만 필요하므로 기존의 방법과 비교하여 시간을 절약할 수 있고, 동일한 시편에 대한 반복 실험을 통하여 연구 결과의 객관성 및 재현성을 증가시킬 수 있으며, 자기공명분광 측정 시에 필수적인 기준물질의 사용 없이 측정할 수 있으며, 세포의 농도로 NMR 스펙트럼을 정량화함으로써 기준물질의 독성에 의한 세포 손실을 제거할 수 있으며, 기준물질 주입 시 생길 수 있는 기준물질 함유량의 오차로 인해 나타나는 실험 결과의 정확도 저하 및 이로 인해 재시험을 해야 하는 문제점 등을 해결할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법과 이에 이용되는 증식/분화마커(바이오마커)의 적용방법을 도시한 순서도이다.
도 2a는 세포가 배양된 3D 지지체와 배지가 담긴 시험관(NMR tube)의 모식도이다.
도 2b는 자기공명측정용 고주파 코일과 코일 내부에 위치한 3D 지지체에 파종된 세포와 배지를 담은 용기의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시 예에 따라 자기공명분광법을 사용하여 인간의 중간엽 줄기세포 신호를 획득하기 위해 시행한 세포 농도 별 자기공명분광 신호 변화를 나타낸다.
도 4a는 본 발명의 일 실시 예에 따라 분화되지 않은 인간의 중간엽 줄기세포로부터 얻은 자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다.
도 4b는 본 발명의 일실시 예에 따라 인간의 중간엽 줄기세포로부터 4일간 연골세포로 분화를 유도하여 얻은자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다.
도 4c 는 본 발명의 일실시 예에 따라 인간의 중간엽 줄기세포로부터 7일간 연골세포로 분화를 유도하여 얻은자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다.
도 4d는 본 발명의 일실시 예에 따라 인간의 중간엽 줄기세포로부터 11일간 연골세포로 분화를 유도하여 얻은자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다
도 4e는 본 발명의 일실시 예에 따라 인간의 중간엽 줄기세포로부터 15일간 연골세포로 분화를 유도하여 얻은자기공명 분광 데이터(스펙트럼)이다
도 5a는 본 발명의 일 실시 예에 따라 얻은 연골분화 줄기세포의 자기공명 분광 데이터에서 나타난 지방산(fatty acid 1~6)의 스펙트럼 피크 변화를 측정한 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시 예에 따라 얻은 연골분화 줄기세포의 자기공명 분광 데이터에서 나타난 지방산 이외의 대사체의 변화를 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시 예에 따라 얻은 지방분화 줄기세포의 자기공명 분광 데이터에서 나타난 지방산의 변화를 측정한 그래프이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명에 따른 구성 및 작용을 구체적으로 설명한다. 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어 도면 부호에 관계없이 동일한 구성요소는 동일한 참조부여를 부여하고, 이에 대한 중복설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 자기공명분광을 이용한 세포의 증식 및 분화 상태를 확인하고 아울러 세포의 재사용이 가능함으로써 보다 객관적으로 세포 상태를 평가하는 측정 방법에 관한 것이며 자기공명분광 데이터를 통한 세포의 분화에 따른 종류별 바이오마커를 제공하는 것을 요지로 한다.

이를 위해 본 발명은 일정한 농도의 세포시료(분화를 유도한 줄기세포)에서 획득되는 자기공명분광데이터를 분석하되, 상기 세포 시료로부터 대사체의 신호를 측정하여 세포의 증식 및 분화정보를 산출하는, 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법을 제공할 수 있도록 한다. 즉, 세포의 종류에 따라 나타나는 대사체의 종류와 그 양이 정해진 것에서 착안하여 자기공명분광에서 나타나는 피크의 정량분석을 통하여 각 세포에 대한 새로운 세포 분화 바이오마커를 제공할 수 있도록 한다.

도 1은 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법과 이에 이용되는 분화마커(바이오마커)의 적용방법을 도시한 순서도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포상태 측정방법은 기본적으로 준비된 세포로부터 자기 공명 분광기기를 이용하여 자기공명분광신호를 측정하고 측정된 세포의 농도에 따라 자기공명 신호를 정규화하며, 세포의 분화과정에서 측정한 스펙트럼 상에서 변화를 나타내는 대사체의 비교를 통해 결정된 분화마커(이하, '바이오마커'라 한다.)를 이용하여 세포의 분화, 증식 상태를 판단할 수 있도록 한다.

즉, 증식, 분화 기간에 따라 획득한 자기공명 분광데이터를 분석할 때 측정된 세포 농도로 각 스펙트럼을 정규화한 후에 대사체 피크의 적분값을 측정하여 결정된 바이오마커는 세포의 증식 및 분화상태 정량적으로 나타낼 수 있게 된다. 따라서, 다른 상황이나 조건에서 준비된 세포 시료라 할지라도 그 종류가 같고 당시에 측정된 세포의 농도를 알고 있으며 분화하고자 하는 세포의 종류를 알고 있다면 분화하는 과정에서 얻은 대사체의 스펙트럼을 세포의 수로 정규화하여 각각의 적분값을 비교하는 것으로 세포의 증식/분화의 정도, 즉 세포의 상태를 판단 및 비교할 수 있게 된다.

따라서, 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법을 적용할 수 있는 세포의 종류는 제한되지 않으며, 세포의 종류가 다르거나 분화의 종류가 다를 시에는 해당 세포에서 발견되는 대사체의 농도만 특정이 된다면 다양한 대사체를 세포의 증식 및 분화의 정도를 판단하는 바이오마커로 활용할 수 있게 된다.

도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법에 이용되는 세포 시료 및 측정방법의 원리를 설명한 것이다. 다만, 이하에서 설명하는 측정방법 및 원리는 하나의 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 실시예들에 구체적으로 나타난 세포시료의 종류나 분화의 종류 그리고 자기 분광데이터를 얻기 위해 인가되는 자기장의 강도나 세포의 농도 등은 다양하게 변경하여 적용할 수 있는 것이다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부한 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 2a는 본 발명의 대상이 되는 시료의 전체적인 개념도로, 도 1은 본 발명의 대상이 되는 시료의 전체적인 모식도로, 기본적으로 본 발명에 사용되는 시료, 즉 세포 시료는 자기공명분광용 시험관(NMR tube;10)내부에 수용되는 3D 배양 지지체(20)에 배양되는 것이며,상기 배양 지지체(20)는 세포가 배양되는 곳이고, 상기 지지체(20)의 주변에 채워진 액체는 세포의 생존에 필요한 영양분을 공급하는 배지(30)이다. 즉, 본 발명에 따른 세포 시료는 배지(30)에서 제공하는 영양분을 세포가 공급받아 생존력을 유지하며, 고형재(40)는 세포 시료가 자기공명코일 중앙에 위치하도록 조정하여 최적의 자기공명 신호를 획득하도록 하기 위해 'agarose gel'과 같은 물질을 시험관의 하부에 채워 넣을 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 상기 지지체(20) 상에 세포를 배양하는 방법에서 자기공명 기기의 낮은 민감도를 극복하기 위하여 입체적인 구조를 가지는 지지체(scaffold)에 세포를 3 차원배양하는 방법을 적용할 수 있으며 세포의 종류에 따라 alginate, fibrin gel 및 고분자 물질(PLGA) 등 적합한 재질의 지지체를 다양하게 선택할 수 있다. 3D 지지체에 세포를 파종(seeding)한 후 배지를 공급해주기 위하여 세포를 파종한 3D 지지체를 배지에 부유하게 하는 방법 및 배지를 보다 잘 스며들게 하기 위하여 회전력이 있는 배양 챔버를 사용하는 방법도 포함될 수 있다.

또한, 세포의 생존을 유지하기 위해서 배지는 3D 지지체가 완전히 잠기도록 충분한 양으로 첨가해주어야 하며 세포의 종류에 따라 다를 수는 있으나 일정한 간격으로 배지 교환을 수행해주어야 하며 배지의 종류 또한 세포가 최적으로 성장할 수 있는 종류를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 일 실시 예로 자기공명분광을 이용하여 살아있는 세포의 신호를 측정하기 위한 일환으로 Alginate bead에서 배양하는 3D 배양 방법을 적용할 수 있다.

또한, 3D 지지체에 단위 용량당 포함되는 세포의 수를 원하는 농도로 조절하여 세포를 파종할 수 있으며, 자기공명 기기의 낮은 민감도를 극복한 일 예로 14.1T의 자장에서 세포의 분광 신호 관찰이 가능하도록 세포의 농도를 2x10⁶/ml 이상이 되도록 하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 측정 방법은 사용되는 자기공명기기의 자장세기에 따라 신호의 크기와 해상도가 달라지므로 기기에 따라 세포의 농도를 다르게 조절하여 최적농도를 적용함이 바람직하다. 본 실험 예에서 사용하는3D 배양 지지체에는 측정 시 사용하는 자기공명기기의 조건(자장의 세기)에 따라 파종되는 세포의 농도를 최적 농도(14.1T에서는 1×10⁶~2×10⁶/ml) 를 적용하여 실험을 실시한 예를 들어 설명하기로 한다.

특히, 비침습적으로 세포의 신호를 획득하기 위하여 3D 지지체와 세포를 분리하는 일련의 과정 없이 일정기간 동안 증식 혹은 분화된 세포와 3D 지지체 및 배지를 모두 포함하여 자기공명 분광을 측정하는 방법을 포함할 수 있다. 도 1에 나타난 용기에는 3D 지지체와 배지, 세포를 모두 함께 배양하며 배양한 용기 그대로 자기공명측정을 수행한다. 일반적으로 사용되는 생화학적 측정 방법의 경우, 3D 지지체와 세포를 분리하는 과정이 필수불가결한데 비하여 자기공명 측정법으로는 모두 한 번에 측정하여 세포의 손실이 없으므로 세포의 재사용이 가능하다.

도 2에 도시된 Alginate 등의 물질로 형성되는 지지체에 배양되는 세포의 농도는 14.1T NMR 장치를 사용하는 경우, 1~2x10⁶/ml의 수준 이상에서 자기공명 분광 스펙트럼에 나타나므로 상기 명시한 농도로 파종하는 것을 포함할 수 있다.

상기 배지(30)는 세포의 종류 및 분화할 세포의 종류에 따라 추천되는 배지를 선택하여 사용하며 일반적으로 3~4일마다 교체해주어야 한다.

배지(30)를 교환하기 위해서는 배지 흡입용 유리관을 사용하며, 펌프를 이용한 흡입 방식으로 기존의 배지를 제거한 후, 새로운 배지를 첨가할 수 있다.

도 2a의 배지(30)를 상술한 지지체의 구성물질 중 Alginate bead를 이용하는 경우를 예로 들면, Alginate bead는 배지와 세포 혼합액: alginate 용액 = 1:1의 비율로 먼저 혼합한 후, 염화칼슘에서 고형화 과정을 거쳐서 세포를 지지할 수 있을 때까지 형태를 고정한 후에 염화칼슘을 제거하는 세척 과정을 거친다음, 배양 용기에서 완전히 잠길 만큼 배지를 첨가하여 세포를 배양할 수 있도록 한다.

특히, 이 경우 Alginate 용액에 세포 및 배지가 혼합될 시에 단위용량당 포함되는 세포의 수를 조절하여 실험에 알맞은 농도를 자유롭게 조절하여 파종할 수 있다.

Alginate, 배지, 세포를 함께 균일하게 분포한 상태에서 Alginate bead를 고형화 하므로, 결론적으로 한 개의 baed에 동일한 양의 세포가 파종된다.

이를 통하여 bead 하나에 파종된 세포의 수를 파악하고, 도 2와 같이 자기공명분광 측정 시에 사용된 bead의 개수를 알면 실험에 사용된 전체 세포 수를 파악할 수 있다.이를 통하여 자기공명분광 측정 시에 사용된 세포 농도가 다르더라도 전체 세포 수를 파악할 수 있다면 각각 개별적으로 획득한 스펙트럼을 같은 세포 농도에 대한 수준으로 정규화함으로서 대사체의 발현 수준을 비교하는 것이 가능하다.

세포의 수를 파악하기 위한 방법으로는 간단한 염색을 통하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 파악할 수 있고, 별도의 3D 지지체와 세포의 분리 과정을 필요로 하지 않는 Hematocytometer를 이용한 세포 카운팅 방법을 한 가지 예로 들 수 있다.

도 2a에서의 세포 분화 측정 방법을 수행하기 위한 자기 공명 분광 기기는 도 2b에 도시된 구조로 형성하여 적용될 수 있다. 물론, 본 기기의 구성은 예시적인 것으로, 본 발명에 따른 바이오마커가 적용되는 자기공명분광기법은 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시 예에 따른 세포 분화 측정 방법을 수행하기 위하여 자기공명 분광 기기로 측정할 Alginate bead의 양은 도 2b와 같이 기기에 따른 고주파 코일(50)에 맞춤으로 형성할 수 있다. 이를 테면, 최적으로 신호가 획득되도록 고주파 코일(50)의 크기에 맞추어 Alginate bead를 측정 용기(60)에 담아 코일 전체에 골고루 분포되도록 한다.

MR 신호 측정용 고주파 코일(50)은 다양한 형태의 것을 이용할 수 있으며, 이를테면 Solenoid, Surface, Quardrature 형태 등 다양한 형태가 될 수 있다.

도 2b에서의 용기(60)은 Alginate와 배지를 담는 것이며 코일의 형태에 따라 다양한 용기를 사용할 수 있다. 또한, 세포가 파종된 Alginate bead, 즉 배양지지체(30)는 최적으로 MR 신호를 획득하기 위하여 코일 전체 부분에 분포되도록 용기(60)에 담아 측정할 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에 따른 세포 분화 측정 방법은 자기공명분광 기기 및 자기공명영상 기기와 같이 비침습·비파괴적으로 스펙트럼 데이터를 획득할 수 있는 일련의 자기공명기기에 대해 적용될 수 있다. 또한, 자기공명영상 기기에 이용할 수 있도록 자기공명분광용 시험관이 아닌 다른 형태의 용이한 용기를 사용하여 신호를 측정할 수 있음은 물론이다.

본 발명에 따른, 자기공명 분광 측정 방법은 비침습적인 방법이므로 측정을 완료한 시편을 용기와 함께 원하는 기간 동안 재배양한 후 같은 시편에 대하여 재측정할 수 있는 장점이 구현되게 된다.

아울러, 본 발명에 따른 세포 분화상태의 측정에 이용되는 자기공명분광 측정법으로 세포의 분화 및 증식을 구별하기 위해서 측정 결과인 스펙트럼에서 나타나는 대사체 피크의 종류와 크기를 확인하는 방법을 이용하게 된다.

특히, 분화에 따라 변화하는 것이 확인된 기준 대사체를 세포의 분화를 관찰하는 바이오마커로 사용할 수 있게 된다.

구체적으로는, 자기공명분광 스펙트럼 상에서 동일한 물질은 항상 같은 위치(ppm)에서 나타나고, 포함된 양이 피크의 크기에 반영되는 사실에 기반을 두어 세포의 증식/분화 기간 동안 변화를 보인 대사체를 증식/분화 마커(바이오마커)로 결정하고, 변화를 보이지 않는 대사체를 3D 지지체의 신호로 결정하게 된다.

이 경우 자기공명 분광으로 세포의 증식 및 분화 기간 동안 대사체의 변화를 관찰하기 위한 방법으로 스펙트럼 상에서 나타난 피크에 적분값을 계산하여 비교하여 판단할 수 있다.

또한, 자기공명 분광의 정량적 분석을 위해서 다음과 같은 데이터의 정규화 방법을 적용한다.

우선, 농도 0 ppm에서 나타나는 기준물질을 동일한 양으로 포함하여 데이터를 획득한 후, 각각의 스펙트럼에서 기준물질을 동일한 크기로 맞춤으로서 스펙트럼을 정규화하는 방법을 이용할 수 있다.

다만, 본 발명에서는 기준물질이 동일한 양으로 포함되지 않거나 세포에 악영향을 줄 수 있는 기준물질을 사용하는 경우를 배제하기 위하여 앞서 명시한 방법과 같이 스펙트럼 간의 신호를 같은 수준에서 비교할 수 있도록 측정한 세포의 수를 확인하여 같은 세포 농도에서 비교할 수 있도록 같은 시료에서 측정된 세포 수를 이용하여 각 스펙트럼을 정규화하는 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

이렇게 세포 수를 이용하여 정규화하는 방법은 측정한 각 시편에 대하여 세포 수를 측정하므로 세포 파종 시에 손실이 생겨 당초에 결정된 양으로 파종되지 않을 경우에도 정량 분석을 위한 정규화를 수행할 수 있는 장점이 구현되게 된다.

이외에도, 자기공명분광의 정량적 분석 결과와 세포 증식/분화의 관계를 비교확인하기 위해 세포 수를 파악하기 위한 방법으로는 Hematocytometer를 사용한 세포 카운팅 및 DNA assay 등 일반적으로 쓰이는 세포 카운팅 방법을 이용할 수 있다.

일 회 실험 시에 각 배지(alginate bead)에 파종되는 세포의 농도는 동일하므로 세포 카운팅은 한 개의 배지(Alginate bead)에만 수행하여도 실험에 사용된 전체 세포 수를 파악할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 시료의 증식/분화 상태의 파악은세포의 증식/분화 기간에 따라 자기공명 분광 데이터를 획득하고 비교하여 결정된 대사체의 변화를 통해 할 수 있다. 여기에서 사용된 대사체는세포의 증식/분화 상태를 나타낼 수 있는 바이오마커가 될 수 있다. 이러한 대사체를이용한 바이오마커는 측정된 세포의 농도를 알고 있는 경우라면 다양한 세포에 적용되어 대사체의 적분 값과 상기 바이오마커의비교로 증식/분화의 정도를 파악할 수 있다.

또한 대사체는 세포의 종류에 따라 다르게 나타나므로 세포의 종류 파악이 가능하며 세포 분화 과정에서 목적으로 하는 세포로의 분화 여부도 파악할 수 있다.

이하에서는 세포에 대한 다양한 측정 데이터 결과를 통해 상술한 본 발명의 요지를 구체적으로 설명하기로 한다.

도 3은 3D 배양된 세포에 대한 낮은 MR 민감도(sensitivity)를 확인하기 위하여 인간의 중간엽 줄기 세포의 농도를 달리하며 파종한 후 획득한 분광 데이터(스펙트럼)이며, 도 3의 데이터에 따라 세포의 자기공명 신호 획득이 가능한 최적의 세포 농도는 결정될 수 있다.

파종되는 세포의 농도를 다르게 하기 위해서는 상기 명시한 대로 단위 용량당 포함되는 세포의 수를 다르게 함으로써 실현할 수 있으며 그 농도는 1x10⁶/ml~ 1x10⁷/ml 또는 그 이상까지 광범위하다.

또한 같은 양의 3D 지지체에 세포의 농도만 달리하여 파종한 후 세포의 수에 따른 대사체 변화를 측정,분석함으로서 자기공명분광용 세포 증식 측정 기준이 결정될 수 있다.

도 3에 의하면 14.1T의 자기공명기기를 사용한 경우, 5x10⁵/ml 이하에서는 세포 배지 및 alginate로부터 파생된 신호만이 관찰되고 세포의 신호는 검출되지 않다가 2x10⁶/ml 이상의 농도에서는 3.22ppm과 2.35ppm에서 육안으로 관찰할 수 있을 만큼 신호의 세기가 커진 것을 관찰할 수 있다. 또한, 2x10⁶/ml 이상에서는 꾸준한 증가를 보이므로 각 피크에 대하여 적분 값을 계산하고 변화량을 비교함으로서 세포의 증식 및 분화를 평가할 수 있는 마커로 사용될 수 있다. 특히, 3.22ppm의 피크인 Phosphocholine과 같은 경우 배지 및 Alginate 신호와 겹치지 않는 대사체 신호이므로 증식 및 분화 마커로서 활용이 가능하게 된다.

도 4a 내지 도 4e는 본 발명에 따라 상술한 3D 배양 방법을 적용하여 연골 분화 기간에 세포 신호를 측정한 분광 데이터(스펙트럼)이다.

도 4a는 hMSCs(human mesenchymal stem cells)에 대한 세포배양방법을 적용한 첫번째 스펙트럼이며, 도 4b는 hMSCs에 대한 연골분화 4일째의 스펙트럼, 도 4c는 hMSCs에 대한 연골분화 7일째의 스펙트럼, 도 4d는 hMSCs에 대한 연골분화 11일째의 스펙트럼, 도 4e는 hMSCs에 대한 연골분화 15일째의 스펙트럼을 도시한 것이다.

이러한 연골 분화 기간에 세포 신호를 측정한 분광 데이터(스펙트럼)에서, 각각의 대사체의 적분 값을 정량 분석함으로써 자기공명분광용 세포 분화 측정 바이오마커는 결정될 수 있게 된다.

즉, 자기공명 분광법에서 대사체의 종류가 같으면 항상 같은 위치(ppm)에서 분광 피크가 나타나고, 대사체의 양이 스펙트럼 상의 피크의 적분 값에 반영되는 것에 기반을 두어 본 발명의 자기공명분광용 바이오 마커는 세포의 종류와 분화 정도에 따라 고유한 값을 가질 수 있다.

대사체의 종류에 따른 정량분석을 위하여 획득된 분광 데이터(스펙트럼)는 정규화 과정을 거쳐야 함은 상술한 바 있다. 이러한 정규화 방법으로 0ppm에서 나타나는 기준물질을 동일한 양으로 첨가하고 이를 기준으로 나머지 피크를 정규화하는 방법을 적용할 수 있다.

한편, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 정규화 방법은 기준물질의 첨가 없이 세포의 수를 파악하여 세포 수에 따라 스펙트럼을 정규화하는 방법을 사용할 수 있다. 명시한 정규화 방법을 사용하면 동일하지 않은 양의 기준물질이 들어갔을 경우에도 정규화가 가능하며, 세포에 손상을 줄 수 있는 기준물질을 포함하지 않음으로써 세포 손실을 방지할 수 있다. 이러한 세포의 수를 통하여 정규화하는 방법은 서로 다른 농도(서로 다른 실험 조건)로 파종된 세포라도 사용된 세포의 종류와 분화를 목적으로 하는 세포의 종류가 같다면 증식/분화 상태를 파악하는 것이 가능한 장점을 갖는다.

본 발명에 따르면 상기 기술한 방법을 적용하여 세포의 농도로 정량화하는 방법을 통하여 도 4a 내지 도 4e에 나타난 스펙트럼 상에서 대사체 변화의 정량적 비교를 통하여 비침습적으로 세포 분화를 판단할 수 있는 분화마커를 결정할 수 있다. 한편, 세포 신호를 분석하기 위해서는 상대적으로 매우 크게 관찰되는 물(H₂O) 신호를 제거할 필요성이 있으며 이는 물 신호 억제 기능이 있는 MR Pulse sequence를 사용함으로써 해결한다.

도 5a와 도 5b는 도 4a 내지 도 4e에 나타낸 연골 분화 기간에 획득한 분광 데이터(스펙트럼)에서 변화를 보인 대사체 변화량(피크의 적분 값)을 나타낸 그림이며 각 대사체들의 변화 양상을 파악함으로써 분화 정도를 관찰할 수 있다.

도 5a에 의하면 분화 기간에 따라 단계적으로 지방산의 변화량이 관찰되었으며, 1.30ppm의 지방산(지방산 2)과 같은 경우 다른 대사체에 비하여 큰 폭으로 변화하였다. 이를 통하여 같은 농도로 파종된 시편의 자기공명분광 측정을 통해 분화한 기간에 따른 1.30ppm의 지방산을 관찰하여 연골 분화의 정도를 파악할 수 있다.

또한 도 5b에 의하면 연골 분화 직후에는 양이 감소하였다가 이후에 일정하게 유지되는 대사체를 발견할 수 있다(Alanine, leucine). 이러한 대사체들은 연골 분화를 판가름하는 분화마커로 사용될 수 있다. 한편, 도 5b에 나타난 phosphocholine도 연골 분화 기간 동안 단계적으로 증가하는 것이 관찰되었으므로 분화 유도 기간에 따른 연골 분화 상태를 나타낼 수 있는 분화마커로 사용될 수 있다. 따라서, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA 등의 대사체는, 대사체의피크값을 연골분화를 판단하는 바이오마커로 이용할 수 있게 된다.

도 6은 지방 분화 기간에 변화된 스펙트럼에서 변화를 보인 피크 적분값의 변화량을나타낸 그림이며 각 피크(대사체)들의 변화 양상을 파악함으로써 분화 정도를 관찰할 수 있다.

도 6에 따르면 지방산이 크게 증가한 것을 관찰할 수 있으며 특히 지방산 b에서 가장 큰 변화를 보였는데 이는 도 5a에 나타난 지방산 2와 같은 성분인 1.30ppm의 지방산이다.

도 5a에서 지방산 2(1.30ppm의 지방산)는 약 2배가량의 변화를 보인데 비하여 도 6의 지방산 b(1.30ppm의 지방산)는 도 5a와 같은 분화 기간에서 약 16배가량의 증가를 보였으므로 연골 분화에 비하여 지방 분화에서 지방산이 더 크게 증가한다는 것을 파악할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 실시 예에 따른 대사물질 측정으로 연골 분화와 지방 분화를 구분할 수 있으며 지방산 2의 경우 분화 종류를 구분하는 구분 마커로 활용될 수 있다.

상기 기술한 5와 도 6을 비교함에 있어서 자기공명분광용 기준물질을 토대로 정량화하지 않고 세포의 농도로 정량화하는 방법을 적용할 수 있다.

즉, 세포의 수를 통하여 정규화 과정을 거친 후에 정량 분석되었으므로 분화 기간이 같을 경우에 세포의 수 및 세포의 증가량이 다르더라도 정량적인 비교가 가능하다.

또한 기존의 자기공명분광용 기준물질은 정량적 분석에 필수적인 요소이나 살아있는 세포에 타격을 줄 수 있는 독성을 나타낼 수 있으므로 본 발명의 일 실시 예에 따른 세포 수를 이용한 정규화 방법을 적용하여 세포에 대한 손상을 방지할 수 있다.

본 발명의 일실시 예에 따라 결정된 자기공명분광용 세포 분화마커는 본 발명에서 실시한 연골, 지방 분화가 아닌 여타 다른 분화에 대해서도 적용이 가능하다.

또한 다른 분화 과정에서 발견된 여타 대사체도 분화마커로 활용될 수 있다.

또한 세포의 종류에 따라 자기공명용 바이오마커로 사용되는 대사체는 달라질 수 있으며, 이는 분화를 목적으로 하는 세포에 대해서도 동일하게 적용된다. 즉, 자기공명분광용 세포분화마커는 세포의 종류 및 분화되는 세포의 종류에 따라 더욱 다양한 대사체가 발견되므로, 세포 배양 중 측정한 자기공명분광 데이터에서 증식/분화와 연관되어 변화를 보이는 모든 대사체는 본 발명에 따른 자기공명분광용 세포분화마커로 적용될 수 있다.

즉, 본 발명의 실시예 및 실험예로 상술한 예는 인간의중간엽 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 유도한 세포 시료로부터 획득된 대사체 중 하나를 바이오마커로 적용할 수 있음을 설명하였다. 이를테면, Fatty acids, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA 중 선택되는 어느 하나의 대사체를바이오마커로 이용할 수 있음을 서술하였으며 1.30ppm의 지방산을 이용하여 연골분화를 판단하는 바이오마커로, 1.30ppm의 지방산을 이용하여 지방분화를 판단하는 바이오마커로 이용될 수 있음을 설명하였다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 세포의 종류 및 분화의 종류에 따라 발견될 수 있는 다양한 대사체가 존재하며 이에 따라 본 발명에서는 세포로부터 자기 공명 분광기기를 이용하여 자기공명분광 신호를 측정하고, 측정된 세포의 농도에 따라 자기공명 신호를 정규화하여, 세포의 분화과정에서 측정한 스펙트럼 상에서 변화를 나타내는 대사체의 비교를 통해 세포의 증식 및 분화의 정도를 판단하는 요지를 구현하는 것은 모두 본 발명의 요지에 포함된다 할 것이다.

또한 본 발명에 따르면 세포의 손실 없이 같은 시편으로 지속적인 실험이 가능하고, 별도의 염색 및 화학적 반응 과정 없이 자기공명분광 데이터를 획득하는 것으로 세포 상태의 판별이 가능하므로 실험의 재현성을 향상시키며, 실험 과정의 간소화, 실험 비용의 절감을 유도할 수 있다.

전술한 바와 같은 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시예에 관해 설명하였다. 그러나 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 변형이 가능하다. 본 발명의 기술적 사상은 본 발명의 기술한 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

10: 자기공명분광용 시험관 (NMR tube)
20: 배양 지지체 (Scaffold)
30: 배지
40: 고형재
50: 신호측정용 고주파 코일
60: 용기

Claims (9)

1. 세포로부터 자기 공명 분광기기를 이용하여 자기공명분광 신호를 측정하는 1단계;
   측정된 세포의 농도에 따라 자기공명 신호를 정규화하는 2단계;
   상기 세포의 분화과정에서 측정한 스펙트럼 상에서 변화를 나타내는 대사체의 비교를 통해 세포의 증식 및 분화의 정도를 판단하는 바이오마커를 결정하는 3단계;
   를 포함하는 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 2단계 및 3단계는,
   상기 세포의 분화하는 과정에서 얻은 대사체의 스펙트럼을 세포의 수로 정규화하며,
   정규화한대사체 피크의 적분값을 비교하여 세포의 증식 및 분화의 정도를 판단하는 바이오마커로 결정하는 단계인 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
   
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
   상기 세포는,
   지지체(scaffold)에 세포를 3D 배양하는 방법을 적용하여 배양하는 방법을 적용하는 것을 특징으로 하는 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
   
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 3단계의 상기 바이오마커는,
   인간의 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 유도한 세포 시료로부터 획득된 대사체 중 하나인 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
   
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 3단계의 상기 바이오마커는,
   Fatty acids, Leucine, Alanime, Phosphocholine, Glutamine, GABA 중 선택되는 어느 하나의 대사체인 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
   
6. 청구항 4에 있어서,
   상기 3단계는,
   1.30ppm의 지방산을 이용하여 연골분화를 판단하는 바이오마커로 이용하는 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
   
7. 청구항 4에 있어서,
   상기 3단계는,
   1.30ppm의 지방산을 이용하여 지방분화를 판단하는 바이오마커로 이용하는 자기공명분광법을 이용한 세포 증식 및 분화 상태의 비침습적 측정방법.
   
   
8. 세포시료에서 얻어지는 자기공명분광데이터를 분석하여 세포의 증식 및 분화 정보를 확인하는 청구항 1의 측정방법에 이용되는 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커.
   
9. 청구항 8에 있어서,
   상기 바이오마커는,
   세포 배양 중 측정한 자기공명분광 데이터에서 증식 및 분화와 연관되어 변화를 보이는 다수의 대사체 중 어느 하나 또는 이들 조합을 증식 및 분화 정도를 판단기준으로 하는 자기공명분광용 세포 증식 및 분화마커.

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