CN109777856A - 一种一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种一万亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，它包括将待测样品用稀释液分散、稀释后在营养琼脂培养基上进行培养，统计平板上的菌落数并计算待测样品中活菌数量的步骤，本发明采用磷酸盐缓冲液为稀释液，同时加入蛋白胨，可以使样品有一个更稳定的分散环境，另外还改进了样品的前处理方法和营养琼脂培养基组分，从而实现了高含量枯草芽胞杆菌原粉芽胞数的检测。该方法可以准确的检测出产品中活芽胞的数量，同时还具有检测重复性好、偏差小等优点，有利于减少检测次数，降低检测成本。

Description

一种一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测 方法

技术领域

本发明涉及一种一万亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，属于微生物检测领域。

背景技术

枯草芽胞杆菌不仅在饲料中应用广泛，在生物农药、生物肥料、水产养殖、污水治理等方面的应用也越来越多，是一种多功能的有益微生物。随着对枯草芽孢杆菌的研究不断深入，市场对枯草芽孢杆菌的产品质量要求越来越高，常规的低含量产品(3000-5000亿cfu/g)已不能满足市场的需求。为了提高竞争力，我们对枯草芽胞杆菌从发酵到后处理进行一系列的改进，大大提高了产品的质量，原药水平达到一万亿cfu/g以上，达到了国际领先水平。

而衡量产品的质量标准主要是含有活菌数量及目的微生物的纯度。CN101586144A公开了一种5000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，采用平板计数法：取一定量的菌剂与含有吐温80的生理盐水混合，分散后进行系列稀释，然后涂布平板后进行培养，统计平板上的单菌落数，计算菌剂中的活菌数量。但采用该方法对一万亿枯草芽孢杆菌的同一批次产品进行多次检测，发现各结果之间差异特别大，结果在8500-10000亿之间，给检测工作造成了很大的麻烦，只能通过多做重复取其平均值，从而大大增加了检测成本。我们对样品进行涂片镜检，发现芽孢有聚团现象，说明现有的检测方法不能很好的将芽孢分散。

由于高含量枯草芽胞杆菌原药芽胞高度粘结与集聚，孢子难分散，用现有的生物检测方法检测高含量枯草芽孢杆菌原药结果误差大，重复性低，因此，很有必要建立一种准确、快速地检测高含量枯草芽胞杆菌的方法。

发明内容

本发明的目的是提供了一种一万亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，旨在提高枯草芽胞杆菌原粉尤其是高含量原粉的检测准确性。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，包括将待测样品用稀释液分散、稀释后在营养琼脂培养基上进行培养，统计平板上的菌落数并计算待测样品中活菌数量的步骤，其中，所述稀释液为：蛋白胨0.5-2g，吐温80 0.05-0.2mL，蒸馏水500-1500mL，用磷酸盐缓冲溶液调节pH为6.5-7.5。

优选地，所述稀释液为：蛋白胨1.2g，吐温80 0.1mL，蒸馏水1000mL，用磷酸盐缓冲溶液调节pH为7。

优选地，所述待测样品的分散、稀释方法是：取1g待测样品，用稀释液定容至100ml，先磁力搅拌10min，然后70℃水浴30min，水浴后迅速置于冰水浴中冷却，然后超声2次，每次10min，最后再磁力搅拌10min，得待测样品预处理液；将待测样品预处理液用稀释液稀释并超声3min使孢子分散，得涂布液。

进一步优选地，每ml所述涂布液中含有1.0×10-⁹g待测样品。

优选地，所述营养琼脂培养基为：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH 6.5-7.5。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

活芽胞检测作为常规的微生物学技术，它是衡量细胞生物量和产率的重要手段。针对高含量枯草芽胞杆菌原粉制剂(一万亿cfu/g)不易检测的难点，如针对枯草芽胞杆菌原粉制剂中芽胞的高度粘结与集聚，导致不易分散，以及不同的稀释液、不同的培养基对检测的准确性和稳定性都有很大影响等问题，本发明采用磷酸盐缓冲液为稀释液，同时加入蛋白胨，可以使样品有一个更稳定的分散环境，另外还改进了样品的前处理方法和营养琼脂培养基组分，从而实现了高含量枯草芽胞杆菌原粉芽胞数的检测。该方法可以准确的检测出产品中活芽胞的数量，同时该方法还具有检测重复性好、偏差小等优点，有利于减少检测次数，降低检测成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1

以科诺公司生产的一万亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉为例，检测其活芽孢数。

1.检测方法与结果

第一步：试剂及培养基的配制：

(1)配制稀释液：蛋白胨1.2g，吐温80 0.1mL，蒸馏水1000mL，用磷酸盐缓冲溶液调节pH为7.0，加热充分溶解后121℃高压蒸汽灭菌30min。

(2)配制营养琼脂培养基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0、121℃灭菌30min。

(3)制备平板：营养琼脂培养基灭菌后冷却至48-52℃时，倒平板，待平板培养基凝固后，用灭菌好的牛皮纸包好，倒置放在37℃恒温培养箱中培养1-2天。

第二步：样品的预处理：

(1)称取同一批次的待测样品两份，样品1质量为1.0171g、样品2质量为0.9978g，将两份样品分别放入带磁力搅拌转子的250ml无菌蓝口瓶中，各加入稀释液定容至100ml，盖上瓶盖，将蓝口瓶置于磁力搅拌器上搅拌10min。

(2)搅拌后将两份样品置于恒温水浴锅70℃水浴30min，恒温水浴后迅速置于冰水浴中冷却。

(3)冰水浴降温后，将样品用超声波细胞粉碎机超声。将搅拌探头插入样品液面下1.5mm，超声10min，停止后放入冰水浴中冷却2分钟，然后再超声10min。

(4)将样品放置于磁力搅拌器上搅拌10min，得待测样品预处理液。

第三步：样品的稀释：

(1)向无菌试管中分别加入4.5mL稀释液，试管上标记样品号和稀释倍数的字样，操作在超净工作台中进行。

(2)十倍稀释法吸取0.5ml样品到装有4.5ml稀释液的试管中，此样品浓度为1.0x10^-3 g/ml。使用震荡器混合10s，再以十倍稀释法将样品稀释到1.0x10^-9。

(3)将浓度为1.0x10^-9的试管放置于试管架上，用超声波清洗器超声3min，分散孢子，得涂布液。

第四步：样品涂布及培养：

吸取涂布液0.1ml于干燥无污染的营养琼脂平板表面，四次重复，用无菌涂棒在平板上将样品涂布均匀，四个平板用一支涂棒，中途不换涂棒，也不灼烧涂棒。

涂布完成后，将其放在37℃恒温培养箱中24hr。

第五步：计数

(1)培养后，统计平板上的菌落数，计算试样中的活菌数量。

(2)小于30个或大于300个菌落的平板不计数。

(3)计算

其中：M＝在适宜菌落数范围内的平板的菌落数之和，单位为cfu

N＝在适宜菌落数范围内的平板数

m＝试样的称样量，单位为g

10¹⁰＝稀释倍数。

检测结果见表1。

表1两次平行检测的结果

2.方法重复性考查

为了验证本方法的重复性，对同一批10000亿原粉进行10次重复测定，实验结果如表2 所示。从结果可以看出，10次结果的变异系数为2.12％，方法重复性好。

表2同一批次10000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉的10次检测结果

对比例：

采用CN101586144A报导的方法检测上述样品，检测10次，结果见表3。

表3采用CN101586144A中的稀释液对10000亿原粉的10次检测结果

综合表2、表3来看，本发明与现有方法相比不仅检测出的活芽孢数更高，能更真实的反映样品的质量情况，而且相对偏差和变异系数更小，从而能减少检测次数，降低检测成本。

Claims (5)

1.一种一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，包括将待测样品用稀释液分散、稀释后在营养琼脂培养基上进行培养，统计平板上的菌落数并计算待测样品中活菌数量的步骤，其特征在于，所述稀释液为：蛋白胨0.5-2g，吐温80 0.05-0.2mL，蒸馏水500-1500mL，用磷酸盐缓冲溶液调节pH为6.5-7.5。

2.如权利要求1所述一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，其特征在于，所述稀释液为：蛋白胨1.2g，吐温80 0.1mL，蒸馏水1000mL，用磷酸盐缓冲溶液调节pH为7。

3.如权利要求1或2所述一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，其特征在于，所述待测样品的分散、稀释方法是：取1g待测样品，用稀释液定容至100ml，先磁力搅拌10min，然后70℃水浴30min，水浴后迅速置于冰水浴中冷却，然后超声2次，每次10min，最后再磁力搅拌10min，得待测样品预处理液；将待测样品预处理液用稀释液稀释并超声3min使孢子分散，得涂布液。

4.如权利要求3所述一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，其特征在于：每ml所述涂布液中含有1.0×10^-9g待测样品。

5.如权利要求1所述一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，其特征在于，所述营养琼脂培养基为：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH 6.5-7.5。