CN108398496A - 一种天然产物抗菌活性测定方法 - Google Patents

一种天然产物抗菌活性测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108398496A
CN108398496A CN201810133217.8A CN201810133217A CN108398496A CN 108398496 A CN108398496 A CN 108398496A CN 201810133217 A CN201810133217 A CN 201810133217A CN 108398496 A CN108398496 A CN 108398496A
Authority
CN
China
Prior art keywords
natural products
antibacterial activity
determination
concentration
bacterial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810133217.8A
Other languages
English (en)
Inventor
张春云
郭明全
李梦辉
柴欣生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Botanical Garden of CAS
Original Assignee
Wuhan Botanical Garden of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Botanical Garden of CAS filed Critical Wuhan Botanical Garden of CAS
Priority to CN201810133217.8A priority Critical patent/CN108398496A/zh
Publication of CN108398496A publication Critical patent/CN108398496A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种天然产物抗菌活性测定方法，将一定浓度的适量细菌菌液与一定浓度的天然药物在顶空样品瓶中共存培养作为实验组，将相同浓度的等量细菌菌液在顶空样品瓶单独培养作为对照组，培养一定时间后，利用顶空气相色谱仪将实验组和对照组样品瓶顶部空间产生的CO2的含量进行原位测量，通过CO2色谱峰面积计算药物对细菌生长的抑制率以及半数抑制浓度；实现天然产物抗菌活性安全、简便、准确测定；且可测定不溶物或固体粉末的抗菌活性。

Description

一种天然产物抗菌活性测定方法
技术领域
本发明属于分析化学及药理学技术领域，具体涉及一种天然产物抗菌活性测定方法。
背景技术
抗菌药物是治疗细菌性感染的特殊药物，抗菌药物可以治疗细菌性感染，同时在一些特定条件下也用于预防某些细菌性感染。自1935年第一个磺胺药应用于临床和1941年青霉素问世以来，抗菌药物因其独特的临床应用价值而得到了迅速的发展和广泛的应用。从我国临床调查结果显示，医疗机构住院患者抗菌药物应用的比例在70％左右，门诊患者抗菌药物应用比例也高达20％。因此，随着我国经济社会发展，以及现有抗菌药物耐药性问题越来越严重，从天然产物中获取抗菌活性强、细菌耐药性弱的新型抗菌药物一直是天然产物化学研究的重要方向。然而，天然产物种类繁多，化学成分复杂，对天然产物提取物及分离得到的化合物进行抗菌活性测定及活性筛选无疑是天然抗菌药物发现的重要环节。
相关技术中，利用液体培养基测定天然产物抗菌活性的测定方法为浊度法，所述浊度法是将天然产物和细菌在液体培养基上共存培养后，利用分光光度计测定细菌生长菌落产生的浊度来反应抗菌活性。
但发明人发现浊度法测定过程中被测天然产物本身的浊度对测试结果干扰较大，且无法对中药材不溶物甚至固体粉末进行抗菌活性测试，且当天然产物活性较大，测试液浊度较低时，浊度法响应不线性、不灵敏。
发明内容
有鉴于此，本发明的实施例提供了一种不需要测定浊度、天然产物本身对测试结果无影响，测试精度高，响应范围广，且可测定不溶物或固体粉末的抗菌活性的测定方法。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用的技术方案是，一种天然产物抗菌活性测定方法，通过顶空气相色谱法(HS-GC)测定天然产物与细菌菌液共存培养过程中产生的CO2含量，根据得到的CO2含量计算天然产物对细菌生长的抑制率和半数抑制浓度。
优选地，所述一种天然产物抗菌活性测定方法，具体包括以下步骤：
(1)确定细菌的培养时间、温度及浓度；
(2)取适量已知浓度的细菌菌液与适量的天然产物在灭菌后的顶空样品瓶中共存，在上述时间、温度下作为实验组培养；
(3)取与步骤(2)等量的已知浓度的细菌菌液于灭菌后顶空样品瓶中，在上述时间、温度下作为对照组培养；
(4)设置顶空进样器操作条件及气相色谱仪操作条件，将培养后的所述实验组和对照组的顶空样品瓶置于顶空进样器中，进行顶空气相色谱分析，采集CO2色谱峰信息；
(5)根据采集的CO2色谱峰信息积分CO2色谱峰面积，根据所述CO2色谱峰面积计算得到天然产物对细菌生长的抑制率；
(6)采用不同浓度梯度的天然产物重复步骤(1)、(2)、(3)、(4)，采集不同浓度的天然产物与细菌作用产生的CO2色谱峰信息积分CO2色谱峰面积，根据所述CO2色谱峰面积计算不同浓度天然产物对细菌生长的抑制率，并计算得到天然产物对细菌生长的半数抑制浓度。
优选地，取适量的细菌在灭菌后的顶空样品瓶中，一定温度下培养不同时间后置于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定培养时间。
优选地，取适量不同浓度的细菌菌液分别与适量的天然产物于灭菌后的顶空样品瓶中，在所述温度下振荡培养上述确定的时间，于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定细菌菌液浓度。
优选地，所述天然产物包括动植物、海洋生物、微生物的提取物及以提取物为基础的药物制品。
优选地，所述细菌菌液为正常培养代谢可产生CO2的菌种菌液。
优选地，所述的天然产物抗菌活性测定方法可应用于合成药物的抗菌活性测定。
与相关技术比较，本发明实施例提供的技术方案的有益效果是，本发明的天然产物抗菌活性测定方法，通过顶空气相色谱法测定天然产物与相关菌种菌液共存培养过程中产生的CO2含量计算天然产物对细菌生长的抑制率和半数抑制浓度。方法操作简单，方法相对标准偏差在5％以内，重复性好，精度高；天然产物本身的浊度对测试结果无影响，可对中药材不溶物甚至固体粉末进行抗菌活性的测试；可适用的测定抗菌活性响应范围广。
附图说明
图1是本发明实施例的测定方法过程示意图；
图2是本发明实施例的测定方法流程示意图；
图3是本发明实施例的测定方法得到的抑制率与传统方法(浊度法)得到的抑制率对比示意图；
图4是本发明实施例的测定方法得到的半数抑制浓度与传统方法(浊度法)得到的半数抑制浓度(IC50)对比示意图；
图5是本发明实施例确定金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和沙门氏菌(革兰氏阴性菌)培养时间示意图；
图6是本发明实施例确定金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和沙门氏菌(革兰氏阴性菌)的菌液浓度示意图；
图7是本发明实施例测定方法测定的氯霉素对金黄色葡萄球菌的抗菌抑制率示意图；
图8是本发明实施例测定方法测定的十树樟提取物对沙门氏菌的抗菌抑制率示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
实施例一
参照附图1，本发明的实施例提供了一种天然产物抗菌活性测定方法，通过顶空气相色谱法测定天然产物与细菌菌液共存培养过程中产生的CO2含量，根据得到的CO2含量计算天然产物对细菌生长的抑制率和半数抑制浓度。不需要测定细菌生长的菌落产生的浊度，天然产物本身的浊度对测定的抑制率和半数抑制浓度不影响，测定方法简单，精度和活性响应范围广。
参照附图2，进一步地，所述一种天然产物抗菌活性测定方法，具体包括以下步骤：
(1)确定细菌菌液的培养时间、温度及浓度；
具体地，取适量的细菌在灭菌后的顶空样品瓶中，一定温度下培养不同时间后置于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定培养时间；得到足够的CO2检测灵敏度和充分的药物和细菌作用时间；
另取适量不同浓度的细菌菌液分别与适量的天然产物于灭菌后的顶空样品瓶中，在所述温度下振荡培养确定的时间，于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定细菌菌液浓度；
(2)取适量已知浓度的细菌菌液与适量的天然产物在灭菌后的顶空样品瓶中共存，在上述温度和时间下作为实验组培养；在上述确定的温度条件下振荡培养，确保细菌菌液与天然产物之间可充分接触反应以及得到足够的CO2检测灵敏度；所述细菌菌液为正常培养代谢可产生CO2的菌种菌液；所述天然产物为动植物、海洋生物、微生物的提取天然产物及以提取的所述天然产物为基础的药物制品；
(3)取与实验组等量的已知浓度的细菌菌液于灭菌后顶空样品瓶中，在上述温度和时间下作为对照组培养；与实验组在相同条件下培养作为对照组便于得到无药物作用时细菌正常代谢的CO2含量；
(4)设置顶空进样器操作条件及气相色谱仪操作条件，将培养后的所述实验组和对照组的顶空样品瓶置于顶空进样器中，进行顶空气相色谱分析，采集CO2色谱峰信息；
(5)根据采集的CO2色谱峰信息积分CO2色谱峰面积，根据所述CO2色谱峰面积计算得到天然产物对细菌生长的抑制率；
(6)采用不同浓度梯度的天然产物重复步骤(1)、(2)、(3)、(4)，采集不同浓度的天然产物与细菌作用产生的CO2色谱峰信息计算CO2色谱峰面积，根据所述CO2色谱峰面积计算不同浓度天然产物对细菌生长的抑制率，从而计算得到天然产物对细菌生长的半数抑制浓度。测定方法流程简单，天然产物本身状态及在培养基中的浊度对CO2的信号无影响，测定结果精确，可有效进行天然产物抗菌活性筛选，对天然产物资源活性评价具有重大意义。
进一步地，本发明实施例的天然产物抗菌活性测定方法还可应用于合成药物的抗菌活性测定。
参照附图3、4，本发明实施例的方法测定的抗菌活性抑制率、半数抑制浓度与传统方法(浊度)得到的抑制率和半数抑制浓度结果相一致。
实施例二
参照附图5、6、7、8，采用本发明实施例一的天然产物抗菌活性测定方法分别进行氯霉素对金黄色葡萄球菌、十树樟提取物对沙门氏菌的抗菌活性进行测定；具体包括以下步骤：
(1)分别取2mL浓度为108cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液、沙门氏菌在灭菌的顶空样品瓶中，37℃振荡(80rpm)培养不同时间后，于顶空气相色谱仪中检测，测定CO2的信号确定培养时间为24h；
(2)取金黄色葡萄球菌菌液、沙门氏菌菌液于含有100μg/mL四环素的LB培养基中，确保菌液浓度范围为106～109cfu/mL，且顶空样品瓶中液体总体积为2mL，在37℃振荡培养24h，然后于顶空气相色谱仪中检测，测定CO2的信号确定金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的最优浓度为108cfu/mL；
(3)取108cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液于一系列含有不同浓度氯霉素的LB培养基的顶空样品瓶中，氯霉素最终浓度分别为0,2,5,10,15,20,50,100μg/mL，顶空样品瓶培养液体体积2mL；取108cfu/mL的沙门氏菌菌液于一系列含有不同浓度十树樟提取物的LB培养基的顶空样品瓶中，确保提取物最终浓度分别为0,5,10,50,100,200,500,1000μg/mL,顶空样品瓶培养液体体积2mL；上述样品瓶菌在37℃培养箱中震荡培养24h；
(4)取2mL的108cfu/mL的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌液于灭菌后顶空样品瓶中作为对照组培养；与实验组在相同条件下培养；
(5)设置顶空进样器操作条件及气相色谱仪操作条件，使CO2的色谱峰与其它峰基线分离，将所述实验组和对照组的顶空样品瓶置于顶空进样器中，进行顶空气相色谱分析，采集CO2色谱峰信息；
(6)根据采集的CO2色谱峰信息积分CO2色谱峰面积，根据所述CO2色谱峰面积分别计算得到不同浓度的氯霉素对金黄色葡萄球菌、不同浓度的十树樟提取物对沙门氏菌生长的抑制率，从而通过SPSS软件分别计算氯霉素对金黄色葡萄球菌以及十树樟对沙门氏菌的半数抑制浓度。其余同实施例一。
本发明实施例天然产物抗菌活性测定结果的相对标准偏差见表1，对两种菌(革兰氏阳性和阴性)的五次重复测量相对标准偏差均在5％以内，测定结果准确，精度高。
表1 抑制率的测定结果的相对标准偏差
注：表中数据为10μg/mL四环素对2mL的108cfu/mL的细菌菌液抑制率结果
在本文中，所涉及的前、后、上、下等方位词是以附图中零部件位于图中以及零部件相互之间的位置来定义的，只是为了表达技术方案的清楚及方便。应当理解，所述方位词的使用不应限制本申请请求保护的范围。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种天然产物抗菌活性测定方法，其特征是，通过顶空气相色谱法测定天然产物与细菌菌液共存培养过程中产生的CO2含量，根据得到的CO2含量计算天然产物对细菌生长的抑制率和半数抑制浓度。
2.根据权利要求1所述的一种天然产物抗菌活性测定方法，其特征是，具体包括以下步骤：
(1)确定细菌培养时间、温度及浓度；
(2)取适量已知浓度的细菌菌液与适量的天然产物在灭菌后的顶空样品瓶中，在上述温度和时间下作为实验组培养；
(3)取与步骤(2)等量的已知浓度的细菌菌液于灭菌后顶空样品瓶中，在上述温度和时间下作为对照组培养；
(4)设置顶空进样器操作条件及气相色谱仪操作条件，将培养后的所述实验组和对照组的顶空样品瓶立即置于顶空进样器中，进行顶空气相色谱分析，采集CO2色谱峰信息；
(5)根据采集的CO2色谱峰信息积分CO2色谱峰面积，根据所述CO2色谱峰面积计算得到天然产物对细菌生长的抑制率；
(6)采用不同浓度梯度的天然产物重复步骤(1)、(2)、(3)、(4)，采集不同浓度的天然产物与细菌作用产生的CO2色谱峰信息积分CO2色谱峰面积，根据所述CO2色谱峰面积计算不同浓度天然产物的抑制率，并计算得到天然产物对细菌生长的半数抑制浓度。
3.根据权利要求2所述的一种天然产物抗菌活性测定方法，其特征是，步骤(1)中，取适量的细菌菌液在灭菌后的顶空样品瓶中，一定温度下培养不同时间后置于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定培养时间。
4.根据权利要求3所述的一种天然产物抗菌活性测定方法，其特征是，步骤(1)中，取适量不同浓度的细菌菌液分别与适量的天然产物于灭菌后的顶空样品瓶中，在所述温度下振荡培养上述确定的时间，于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定细菌菌液浓度。
5.根据权利要求2所述的一种天然产物抗菌活性测定方法，其特征是，步骤(2)中，所述细菌菌液为正常培养代谢可产生CO2的菌种菌液。
6.根据权利要求2所述的一种天然产物抗菌活性测定方法，其特征是，步骤(2)中，所述天然产物为动植物、海洋生物、微生物的提取天然产物及以提取的所述天然产物为基础的药物制品。
7.根据权利要求2～5任一项所述的一种天然产物抗菌活性测定方法，其特征是，所述天然产物抗菌活性测定方法可应用于合成药物的抗菌活性测定。
CN201810133217.8A 2018-02-09 2018-02-09 一种天然产物抗菌活性测定方法 Pending CN108398496A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810133217.8A CN108398496A (zh) 2018-02-09 2018-02-09 一种天然产物抗菌活性测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810133217.8A CN108398496A (zh) 2018-02-09 2018-02-09 一种天然产物抗菌活性测定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108398496A true CN108398496A (zh) 2018-08-14

Family

ID=63095350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810133217.8A Pending CN108398496A (zh) 2018-02-09 2018-02-09 一种天然产物抗菌活性测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108398496A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363781A (zh) * 2020-03-05 2020-07-03 中国科学院武汉植物园 天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60110300A (ja) * 1983-11-16 1985-06-15 Chiyo Masuda 抗菌製剤の経時的抗菌力測定法
JPH09187294A (ja) * 1996-01-11 1997-07-22 Higeta Shoyu Co Ltd 抗菌力測定法及び測定キット
CN103792259A (zh) * 2014-02-21 2014-05-14 中国人民解放军第三〇二医院 一种用于评估穿心莲抗菌活性的方法
CN103913564A (zh) * 2014-04-11 2014-07-09 苏秀芳 一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法
CN106706626A (zh) * 2017-02-17 2017-05-24 西南民族大学 一种岩生忍冬成分鉴定及抗菌活性评价方法
CN107271590A (zh) * 2017-05-11 2017-10-20 华南理工大学 一种顶空气相色谱快速检测抗菌纸抑菌性的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60110300A (ja) * 1983-11-16 1985-06-15 Chiyo Masuda 抗菌製剤の経時的抗菌力測定法
JPH09187294A (ja) * 1996-01-11 1997-07-22 Higeta Shoyu Co Ltd 抗菌力測定法及び測定キット
CN103792259A (zh) * 2014-02-21 2014-05-14 中国人民解放军第三〇二医院 一种用于评估穿心莲抗菌活性的方法
CN103913564A (zh) * 2014-04-11 2014-07-09 苏秀芳 一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法
CN106706626A (zh) * 2017-02-17 2017-05-24 西南民族大学 一种岩生忍冬成分鉴定及抗菌活性评价方法
CN107271590A (zh) * 2017-05-11 2017-10-20 华南理工大学 一种顶空气相色谱快速检测抗菌纸抑菌性的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SADDAM HUSSAIN BUGHIO等: "Chemical composition of the essential oils from Tamarix dioica and determination of its antibacterial activity", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD PROPERTIES》 *
王丹峰等: "一种抗菌纸抑菌性的快速评价方法", 《造纸科学与技术》 *
陈利军等: "产香真菌ZY-2菌株鉴定及其挥发性物质抑菌活性测定与组分分析", 《南方农业学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363781A (zh) * 2020-03-05 2020-07-03 中国科学院武汉植物园 天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法及其应用
CN111363781B (zh) * 2020-03-05 2023-12-29 中国科学院武汉植物园 天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104140994B (zh) 一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质
EP0124193B1 (en) Method and device for bacterial testing
US5366873A (en) Device and method for use in detecting microorganisms in a sample
JP2000093158A (ja) 微生物検出用装置
Chunmei et al. Investigation of anti-microbial activity of catechin on Escherichia coli growth by microcalorimetry
JPS5832879B2 (ja) コウセイブツシツノ ソンザイノ ソクテイホウ
Motyl et al. Basic microbiological techniques used in antibacterial drug discovery
CN107271590A (zh) 一种顶空气相色谱快速检测抗菌纸抑菌性的方法
CN101776675A (zh) 一种新的注射用复方阿莫西林钠克拉维酸钾的检测方法
CN109580837A (zh) 一种盐酸左氧氟沙星注射液的检测方法
Hossain Methods for screening and evaluation of antimicrobial activity: A review of protocols, advantages, and limitations
CN108398496A (zh) 一种天然产物抗菌活性测定方法
Letsiou et al. Exploring the Antifungal Activity of Various Natural Extracts in a Sustainable Saccharomyces cerevisiae Model Using Cell Viability, Spot Assay, and Turbidometric Microbial Assays
CN101592636A (zh) 一种新的复方头孢噻肟钠舒巴坦钠的检测方法
Corvec et al. Characterization of medical relevant anaerobic microorganisms by isothermal microcalorimetry
CN103627790B (zh) 肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法
Herron et al. Micro‐scale water potential gradients visualized in soil around plant root tips using microbiosensors
Li et al. Headspace gas chromatographic method for antimicrobial screening: Minimum inhibitory concentration determination
CN109207554A (zh) 用ttc琼脂培养基快速检测日化产品抑菌效果的方法
CN102183664A (zh) 基于管碟法的生物素含量测定方法
CN208949285U (zh) 病原菌药敏指示工具、病原菌药敏检测培养皿、病原菌药敏检测卡、药敏检测试剂盒
CN109097433A (zh) 微生物含量检测方法及应用
CN109709136A (zh) 一种分析头孢曲松钠体外抑菌效果的等温微量热方法
CN208023017U (zh) 一种血液感染微生物的快速检测系统
Lepper et al. Blood and Cerebro-spinal Fluid Concentrations of Aureomyein after Oral and Intramuscular Administration.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180814

RJ01 Rejection of invention patent application after publication