CN111455017A - 一种食品微生物菌落总数测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品微生物菌落总数测定方法，属于食品微生物学检验领域。本发明包括以下步骤：食品样品取样预处理；按照要求梯度稀释样品至接种管；将接种管进行恒温培养；然后利用激光光谱技术，以微生物新陈代谢产物CO₂变化率作为阴阳性鉴定对象，使用探测组件测定每个接种管的培养液上方气体区域的CO₂变化率，计算机根据变化率与设定值的比较结果，判断每个接种管的阴阳性，通过MPN法计算出微生物菌落总数。利用本发明方法对食品样品微生物菌落总数进行测定，能够完全消除死亡微生物对菌落总数测定的干扰，检测结论实用性更强，而且无需专业人员操作，同时检测时间大大缩短。

Description

一种食品微生物菌落总数测定方法

技术领域

本发明涉及食品微生物学检验领域，更具体地说，涉及食品微生物菌落作为食品受污染程度标志物的总数的测定。

背景技术

食品是人类生命和健康所需要的能量源，与人类的生存和发展有着密不可分的关系。随着我国社会经济的发展，人们生活水平的提高，食品安全问题也备受关注。

食品中的菌落总数可以反映食品、食品原材料被细菌污染程度以及食品生产过程中的卫生管理状况，并可推断出食品的新鲜度和耐贮存性。食品中的菌落总数是一个总体评价的指标，可以用于生产、存储、运输等环节的管理。

对食品中菌落总数的测定，国标方法是采用平板计数琼脂倾注培养法。该方法需要配制培养基，主要缺点有：消毒清洗，工作量大，操作过程复杂，需要专业人员检测操作。从采集样品，微生物细胞稀释、涂布、培养到取得结果至少需要24-48小时，因此，难以进行实时有效的监测，而且菌落易与样品残渣微粒混淆，导致菌落计数不准确，会出现假阴性结果。

目前市场上应用最广的是测试片，其通过细胞代谢产物与上层的指示剂TTC发生氧化还原反应从而使细菌着色的。主要有3M测试片和LZ测试片。3M测试片加样的时候需要用压板压一下来定位菌落生长区域，操作时易造成样品液溢出或者压出的生长区域不标准，从而使检验结果产生误差，还有一些样品液在培养过程中会产生一些可溶性物质，使测试片上的凝胶液化，使菌点变成晕斑状，无法计数。LZ测试片的中央有一层无纺布，有些样品的细菌会生长在无纺布下面，从而影响计数的准确性。

为了解决计数不准确的问题，近年来遗传分子分析方法也得到了广泛的应用。这些方法包括DNA/DNA杂化、rRNA(核糖体RNA)序列分析、使用与rRNA或其他靶基因互补的寡核苷酸探针、核型化和聚合酶链反应。这些方法的缺点是过程繁琐，需要高度专业化的人员操作复杂的设备。

上述的各种检测方法缺陷：需要专业人员操作、检测时间长，无法排除死亡微生物的干扰，检测结论实用性差。

发明内容

本发明旨在提供一种食品微生物菌落总数测定方法，以解决现有食品微生物菌落测定方法存在的专业性强、检测时间长、结论实用性差等问题。

本发明利用激光光谱技术，以微生物新陈代谢产物CO₂的浓度作为阴阳性鉴定对象，使用特定波长的激光穿过接种管的培养液上方气体区域，并由光电探测器接收，该区域的CO₂具有累积效应，且接种管内部的样本浓度相差10倍，然后光电探测器输出电压值，计算机判断每个接种管的阴阳性，根据MPN法计算出微生物菌落总数。

本发明具体是：

取a ml(g)待测样品置于试管中，所述待测样品为食品，试管中加入(d*a-a)(d为10的整数倍)ml生理盐水，均质得到样品匀液。

从所述的样品匀液中取出a ml接种至培养平台工位上第一列的第一个接种管内，重复n_i(i＝1,2,3…)(n_i>3)次。所述的接种管内放有(9*a)ml培养液，内含有磁搅拌子，所述的磁搅拌子通过搅拌，获得稀释液与培养液混合均匀的第一列共n_i个接种管。

从所述的第一列接种管内依次取出a ml混合液接种至培养平台工位上第二列的第一个接种管内，重复n_i(i＝1,2,3…)(n_i>3)次，获得稀释液与培养液混合均匀的第二列共n_i个接种管。

重复接种操作至第t列，获得(t*n_i)个接种管。

所述的(t*n_i)个接种管在培养平台的工位上进行36℃恒温培养，获得代谢产物CO₂。所述的工位下有微型电机，电机上装有磁铁盘，磁铁盘可以吸引磁搅拌子。

利用探测组件测定所述的(t*n_i)个接种管的培养液上方气体区域的CO₂变化率，根据变化率，确定每个接种管的阴阳性。

所述的探测组件可以直线行走，两侧安装有可以发出2008nm波长激光器的光纤探头和光电探测器，在预设时间T_i(由食品种类决定)内对每个接种管按顺序进行循环检测，将每个接种管最后一次的阴阳性判定结果记为R_i。

所述的阴阳性判定结果R_i的确定方法为：将CO₂变化率与设定值进行比较，高于设定值，判定该接种管为阳性，低于设定值，则判定该接种管为阴性。

根据所述的(t*n_i)个接种管的阴阳性判定结果R_i、每个R_i对应的稀释度、每个稀释度下的重复数n_i(i＝1,2,3…)、接种管内总体积(10*a)ml，利用MPN法计算出待测样品微生物活菌总数。

与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：

本发明将微生物新陈代谢产物CO₂累积至接种管的培养液上方气体区域，该区域的CO₂具有累积效应，敏感性高，大大缩短了阴阳性鉴定时间，解决了目前检测时间长的问题。检测速度的提高，对检测效率以及保质期短的食品检测具有非常重要的意义。

本发明以微生物新陈代谢产物CO₂的浓度作为阴阳性鉴定对象，避免了死亡微生物的干扰，增加了检测的准确性。

本发明在整个检测过程中只有预处理需要人工操作，其余步骤全部自动化，直接等待结果输出，减少了操作的复杂性。

附图说明

将参照附图结合在下面的具体实施方式与权利要求更加详细地描述本发明。在附图中，相同的标记始终表示相同的特征，其中：

图1是本发明的食品微生物菌落总数测定方法结构图；

图2是本发明的食品微生物菌落总数测定方法工作流程图；

图3是本发明的食品微生物菌落总数测定方法中的培养平台结构图；

图4是本发明的食品微生物菌落总数测定方法中的探测组件结构图。

具体实施方式

本发明所使用的检测装置主要包括培养平台、探测组件、中央控制板等。

所述的中央控制板采用PLC工控板，它起到控制步进电机、微型电机、激光器光纤探头的作用，产生控制信号对相应部件控制，并执行相应操作，对每个接种管最后一次的检测结果进行存储和运算。

所述的培养平台上面均匀分布着30(6*5)个工位，每个工位被保持为36℃恒温状态，压力传感器嵌入其中，压力传感器检测到有接种管存放时，PLC工控板输出驱动信号驱动工位下的微型电机，电机上装有磁铁盘，将吸引接种管内的磁搅拌子转动，使得稀释液与培养液充分混合。

所述的探测组件包括底部的探测部分和上部的行走组件，探测部分的激光器光纤探头和光电探测器固定于行走部分上不动，中间为接种管，行走部分与步进电机相连，PLC工控板输出驱动信号驱动步进电机，探测组件完成对培养平台上所有接种管的检测。

参照图1，按照本发明方法制备的食品微生物菌落总数测定装置，实现了食品微生物菌落总数测定，具体的说，是实现了对未加工的原奶的微生物菌落总数测定。

取2.5ml(g)未加工的原奶置于试管中，试管中加入247.5ml生理盐水，均质得到样品匀液。

从所述的样品匀液中取出2.5ml接种至培养平台工位上第一列的第一个接种管内，重复5次。所述的接种管内放有22.5ml培养液，内含有磁搅拌子，所述的磁搅拌子通过搅拌，获得稀释液与培养液混合均匀的第一列接种管。

从所述的第一列接种管内依次取出2.5混合液接种至培养平台工位上第二列的第一个接种管内，重复5次，获得稀释液与培养液混合均匀的第二列接种管。

重复接种操作至第6列，获得(6*5)个接种管。

所述的(6*5)个接种管在培养平台的工位上进行36℃恒温培养，获得代谢产物CO₂。所述的工位下有微型电机，电机上装有磁铁盘，磁铁盘可以吸引磁搅拌子。

所述的(6*5)个接种管在培养平台101上进行36℃恒温培养，然后通过探测组件102依次对培养平台101上每个接种管进行循环检测，利用探测组件测定(6*5)个接种管的培养液上方气体区域的CO₂变化率，将CO₂变化率与设定值进行比较，高于设定值，判定该接种管为阳性，低于设定值，则判定该接种管为阴性。检测结果如下表所示，并存储在中央控制板103上：

稀释度	10<sup>-3</sup>	10<sup>-4</sup>	10<sup>-5</sup>	10<sup>-6</sup>	10<sup>-7</sup>	10<sup>-8</sup>
							每组管数	5	5	5	5	5	5
有微生物菌落	5	5	5	4	1	0

进一步，中央控制板103对以上已存储结果进行运算，根据MPN法计算出未加工的原奶含微生物活菌总数为680000个/ml。

图2是检测方法工作流程图，接种管的存储由S1表示，S2表示接种管内对培养液的搅拌，S3表示的开始检测由中央控制板103设置，随后由中央控制板103执行的操作是：向探测组件102发出指令，用步进电机121带动滑轨122，使得用A1所示的激光器光纤探头123发出激光穿过接种管111的培养液上方气体区域，用A2表示的光电探测器124接收光信号，A3表示CO₂变化率，A3与A4表示的设定值进行比较，A5表示将CO₂变化率比较结果传达给中央控制板103，在预设时间8小时内对每个接种管进行循环检测，中央控制板103存储结果，最后保存每个接种管最后一次的检测结果。

A6是根据中央控制板103保存的检测结果进行运算，对待测样品的菌落总数进行确认，最后由操作A7得到结果，A6和A7均设置在中央控制板103上。

图3是培养平台结构图，压力传感器112检测到工位111有接种管存放，输给中央控制板103的A/D处理，微型电机113接收指令带动磁铁盘114转动，接种管内的磁搅拌子被吸引随之转动，达到103设置的时间后停止。

图4是探测组件结构图，激光器的光纤探头123和光电探测器124安装在滑轨122上，由步进电机121带动滑轨122在培养平台101上移动，分别对(6*5)个接种管111进行检测。

综上，本发明提供一种食品微生物菌落总数测定方法，利用激光光谱技术判断样本接种管的阴阳性，从而根据统计法计算微生物菌落总数。该方法无需专业人员操作、检测时间可大大缩短，而且消除了死亡微生物对菌落总数测定的干扰，使得检测结论实用性更强。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质的情况下，可以做出各种改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种食品微生物菌落总数测定方法，其特征在于：

食品样品取样预处理，按照要求梯度稀释样品至接种管，将接种管进行恒温培养，然后利用激光光谱技术，以微生物新陈代谢产物CO₂变化率作为阴阳性鉴定对象，使用探测组件测定每个接种管的培养液上方气体区域的CO₂变化率，计算机根据变化率与设定值的比较结果，判断每个接种管的阴阳性，通过MPN法计算出微生物菌落总数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食品样品取样预处理具体是：

取a ml待测样品置于试管中，所述待测样品为食品，试管中加入(d*a-a)ml生理盐水，均质得到样品匀液，其中d为10的整数倍。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述按照要求梯度稀释样品至接种管，具体是：

从所述的样品匀液中取出a ml接种至培养平台工位上第一列的第一个接种管内，重复n_i(i＝1,2,3…)(n_i>3)次，获得第一列共n_i个接种管；

从所述的第一列接种管内依次取出a ml混合液接种至培养平台工位上第二列的第一个接种管内，重复n_i(i＝1,2,3…)(n_i>3)次，获得第二列共n_i个接种管；

重复接种操作至第t列，获得(t*n_i)个接种管。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温培养具体是：

接种管在培养平台的工位上进行36℃恒温培养，获得代谢产物CO₂。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探测组件可直线行走，且两侧安装有可以发出特定波长激光器的光纤探头和光电探测器，在预设时间T_i内对每个接种管按顺序进行循环检测。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴阳性判定具体是：将CO₂变化率与设定值进行比较，高于设定值，判定该接种管为阳性，低于设定值，则判定该接种管为阴性。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的接种管内放有(9*a)ml培养液，其内部含有磁搅拌子，且磁搅拌子通过搅拌，获得稀释液与培养液混合均匀的接种管。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的从第一列接种管内依次取出并接种至第二列的混合液，具体是指稀释液与培养液在经过磁搅拌子搅拌后混合均匀的混合液。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的工位下有微型电机，电机上装有磁铁盘，磁铁盘可以吸引磁搅拌子。

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