ITUD20080190A1 - Procedimento per l'indagine batteriologica su plasma - Google Patents

Description

Descrizione

"PROCEDIMENTO PER L'INDAGINE BATTERIOLOGICA SU PLASMA"

CAMPO DI APPLICAZIONE

II presente trovato si riferisce ad una nuova procedura per un test diagnostico su un campione ematico, consistente nella coltura di eventuali microrganismi presenti nel sangue e nella determinazione della loro carica batterica.

STATO DELLA TECNICA

E' noto che l'analisi diagnostica su sangue, siero e/o plasma può avere diversi obbiettivi ed applicazioni. L'analisi microbiologica, invece, individua, normalmente attraverso tecniche colturali, la presenza di batteri o altri microrganismi patogeni, poiché potenzialmente responsabili di infezioni in diversi apparati del corpo umano, e tramite test successivi ne identifica la specie (test di identificazione) e ne determina la sensibilità in vitro agli antibiotici (test antibiogramma).

Per quest'ultimo tipo di indagine, allo stato attuale sono note diverse tecniche colturali per la rilevazione della presenza/assenza, del numero e della specie di organismi patogeni.

La tecnica classica (considerata storicamente come riferimento) consiste nella distribuzione di volumi noti di campioni di sangue intero, eventualmente diluiti, su diversi terreni di coltura solidi idonei alla proliferazione delle eventuali colonie batteriche presenti nel sangue intero, note come piastre di Petri. Tali colture vengono fatte in condizioni di aerobiosi ed anaerobiosi.

La valutazione semiquantitativa dei batteri presenti nella coltura dopo un certo periodo di tempo consente di avere indicazioni approssimative sulla concentrazione iniziale dei batteri, con riferimento al volume di campione utilizzato ed al fattore di diluizione eventualmente utilizzato.

I tempi necessari per l'esecuzione di questo test richiedono comunque un'incubazione delle piastre di Petri prolungata per più giorni (di norma 5-7 giorni) con lettura e controllo giornaliero. Solo al termine del tempo sopramenzionato l'analisi si potrà ritenere terminata ed un'eventuale positività potrà essere esclusa.

Il conteggio à ̈ inoltre basato prevalentemente su valutazioni visive della distribuzione batterica finale e su considerazioni di tipo statistico da parte dell'operatore, non garantendo così la precisione assoluta del procedimento.

Inoltre, il procedimento noto comporta una notevole mole di lavoro sia per la semina delle varie piastre sia per le letture delle stesse che devono essere eseguite giornalmente soprattutto considerando che una percentuale consistente delle colture risulteranno poi negative.

In tempi successivi al fine di semplificare tali procedure analitiche sono stati realizzati nuovi sistemi parzialmente automatizzati che rilevano la presenza di micro-organismi tramite particolari reazioni chimiche all'interno del campione, ad esempio misurando la formazione di anidride carbonica od altre sostanze chimiche indicatrici della presenza di batteri.

Questi metodi forniscono un'informazione sulla presenza/assenza dei batteri ed una lettura del test automatizzata, permettendo così di selezionare i campioni positivi da quelli negativi e di ridurre il lavoro dell'operatore.

Utilizzando questi sistemi, per i campioni risul tati positivi, si rende comunque necessaria la procedura colturale su piastra precedentemente descritta (soggetta a tempi molto lunghi) per valutare la tipologia dei batteri rilevati dal sistema ed utilizzare l'isolamento dei potenziali patogeni per l'esecuzione dei test successivi (identificazione ed antibiogramma) . Inoltre, tali metodi noti possono essere disturbati da reazioni aspecifiche o altre variabili che incidono sull'affidabilità dei risultati ottenuti.

Spesso, inoltre, un solo prelievo può non evidenziare una batteriemia intermittente e rende difficile interpretare il significato clinico dell'isolamento di taluni microrganismi. Da qui la necessità, riportata nelle linee guida internazionali, di effettuare prelievi sequenziali sullo stesso paziente.

Scopo del presente trovato à ̈ quello di mettere a punto un procedimento per il test delle emocolture utlizzando il plasma del campione in esame applicando la tecnologia light scattering (deviazione della luce) relativo alle colture in aerobiosi, in grado di fornire risultati precisi ed affidabili con notevole risparmio di tempo e di attrezzatura rispetto ai metodi noti.

Altro scopo del trovato à ̈ mettere a punto un procedimento automatizzabile, che richiede una manualità operativa estremamente ridotta, grazie all'automazione delle fasi di lettura, elaborazione dei dati, esposizione dei risultati, ecc.

Ulteriore scopo del trovato à ̈ mettere a punto un procedimento avente una sensibilità molto elevata nello stabilire in breve tempo la presenza/assenza di cariche batteriche nel campione di plasma.

Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato à ̈ espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti.

Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato, o varianti dell'idea di soluzione principale.

Il procedimento secondo il presente trovato prevede l'uso di plasma del campione ematico prelevato dal paziente.

Preventivamente il campione di sangue viene tipicamente messo a contatto con un anticoagulante e, opzionalmente, poi U sato per spaccare i globuli rossi in modo da liberare i potenziali batteri all'interno dei globuli rossi.

Il campione di sangue viene sedimentato per ottenere plasma. Il plasma viene prelevato ed inoculato in un terreno di crescita in stato liquido (brodo eugonico) e mantenuto in agitazione continua onde facilitare la crescita dei batteri presenti.

La crescita batterica viene misurata con tecnologia basata su light scattering, con segnalazione automatica della torbidità Mac Farland 0,5, utile, come si vedrà in seguito, per poter effettuare 1'antibiogramma anche senza identificazione di specie. Sul brodo eugonico in stato liquido e risultato positivo alla misura con tecnica light scattering à ̈ consentito effettuare le prove di funzionalità antibiotica al raggiungimento della torbidità Mac Farland 0,5 senza aspettare l'isolamento dei batteri eventualmente presenti, applicando 1'antibiogramma diretto agli antibiotici somministrati da parte del clinico. E' noto che il clinico somministra l'antibiotico anche senza le indicazioni batteriologiche al fine di poter salvare la vita del paziente in esame.

L'algoritmo matematico applicato alla rilevazione della curva di crescita dei batteri consente di quantificare la carica batterica ed ipotizzare l'identificazione di specie batteriche in base al confronto con curve di crescita ottenute da una banca dati, curve di crescita rilevate dallo stesso strumento confrontando ceppi batterici ATCC (ceppi batterici di controllo standard depositati presso banca dati pubblica).

Il procedimento secondo il trovato utilizza, come detto, la tecnica basata sulla deviazione di un fascio luminoso (light-scattering) dovuta alla presenza di elementi corpuscolari (batteri, funghi) all'interno di una soluzione liquida.

La Richiedente ha sperimentato che la tecnologia light-scattering à ̈ particolarmente sensibile e quindi adatta per eseguire misurazioni della quantità di luce diffusa dovuta a corpi in sospensione, quali ad esempio i batteri ed altri microrganismi, anche quando la concentrazione della sospensione à ̈ estremamente ridotta.

Per concretizzare tale tecnologia ed eliminare l'interferenza della misura dovuta alla presenza dei globuli rossi nel brodo di coltura e/o all'elevata concentrazione di emoglobina, la Richiedente ha focalizzato l'attenzione sulla ricerca di batteri e microrganismi, aerobi, microaerofili o capnofili, presenti nel campione di plasma e, secondo una variante, anche la presenza di batteri all'interno dei globuli rossi, provocando la lisi dei globuli rossi stessi.

II metodo secondo il presente trovato trova vantaggiosa applicazione come indagine propedeutica alla successiva esecuzione di un test antibiogramma.

Più in dettaglio, il procedimento secondo il presente trovato comprende una prima fase in cui si effettua il prelievo del campione ematico da un paziente ed una seconda fase di dispensazione del campione prelevato in un primo contenitore.

Vantaggiosamente, in questa fase si ha l'aggiunta dell'anticoagulante.

Come variante si ha l'esecuzione di un'operazione di lisi del campione contenuto nel primo contenitore.

Il procedimento comprende, inoltre, le seguenti fasi:

- una terza fase in cui si determina la sedimentazione del campione, nel caso della suddetta variante che prevede la lisi si ha la sedimentazione delle emazie lisate presenti nel campione, in modo da separare la parte corpuscolare, che sedimenta sul fondo del primo contenitore, dalla parte liquida, o plasma;

- una quarta fase in cui si preleva una determinata porzione del surnatante, costituito della parte liquida, o plasma, così ottenuto. Tipicamente nel plasma sono contenuti la maggior parte dei batteri e microrganismi associati alle patologie più comuni e diffuse;

- una quinta fase in cui s'inocula la porzione della parte liquida, o plasma, ottenuta in un terreno di coltura, all'interno di un secondo contenitore predisposto per consentire una coltura batterica ed una lettura strumentale mediante una macchina di misura ottica. In particolare, può trattarsi vantaggiosamente di un terreno di coltura liquido, cosiddetto brodo eugonico, all'interno di un flacone, ad esempio in vetro, predisposto per consentire una coltura batterica ed una lettura strumentale. La brodocoltura à ̈ una soluzione acquosa di terreni in grado di favorire la crescita e la proliferazione dei microrganismi eventualmente presenti nel campione;

- una sesta fase in cui si consente la crescita batterica nel terreno di coltura contenuto nel secondo contenitore. In particolare, il flacone già inoculato ed alloggiato nello strumento viene sottoposto a termostatatazione e miscelazione continua a 37° per favorire le eventuali crescite dei microorganismi presenti nel campione di plasma;

una settima fase in cui, mediante la macchina di misura ottica, sul terreno di coltura contenuto nel secondo contenitore si effettua una misura ottica per determinare la presenza di batteri e microrganismi nel campione plasma. In particolare, sul secondo contenitore si effettuano misure ottiche cinetiche con temporizzazione fissa, basate sulla tecnologia di light-scattering, per determinare la presenza di eventuali crescite batteriche, e successivamente tramite analisi dei segnali lo strumento evidenzia le curve di crescita batterica. Favorevolmente, la misura ottica della settima fase avviene contestualmente alla sesta fase, si da misurare direttamente la crescita batterica.

Per plasma s'intende il costituente liquido del sangue sottoposto a trattamento con anticoagulante, in cui à ̈ solitamente presente nella percentuale di circa 55% della massa totale. Si tratta di una soluzione acquosa, di colore giallo e di carattere colloidale, contenente proteine, glucidi, lipidi, sali.

Vantaggiosamente, la misura ottica che viene effettuata à ̈ di tipo nefelometrico basata su tecnologia di light-scattering. Tale misura ottica fornisce una misura quantitativa della conta batterica, basata su un andamento esponenziale funzione del tempo, assumendo un andamento del tipo CB=Ae<K>n<(t't>„<)>+ C.

La misura ottica à ̈ molto vantaggiosa in quanto permette di accorciare notevolmente i tempi d'analisi, rispetto alle procedure d'analisi note che si basano su indicatori chimici e successiva coltura su piastre di Petri.

Inoltre, la misura ottica della settima fase à ̈ atta a segnalare il raggiungimento del livello di torbidità Mac Farland 0,5.

Infatti, il procedimento à ̈ in grado di segnalare, mediante visualizzazione a monitor o segnalazione acustica, l'eventuale torbidità corrispondente al segnale di crescita dei batteri presenti nel campione di plasma in esame, al raggiungimento del valore di torbidità Mac Farland 0,5. A tale scopo à ̈ presente, nell'apposito strumento, un lattice di torbidità standard di controllo, per poter segnalare la torbidità Mac Farland 0,5 ed eseguire successivamente l 'antibiogramma idoneo.

E' possibile così, effettuare l'esecuzione diretta dell'antibiogramma , utilizzando come inoculo il medesimo brodo eugonico pronto al livello di torbidità richiesto di 0,5 Mac Farland.

Ciò à ̈ vantaggioso in quanto, nella tecnica nota solitamente per eseguire 1'antibiogramma à ̈ richiesta, dalle linee guide internazionali, un isolamento delle colonie sulle piastre di Petri e successiva preparazione di una sospensione batterica con livello di torbidità Mac Farland 0,5 ottenuto mediante stemperamento delle colonie. Quindi, nell'arte nota solitamente si parte da un concentrato batterico che viene diluito. Invece, con il trovato, si effettua la misurazione progressiva della crescita batterica, fino a che si raggiunge automaticamente il valore di torbidità Mac Farland 0,5, consentendo un risparmio di tempo ed economico.

In questo modo, le fasi fino ad ora descritte si chiudono con la disponibilità di campioni positivi a torbidità idonea per iniziare l'antibiogramma clinico ovvero le prove di funzionalità verso gli antibiotici direttamente dal brodo di crescita.

Questo vantaggio consente di fornire al clinico il risultato funzionale del primo antibiotico te stato (resistente o sensibile) al fine di curare correttamente il paziente per l'antibiotico somministrato se risultasse sensibile, oppure di cambiare antibiotico nel caso la prova fornisse risultati di resistenza.

Il trovato, quindi, consente l'esecuzione di un antibiogramma di tipo clinico, ovvero un antibiogramma diretto effettuato sul brodo di crescita inoculato con il campione di plasma in esame risultato positivo alla crescita batterica.

Inoltre, il raggiungimento del valore 0,5 Mac Farland secondo il trovato à ̈ molto più preciso rispetto alla procedura di diluizione del campione concentrato eseguita nella tecnica nota. Il raggiungimento di un preciso valore di torbidità à ̈, infatti, più affidabile partendo da valori bassi. E' da notare che, come ulteriore vantaggio ed a prescindere dalla necessità di effettuare un'antibiogranima, la suddetta formula matematica consente anche una quantificazione della conta batterica.

Tale quantificazione à ̈ data dalla misurazione differenziale tra torbidità iniziale e quella finale che viene valutata in combinazione con altri parametri (tempo, velocità di replicazione del microrganismo). Ciò à ̈ utile per la conta di batteri la cui quantificazione à ̈ complessa, ad esempio batteri con un tempo di crescita lungo, nell'ordine dei giorni, o comunque per i quali la durata della crescita batterica dipende dalla tipologia batterica e dalla velocità di replicazione, fornendo, oltre alla positività, anche un riscontro quantitativo.

In altre parole, la procedura secondo il trovato potrebbe essere utilizzata come un'incubazione prolungata per fornire un'indicazione dell'entità dell'infezione batterica nel brodo di coltura, in altre applicazioni o misurazioni che non siano l'esecuzione del test antibiogramma.

Ad esempio, ciò à ̈ valido per l'indagine su batteri di interesse, ambientale, alimentare, ovvero la rilevazione e quantificazione di batteri in matrici alimentari o mangimi, in cui 1<1>antibiogramma non à ̈ previsto né utile al caso.

Secondo una variante di soluzione, nella suddetta seconda fase si dispensa un mezzo lisante idoneo nel primo contenitore al fine di ottenere una lisi dei globuli rossi, con lo scopo di liberare e quindi misurare batteri intracellulari eventualmente presenti all'interno degli stessi globuli rossi.

La variante in cui si ha la lisi dei globuli rossi permette un'indagine sia dei batteri extracellulari, sia di quelli intracellulari.

Il tempo d'analisi con il presente trovato à ̈ notevolmente ridotto rispetto ai metodi della tecnica nota. Tale velocità di rilevazione à ̈ possibile grazie a una misura di tipo nefelometrico basata su light scattering, molto più rapida e sensibile nello stabilire in breve tempo la presenza/assenza di crescite batteriche nel campione grazie ad una rilevazione diretta della torbidità e quindi della concentrazione degli organismi.

Il presente trovato permette, così di fornire risultati precisi ed affidabili con notevole risparmio di tempo rispetto ai metodi noti, ed à ̈ realizzabile anche con macchinari e strumenti preesistenti.

In altre parole, il procedimento consente di individuare tutti i positivi entro un tempo signifiestivamente ridotto rispetto ai metodi classici per emocoltura.

Questo consentirà di ridurre significativamente il tempo medio di refertazione dell'antibiogramma con evidenti benefici terapeutici e di gestione del paziente.

Il procedimento secondo il trovato à ̈ automatizzabile, richiede una manualità operativa ridotta, grazie all'automazione delle fasi di lettura, elaborazione dei dati, esposizione dei risultati, ecc.

ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI

Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di una forma preferenziale di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:

- la fig. 1 Ã ̈ un diagramma a blocchi di un procedimento secondo il presente trovato;

- la fig. 2 Ã ̈ una rappresentazione schematica del funzionamento di un procedimento secondo il presente trovato.

DESCRIZIONE DI UNA FORMA PREFERENZIALE DI

REALIZZAZIONE

Con riferimento alle figg. 1 e 2, un procedimento per l'indagine batteriologica su plasma comprende una fase di prelievo 50 di un campione di sangue 12 dal paziente ed una successiva fase di dispensazione 51 in cui si dispensa il campione 12 in un flacone 14 di raccolta sterile contenente un anticoagulante, tipo SPS. E' preferibile selezionare un diverso punto per ciascun prelievo.

Altra necessità à ̈ quella di evitare di aspirare il sangue da cateteri venosi o arteriosi a permanenza, a meno che sia impossibile effettuare la puntura endovenosa o si sospetti una sepsi da catetere endovascolare.

Dopo avere palpato la zona del corpo del paziente da cui effettuare il prelievo, si disinfetta accuratamente, poiché l'inquinamento per il tipo di coltura utilizzato à ̈ molto facile.

Si lascia asciugare la zona e si procede ad immettere l'ago, senza palpare nuovamente la zona disinfettata, per effettuare il prelievo.

Preliminarmente, si procede alla disinfezione del tappo 16 dei flaconi 14 in cui verrà introdotto il campione ematico e si lascia asciugare.

Si ha un'ulteriore fase di agitazione 52 in cui si agita il flacone 14, in modo da attivare l'anticoagulante SPS per impedire la formazione di coagulo.

Su ciascun flacone 14 viene attaccata un'etichetta 18 con i dati del paziente riportati tramite codice a barre 20. Scritte, cerotti, etichette od altri adesivi nella zona occupata dal codice a barre del flacone sono da evitare. Ciò per consentire la tracciabilità del campione 12 a mezzo della lettura del codice a barre stesso.

Si prevede, quindi, la termostatazione a 37 °C del flacone 14 in un apposito armadio termostatato 22.

Opzionalmente, per effettuare un'indagine dei batteri intracellulari, Ã ̈ prevista anche una fase di lisi 60 dei globuli rossi con l'utilizzo di un idoneo agente lisante, successivamente all'addizione dell'anticoagulante.

Si ha una successiva sedimentazione 53 di tipo gravitazionale., in un'apposita unità di sedimentazione 29, in cui, con un'attesa di circa 1 - 3 ore, si ottiene di separare il plasma, indicato con il riferimento 26, dalla parte corpuscolata.

La provetta viene posta ad inclinazione a 45°, per velocizzare la separazione della parte corpuscolata 24 del sangue rispetto al plasma 26.

Si procede quindi, con la fase di prelievo sterile 54 in cui si prelevano circa 500 — 1000 microlitri di plasma 26 dal flacone 14, a mezzo di siringa sterile 28.

Successivamente, si ha una fase di inoculo 55 in cui s'inocula il campione (plasma) in vials, o provette, 30 contenenti un brodo di coltura liquido (brodo eugonico) ed una successiva fase di coltura 56. Il brodo eugonico à ̈ idoneo alla crescita di microrganismi aerobi ed all'esecuzione di una misura ottica.

I vials 30 sono preliminarmente sterilizzati tramite autoclavatura, ed à ̈ raccomandabile comunque risterilizzare la membrana in gomma del vial 30 prima di effettuare l'inoculo.

In particolare, i vials 30 sono impiegati per una misura di light-scattering in un'apposito rotore di una macchina di misura nefelometrica 32.

Vantaggiosamente, ciascun vial 30 di coltura e misura nefelometrica à ̈ sostanzialmente di dimensioni e spessore omogeneo, realizzato in materiale trasparente alle radiazioni elettromagnetiche per determinate lunghezze d'onda, ad esempio quali vetro ottico o plastica trasparente.

Secondo una soluzione, la coltura batterica avviene all'interno della stessa macchina di misura nefelometrica 32.

Secondo una forma di realizzazione esemplificativa, la macchina di misura nefelometrica 32 comprende un alloggiamento 34 con una o più apposite sedi 36 per i vial 30 di coltura.

Con il suddetto alloggiamento 34 coopera un'unità di elaborazione 38, fornita di adeguate periferiche, quali video, tastiera, stampante, ecc., che avvia e gestisce in modo automatico l'intero ciclo operativo di analisi.

All'interno dell'alloggiamento 34 à ̈ previsto un dispositivo di termostatazione 40, gestito dall'unità di elaborazione 38, per mantenere la temperatura dei campioni costante e controllata, a circa 37°, durante l'incubazione e crescita batterica. Mezzi agitatori 43, meccanici, magnetici od altro, sono previsti per permettere l'omogeneizzazione e rendere uniforme la sospensione di batteri nel plasma inoculato all'interno di ciascun vial 30.

Secondo una soluzione particolare, ogni vial 30 à ̈ provvisto al suo interno, di un'ancorina metallica ferromagnetica che inizialmente à ̈ appoggiata sul fondo. Detta ancorina metallica coopera con un i mezzi agitatori 43, nel caso provvisti di magneti, che, avviati dall'unità di elaborazione 38 all'inizio del ciclo, trascinano 1'ancorina metallica all'interno della provetta, permettendo l'omogeneizzazione e rendendo uniforme la sospensione.

L'omogeneizzazione della sospensione dei batteri in crescita rende la rilevazione indipendente da flottazioni, sedimentazioni ed aggregazioni tipiche del modo di crescere delle varie specie batteriche.

Nel caso di caricamento di più campioni (vials), la macchina di misura nefelometrica 32 comprende un gruppo mobile 44 che permette la lettura del singolo campione ad intervalli prestabiliti e per tempi prestabiliti mediante un dispositivo di lettura 42 nefelometrico light-scattering della stessa macchina di misura nefelometrica 32.

Il dispositivo di lettura 42 Ã ̈ provvisto di un dispositivo di focalizzazione e collimazione 46 e di un dispositivo di rilevazione 48.

Il dispositivo di focalizzazione e collimazione 46 Ã ̈ associato ad un dispositivo generatore di radiazione elettromagnetica 49, generata secondo un suo asse d'emissione X.

II generatore di radiazione elettromagnetica 49 invia la radiazione al dispositivo di focalizzazione e collimazione 46 che il dispositivo di lettura 42 allinea rispetto al vial 30.

Secondo il presente trovato, la radiazione elettromagnetica può essere polarizzata o meno.

La radiazione, emessa dal dispositivo di focalizzazione e collimazione 46, viene deviata dal campione e raccolta dal dispositivo di rilevazione 48. Durante tutta l'incubazione della fase di coltura 56, il dispositivo di rilevazione 48 rileva l'eventuale crescita batterica, mediante lettura nefelometrica del campione ed evidenzia le curve di crescita batterica rilevate (fase di calcolo 57) e calcola la carica batterica finale per mezzo della macchina di misura nefelometrica 32. Viene segnalato, a monitor oppure acusticamente, i campioni positivi al raggiungimento di torbidità Mac Farland 0,5 al fine di eseguire le idonee prove per 1'antibiogramma clinico.

Infatti, una volta rilevato un campione positivo alla coltura, Ã ̈ possibile, mediante la determinazione del Mac Farland 0,5 sul brodo di coltura eugonico, effettuare l'esecuzione diretta dell 'antibiogramma, utilizzando come inoculo proprio lo stesso brodo eugonico a Mac Farland 0,5.

Per tale tecnica non sarà necessaria, quindi, la classica fase di isolamento ottenuta tramite semina del brodo su piastre di Petri e successiva preparazione dell'inoculo mediante stemperamento, in soluzione fisiologica/salina delle colonie isolate, fino al livello di torbidità 0,5 Mac Farland.

Terminata la rilevazione sul campione, il gruppo mobile 44 porta in cooperazione il dispositivo di lettura 42 con il vial 30 successivo.

Secondo una prima soluzione, il dispositivo di rilevazione 48 comprende un rilevatore 47 che almeno durante il periodo di esame relativo alla singola provetta à ̈ situato ad un angolo fisso rispetto all'asse ottico.

Secondo una variante, il dispositivo di rilevazione 48 comprende una pluralità di rilevatori 47 (in fig. 2 ne sono rappresentati due), situati a diverse angolazioni rispetto all'asse ottico del detto sistema di collimazione e focalizzazione.

Nel caso di più rilevatori 47, detti possono essere del tipo specifico posizionato in un angolo definito, ovvero del tipo continuo, in grado di coprire tutto l'angolo praticamente senza soluzione di continuità.

Vantaggiosamente, detti rilevatori 47 sono disposti a coprire sostanzialmente un angolo variabile fra 0° e 180° rispetto all'asse ottico, in quanto, per considerazioni di simmetria, le informazioni ottenute con i rilevatori posti a coprire detti angoli forniscono tutte le informazioni necessarie per l'analisi del campione in esame.

La radiazione viene letta in successione con cadenze volute dal dispositivo di rilevazione 48 secondo un angolo definito, oppure secondo angoli definiti compresi tra 0° e 180° rispetto all'asse di emissione, secondo le due alternative, con conseguente costruzione della curva che rappresenta l'intensità della radiazione deviata, rispetto al tempo, correlata alla crescita batterica.

Le radiazioni rilevate dai rilevatori sono convertite in segnali elettrici e quindi inviati all'unità di elaborazione 38 che provvede alla elaborazione dei dati ed al calcolo dei risultati.

in particolare, la curva di crescita batterica viene confrontata con valori di riferimento compresi in una banca dati 39 dell'unità di elaborazione 38 per la determinazione dei parametri tipici di analisi, quali la quantità, la velocità di replicazione e la morfologia dei microorganismi presenti nel campione.

La procedura di calcolo si basa sul fatto che la crescita batterica all'interno della sospensione provoca la variazione nel tempo dell'intensità di luce deviata.

Letture periodiche della radiazione deviata permettono la costruzione, tramite procedure di interpolazione note, della curva di crescita delle colonie batteriche all'interno del campione di plasma in esame, detta curva essendo relativa all'angolo di rilevazione in cui à ̈ posizionato il rilevatore.

E' stato sperimentalmente dimostrato che la curva di crescita ha un andamento esponenziale funzione del tempo, del tipo CB=Ae<K>n<<t->V C.

Nella formula, CBrappresenta l'intensità della radiazione deviata, A e C sono costanti dipendenti rispettivamente dalla specie batterica in esame e dalla concentrazione iniziale, Knà ̈ un parametro che tiene conto dell'angolo di posizionamento del rilevatore, t à ̈ il tempo e t0à ̈ un ritardo legato al numero di batteri presenti nel campione.

Correlando i parametri caratteristici della formula CB=Ae<K>n<(t'>V C, quali A, C, Kn, con valori standard ottenuti sperimentalmente e memorizzati in una banca dati nell'unità di elaborazione, à ̈ possibile ottenere informazioni utili ad identificare la specie batterica presente all'interno della soluzione.

La suddetta banca dati 39 viene costruita utilizzando, ad esempio, una delle seguenti due procedure.

La prima procedura prevede di acquisire campioni di specie batterica già identificata (ad esempio ceppi ATCC ), inserirli nell'apparecchiatura secondo il trovato e costruire la curva caratteristica relativa a quella particolare specie batterica.

La seconda si attua utilizzando un campione con specie batterica da identificare e, dopo averlo separato, ad esempio in due metà, si analizza la prima con il metodo tradizionale, ad esempio delle piastre di Petri, e la seconda con il procedimento secondo il trovato.

In questo modo à ̈ possibile associare ad ogni specie batterica identificata con il metodo tradizionale una particolare curva di crescita ottenuta con il procedimento secondo il trovato.

La banca dati viene costruita, mediante il procedimento stesso, avendo presente il tipo di batteri, utilizzando un gran numero di dette procedure, ad esempio nell'ordine delle centinaia per ogni angolo di rilevazione caratteristico.

In questo modo, per ciascuna specie batterica à ̈ possibile valutare i parametri della formula CB=Ae<K>n<(t~>V C, ad esempio A, C, Kn, ecc.

Nel corso dell'analisi del campione in esame, l'unità di elaborazione 38 calcola i parametri (formula CB=Ae<K>n<(t'>V C) della curva di crescita ottenuta e li confronta con i parametri memorizzati nella banca dati 39 e relativi alle varie specie batteriche.

Da questo confronto, l'unità di elaborazione 38 fornisce, con buona affidabilità, l'identificazione della specie batterica presente nel campione di plasma.

Dal momento che la caratteristica della curva di crescita à ̈ strettamente dipendente dall'angolo di rilevazione, gli angoli di monitoraggio devono essere gli stessi di quelli utilizzati per creare la banca dati.

Rispetto all'utilizzo di un singolo rilevatore posizionato ad un angolo determinato, l'applicazione di più rilevatori ad angoli diversi permette di ottenere maggiori informazioni riguardo 1'anisotropia del segnale, che à ̈ strettamente correlata alla morfologia dei microorganismi presenti nel campione di plasma.

Con riferimento alla formula CB=Ae<K>n<(t~>V C, i parametri CBe t0sono dipendenti dal numero di batteri presenti nel campione.

Il numero di batteri, tramite t0, condiziona l'evoluzione della curva di crescita, che à ̈ ottenuta attraverso l'elaborazione dell'intensità della radiazione deviata.

Tutta la procedura di calcolo à ̈ automatizzata e l'unità di elaborazione 38, avviato il ciclo, fornirà in uscita, dopo il tempo necessario ed a mezzo video o stampante, tutte le informazioni volute, quali concentrazione batterica iniziale, velocità di crescita, informazioni sul tipo di batterio, ecc.

È chiaro che al procedimento per l'indagine batteriologica su plasma fin qui descritto possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti, senza per questo uscire dall'ambito del presente trovato.

È anche chiaro che, sebbene il presente trovato sia stato descritto con riferimento ad esempi specifici, un esperto del ramo potrà senz'altro realizzare molte altre forme equivalenti di procedimento per l'indagine batteriologica su plasma, aventi le caratteristiche espresse nelle rivendicazioni e quindi tutte rientranti nell'ambito di protezione da esse definito.

Claims (20)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per l'indagine batteriologica su plasma, comprendente le seguenti fasi: - una prima fase in cui si effettua il prelievo di un campione ematico (12) da un paziente; - una seconda fase in cui si dispensa il campione ematico (12) in un primo contenitore (14); caratterizzato dal fatto che comprende, inoltre, le seguenti fasi: - una terza fase in cui si determina la sedimentazione del campione ematico (12), in modo da separare la parte corpuscolare (24), che sedimenta sul fondo del primo contenitore (14), dalla parte liquida, o plasma, (26) che rappresenta il surnatante; - una quarta fase in cui si preleva una determinata porzione del surnatante, costituito della parte liquida, o plasma (26), così ottenuta; - una quinta fase in cui si inocula la porzione della parte liquida, o plasma, (26) ottenuta in un terreno di coltura, all'interno di un secondo contenitore (30) predisposto per consentire una coltura batterica ed una lettura strumentale mediante una macchina di misura ottica (32); - una sesta fase in cui si consente la crescita batterica nel terreno di coltura contenuto nel secondo contenitore (30); - una settima fase in cui, mediante la macchina di misura ottica (32), sul terreno di coltura contenuto nel secondo contenitore (30) si effettua una misura ottica per rilevare e/o quantificare la presenza di batteri e microrganismi.
2. 2. Procedimento come nella rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la misura ottica della settima fase avviene contestualmente alla sesta fase, sì da misurare direttamente la crescita batterica
3. 3. Procedimento come nella rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che la misura ottica della settima fase à ̈ atta a segnalare il raggiungimento del livello di torbidità Mac Farland 0,5 del terreno di coltura, in modo da poter eseguire direttamente 1 'antibiogramma utilizzando come inoculo il medesimo terreno di coltura.
4. 4. Procedimento come nella rivendicazione 1, 2 o 3, caratterizzato dal fatto che la rilevazione e/o identificazione à ̈ mirata almeno alla ricerca extracellulare dei globuli rossi, di batteri e microrganismi aerobi, microaerof ili o capnofili, presenti nella parte liquida, o plasma, (26).
5. 5. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura à ̈ di tipo liquido.
6. 6. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la misura ottica che viene effettuata à ̈ di tipo nefelometrico basata su tecnologia di lightscattering.
7. 7. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la misura ottica effettuata mediante la macchina di misura ottica (32) Ã ̈ di tipo cinetico con temporizzazione fissa, basate su tecnologica di lightscattering, per determinare la presenza di eventuali crescite batteriche, e successivamente, tramite analisi dei segnali, evidenziare le curve di crescita batterica.
8. 8. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il secondo contenitore (30) Ã ̈ del tipo a provetta in materiale trasparente a radiazioni elettromagnetiche d'onda definite.
9. 9. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il secondo contenitore (30) con il terreno di col tura inoculato, ed alloggiato nella macchina di misura ottica (32), coopera con un dispositivo di termostatazione (40) ed almeno temporalmente con un gruppo agitatore (43) per essere sottoposto a termostatazione e miscelazione continua, per favorire le eventuali crescite dei microorganismi presenti nella parte liquida, o plasma, (26).
10. 10. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto secondo contenitore (30) coopera, inoltre, con un dispositivo di focalizzazione e collimazione (46) ed un dispositivo di rilevazione (48), il dispositivo di focalizzazione e collimazione (46) essendo atto ad emettere una radiazione d'onda elettromagnetica definita, con proprio asse di emissione (X), che viene trasmessa attraverso il campione, in cui la radiazione d'onda elettromagnetica viene deviata dai batteri presenti nel campione con un'intensità dipendente dal loro numero e dalla loro morfologia, essendo tale radiazione deviata rilevata in successione con cadenze volute dal dispositivo di rilevazione (48) con conseguente costruzione di una curva di crescita batterica, detta curva di crescita venendo confrontata da un'unità di elaborazione (38) con valori di riferimento compresi in una banca dati (39) dell'unità di elaborazione (38) per quantificare la carica batterica e per identificare le specie batteriche in base al confronto con curve di crescita ottenute dalla banca dati (39).
11. 11. Procedimento come nella rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che la curva che rappresenta la crescita dei batteri in funzione del tempo à ̈ espressa in forma analitica secondo la formula CB=Ae<K>n<(t'>V C, dove CBrappresenta l'intensità della radiazione deviata, A e C sono costanti dipendenti rispettivamente dalla specie batterica in esame e dalla concentrazione iniziale, Knà ̈ un parametro che tiene conto dell'angolo di posizionamento del rilevatore, t à ̈ il tempo e t0à ̈ un ritardo legato al numero di batteri presenti nel campione.
12. 12. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che, nella seconda fase, Ã ̈ prevista l'aggiunta di un anticoagulante nel primo contenitore (14), e la sua successiva agitazione per evitare la coagulazione del campione stesso.
13. 13. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che nella seconda fase si realizza una lisi dei globuli rossi del campione (12), con lo scopo di liberare e quindi misurare batteri eventualmente presenti all'interno dei globuli rossi, mediante un mezzo lisante previsto o immesso nel primo contenitore (14)
14. 14. Procedimento per l'indagine batteriologica su plasma, caratterizzato dal fatto che comprende le seguenti fasi: - una prima fase in cui si effettua il prelievo di un campione ematico (12) da un paziente; - una seconda fase in cui si dispensa il campione ematico (12) in un primo contenitore (14), contenente un mezzo lisante, al fine di ottenere una lisi dei globuli rossi, con lo scopo di liberare e quindi misurare batteri eventualmente presenti all'interno dei globuli rossi; - una terza fase in cui si determina la sedimentazione delle emazie U sate presenti nel campione ematico (12), in modo da separare la parte corpuscolare (24), che sedimenta sul fondo del primo contenitore (14), dalla parte liquida, o plasma (26) che rappresenta il surnatante; - una quarta fase in cui si preleva una determinata porzione del surnatante, costituito della parte liquida, o plasma (26), così ottenuto; - una quinta fase in cui si inocula la porzione della parte liquida, o plasma, (26) ottenuta in un terreno di coltura liquido, all'interno di un secondo contenitore (30) predisposto per consentire una coltura batterica ed una lettura strumentale mediante una macchina di misura ottica (32); - una sesta fase in cui si consente la crescita batterica nel terreno di coltura contenuto nel secondo contenitore (30); - una settima fase in cui, mediante la macchina di misura ottica (32), sul terreno di coltura contenuto nel secondo contenitore (30) si effettua una misura ottica per determinare la presenza di batteri e microrganismi.
15. 15. Procedimento come nella rivendicazione 13 o 14, caratterizzato dal fatto che l'analisi à ̈ mirata alla ricerca extracellulare ed intracellulare dei globuli rossi, di batteri e microrganismi, aerobi, microaerofili o capnofili, presenti nella parte liquida, o plasma, (26).
16. 16. Apparecchiatura per l'indagine batteriologica su plasma, caratterizzata dal fatto che comprende un'unità di sedimentazione (29) di un campione ematico (12), prelevato da un paziente e contenuto in un primo contenitore (14), in modo da separare la parte corpuscolare (24) del campione ematico (12), che sedimenta sul fondo del primo contenitore (14), dalla parte liquida, ottenendo il plasma, (26) che rappresenta il surnatante, mezzi (28) di prelievo per prelevare una determinata porzione del surnatante, costituito della parte liquida, o plasma (26), così ottenuta, e di inoculo per inoculare la porzione della parte liquida, o plasma, (26) ottenuta in un terreno di coltura in stato liquido, all'interno di un secondo contenitore (30) predisposto per consentire una coltura batterica ed una lettura strumentale di tipo ottico, il terreno di coltura essendo atto a consentire la crescita batterica nel secondo contenitore (30), mezzi di misura ottica (32), per effettuare una misura ottica sul terreno di coltura contenuto nel secondo contenitore (30) per determinare la presenza di batteri e microrganismi e mezzi di elaborazione (38) comprendenti una banca dati (39), per raccogliere i dati della misura ottica, costruire una curva che rappresenta l'intensità della radiazione deviata dal terreno di coltura nella misura ottica, rispetto al tempo, i cui parametri vengono confrontati con valori di riferimento contenuti nella banca dati (39), per la determinazione dei parametri tipici di analisi, detti valori essendo caratteristici per ciascuna specie batterica.
17. 17. Apparecchiatura come nella rivendicazione 16, caratterizzata dal fatto che il secondo contenitore (30) Ã ̈ del tipo a provetta in materiale trasparente a radiazioni elettromagnetiche d'onda definite.
18. 18. Apparecchiatura come nella rivendicazione 16 o 17, caratterizzata dal fatto che comprende un dispositivo di termostatazione (40) ed un gruppo agitatore (43) atti a cooperare con il secondo contenitore (30).
19. 19. Apparecchiatura come nella rivendicazione 16, 17 o 18, caratterizzata dal fatto che comprende un dispositivo di focalizzazione e collimazione (46) ed un dispositivo di rilevazione (48) atti a cooperare con il secondo contenitore (30), il dispositivo di focalizzazione e collimazione (46) essendo atto ad emettere una radiazione d'onda elettromagnetica definita, con proprio asse di emissione (X), che viene trasmessa attraverso il campione, in cui la radiazione d'onda elettromagnetica viene deviata dai batteri presenti nel campione con un'intensità dipendente dal loro numero e dalla loro morfologia, essendo tale radiazione deviata rilevata in successione con cadenze volute dal dispositivo di rilevazione (48) con conseguente costruzione di una curva di crescita batterica, e che comprende, inoltre, un'unità di elaborazione (38) con una banca dati (39) avente valori di riferimento, mediante la quale confrontare detta curva di crescita per quantificare la carica batterica e per identificare le specie batteriche in base al confronto con curve di crescita ottenute dalla banca dati ( 39 ) .
20. 20. Procedimento per l'indagine batteriologica su plasma, sostanzialmente come descritto, con riferimento agli annessi disegni.