CN104140994A - 一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，是经鸡肉肉糜的制备、鸡肉肉糜的灭菌、菌悬液的制备、混合菌液的制备、标准物质的制备、包装制得成品；再经标准物质的定值、均匀性试验、稳定性试验、不确定度评估得到所述标准物质，制得标准物质的规格为2g/瓶，其中金黄色葡萄球菌的浓度为100~300CFU/瓶；使用前，在标准物质中加入7mL无菌水，使其溶解即可使用。本发明所制得的含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质经冻干脱水，使其品质稳定、质量可控，可用于生物特性物质的鉴定、评价、分析、安全监控等，可实现更简便、准确的生物特性物质检测。

Description

一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质

技术领域

本发明具体涉及一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质。

背景技术

标准菌种是生物特性标准物质中较为特殊的一类，也是生物标准物质研究的重要内容之一。而目前在微生物、畜禽等相关成分标准物质的研究上还相对空白，已研制的标准物质准确度不高，且很多标准物质不能提供出不确定度的参考信息。本发明建立了一种金黄色葡萄球菌标准菌种的制备方法，期望其能够发挥包括鉴定、评价、分析、安全监控等用途，为生物特性物质的检测提供更简便、准确的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，所制得的含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质经冻干脱水，使其品质稳定、质量可控，可用于生物特性物质的鉴定、评价、分析、安全监控等，可实现更简便、准确的生物特性物质检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，是经鸡肉肉糜的制备、鸡肉肉糜的灭菌、菌悬液的制备、混合菌液的制备、标准物质的制备、包装制得成品；再经标准物质的定值、均匀性试验、稳定性试验、不确定度评估得到所述标准物质。

所述成品的制备具体包括以下步骤：

1）鸡肉肉糜的制备：将鸡胸脯肉切成小块，并挑除脂肪及筋膜等组织，用灭菌处理过的高速组织捣碎机搅碎2min至肉糜状；将鸡肉肉糜放于均质袋中，用拍击式均质器匀质3min；

2）鸡肉肉糜的灭菌：将匀质后的鸡肉肉糜采用⁶⁰Coγ辐射灭菌，使菌落总数小于10 CFU/g，以达到基质无菌的要求，再于-70℃下备用；

3）菌悬液的制备：将冻干管中的标准金黄色葡萄球菌菌种用灭菌生理盐水溶解后，划线接种于BP平板上，35-37℃下培养18-24h；再从BP平板上挑取单个典型菌落，划线接种于营养琼脂斜面，35-37℃下培养18-24h；取菌苔划线接种于BP平板上35-37℃下培养18-24h后挑取单菌落接种到BHI肉汤中，35-37℃下培养18-24h，制成菌悬液；

4）混合菌液的制备：取培养至对数期中后期的新鲜菌悬液，测定其OD₆₀₀值，根据浓度标准曲线估算菌液的浓度；采用梯度稀释法，用灭菌生理盐水将菌悬液稀释至菌浓度为1.5×10⁴~3.5×10⁴CFU/mL；吸取1mL菌液稀释液加入到300mL保护剂中，制备成混合菌液；

5）标准物质的制备：将5g灭菌后的鸡肉肉糜装入25mL的西林瓶中，每瓶加入4mL混合菌液后，轻轻盖上丁基胶塞，再样品均匀码放于冻干机的隔板层上进行冻干；

6）包装：冻干结束后，压盖密封西林瓶，加铝盖封口后于-20℃保存，制得所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质。

步骤1）所述鸡胸脯肉需先经抗生素残留检测，不含抗生素。

步骤2）所用⁶⁰Coγ的辐射剂量为6KGY。

步骤3）所述保护剂是将脱脂乳、PVP、蔗糖和L-谷氨酸加水配制而成；

每100mL保护剂中脱脂乳的质量浓度为20%、PVP的质量浓度为8%、蔗糖的质量浓度为12%、L-谷氨酸的质量浓度为1%。

步骤4）所述浓度标准曲线是将菌悬液于35-37℃下分别培养14、15、16、17、18、19h后，采用倾注法计算菌落数，并测定OD₆₀₀值，再以OD₆₀₀值为横坐标，对应菌落数的对数值为纵坐标，绘制而成。

步骤5）所述冻干采用美国LABCONCO公司生产的FreeZone Triad冷冻干燥机；冻干过程的参数设定如下：

所制得的含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质规格为2g/瓶；其中金黄色葡萄球菌的浓度为100~300 CFU/瓶。

所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质的应用，是在使用前，在标准物质中加入7mL无菌水，使其溶解。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明在生物活性标准物质的基础上添加基质，建立起一套含有鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质的制备方法，此方法中通过加入保护剂，可有效减少金黄色葡萄球菌在冷冻干燥过程中有效减少的死亡。

（2）本发明采用OD₆₀₀值与对应菌落数的对数值为横、纵坐标，绘制菌浓度曲线，以此作为添加菌液量的依据。

（3）本发明使用美国LABCONCO公司生产的FreeZone Triad冷冻干燥机，使整个标准物质的制备过程一体化，避免了中途搬运造成的污染；其冻干参数的设定保证了不同批次的标准物质具有相同的冻干条件，且自动记录的冻干曲线有利于标准物质的控温和干燥程度的判断，极大地简便了标准物质的制备流程。

（4）本发明采用西林瓶少量分装标准物质，使每瓶标准物质的含量为2g，有效保证了样品的稳定性，适于冻干、储藏与运输。

（5）本发明的制备过程中将鸡肉与保护剂的混合物进行脱水干燥，有利于更准确的测定每瓶标准物质的重量。

（6）本发明确定了标准物质使用前的复水量，有利于实际应用中快速、准确进行检测。

附图说明

图1为本发明菌种浓度标准曲线。

图2为保护剂配方中各因素对金黄色葡萄球菌冷冻干燥后存活率的作用曲线。

图3为本发明制备标准物质的稳定性实验曲线。

具体实施方式

1 试验材料与仪器设备

1.1 试验材料

金黄色葡萄球菌（ACCT6538），由福建省出入境检验检疫局食品微生物检测分中心提供，购自上海汉尼生物技术有限公司。

无抗生素残留的鸡胸脯肉，由圣农集团提供。

1.2 仪器与设备

1.3 主要培养基的配制

（1）营养肉汤

称取10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，1.0g葡萄糖，5.0g氯化钠于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.5±0.2，分装试管，121℃高压灭菌15min备用。

（2）平板计数琼脂（PCA）

称取5.0g胰蛋白胨，2.5g酵母浸粉，1.0g葡萄糖，15.0g琼脂于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.0±0.2,高压灭菌瓶分装，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃备用。

（3）脑心浸出液肉汤（BHI肉汤）

称取10.0g胰蛋白胨，2.0g葡萄糖，5.0g牛心粉，5.0g氯化钠，2.5g磷酸氢二钠（12H₂O）于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.4±0.2,高压灭菌瓶分装，121℃高压灭菌15min备用。

（4）Baird-Parker培养基（BP培养基）

称取10.0g胰蛋白胨，5.0g牛肉膏，1.0g酵母膏，10.0g丙酮酸钠，12.0g氨基酸，5.0g氯化锂（6H₂O），20.0g琼脂于950mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.0±0.2，每瓶分装95mL，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃备用。临用前，每95mL加入5mL亚碲酸钾卵黄增菌液（亚碲酸钾：卵黄：生理盐水的重量比为2:3:7，无菌制备），混匀后倾注平板备用。

（5）柠檬酸-丙酮缓冲液

a.0.2 mol/L柠檬酸溶液的配制：4.2g柠檬酸（C₆H₈O₇）加无菌蒸馏水溶解定容至 100mL；

b.0.5 mol/L氢氧化钠溶液的配制：2.8g氢氧化钾（KOH）加无菌蒸馏水溶解定容至100mL；

等量混合a、b两种溶液，再按照混合液：丙酮：蒸馏水体积比为35:35:80的比例配制成柠檬酸-丙酮缓冲液。

（6）磷酸盐(PBS)缓冲液

a.pH8.0 PBS的配制：磷酸氢二钾16.73g、磷酸二氢钾0.523g，加蒸馏水溶解，调节pH值后用容量瓶定容至1000mL，装入高压灭菌瓶，121℃高压灭菌30min；

b.pH6.0 PBS的配制：磷酸氢二钾2.0g、磷酸二氢钾8.0g，加蒸馏水溶解，调节pH值后用容量瓶定容至1000mL，装入高压灭菌瓶，121℃高压灭菌30min；

c.pH4.5 PBS的配制：磷酸二氢钾13.6g，加蒸馏水溶解，调节pH值后用容量瓶定容至1000mL，装入高压灭菌瓶，121℃高压灭菌30min。

（7）鉴定用培养基

抗生素培养基5号（AM5）的配制：称取干粉25.5g，用1000mL蒸馏水溶解，调节pH为7.9±0.1，采用250mL克氏瓶分装，100mL/瓶，121℃高压灭菌备用；

抗生素培养基8号（AM8）的配制：称取干粉25.5g，用去离子水1000mL溶解，调节pH为6.85±0.05，采用250mL克氏瓶分装，100mL/瓶，121℃高压灭菌备用。

（8）抗生素工作溶液

用pH8.0、pH6.0及pH4.5的PBS缓冲液将氨苄西林、卡那霉素、土霉素、红霉素这四类抗生素标准储备液分别配制成氨苄西林标准工作液（0.025μg/mL）、卡那霉素标准工作液（0.5μg/mL）、土霉素标准工作液（0.1μg/mL）、红霉素标准工作液（0.05μg/mL）。标准工作液应现用现配。

（9）抗生素鉴定用平板的制备

藤黄微球菌（ATCC9341）平板：将100mL的灭菌AM5培养基加热融化至50℃的，吸取1mL最适浓度的菌悬液与之混合，吸取8mL倒入一次性平板内，使其水平凝固。

枯草芽孢杆菌（ATCC6633）平板：将100mL的灭菌AM5培养基加热融化至50℃的，吸取1mL最适浓度的菌悬液与之混合，吸取8mL倒入一次性平板内，使其水平凝固。

蜡样芽孢杆菌蕈状变种（ATCC11778）平板：将100mL的灭菌AM5培养基加热融化至50℃的，吸取1mL最适浓度的菌悬液与之混合，吸取8mL倒入一次性平板内，使其水平凝固。

以上平板均现用现配。

2 试验方法

2.1 菌种的复苏、保存与培养

2.1.1 菌种的复苏

用移液器吸取2mL灭菌生理盐水于标准金黄色葡萄球菌菌种冻干管中，轻微振摇待其溶解后，用灭菌接种环取少许菌液，划线接种于BP平板上，(36±1)℃培养18-24h，复苏菌种。

2.1.2 菌种的保存

用灭菌接种环从BP平板上挑取单个典型菌落，划线接种于营养琼脂斜面，(36±1)℃培养18-24h，置于4℃保存，保存期为30d。

2.1.3 菌种的培养方法

在2.1.2项下培养的营养琼脂斜面上，用灭菌接种环轻刮少许菌苔，划线接种于BP平板上，(36±1)℃培养18-24h后挑取单菌落接种到BHI肉汤中，(36±1)℃培养18-24h，制成菌悬液。

2.2 金黄色葡萄球菌菌落计数方法的选择试验

2.2.1 试验菌液制备

采用梯度稀释平板计数法，即在无菌操作条件下，将2.1.3项下培养的菌悬液充分混匀（测得初始含菌量约为3.6×10⁷CFU/mL），吸取1mL，加入灭菌生理盐水，制成1:10的均匀稀释液，再依次进行10倍递增稀释，使菌液稀释液的最终含菌量在100 CFU/mL左右。

2.2.2 试验方法

分别采用PCA计数法、Baird-Parker倾注法、Baird-Parker平板涂布法三种计数方法，对2.2.1项下制备的试验菌液进行计数。

（1）PCA计数法

吸取1mL 2.2.1项下制备的菌液稀释液置于灭菌培养皿中，然后倒入15mL水浴至50℃的琼脂计数培养基，摇匀。待平板冷却凝固后，倒置于培养箱中(36±1)℃培养18h~24h；

（2）BP倾注法

取一无菌平板，吸取1mL 2.2.1项下制备的菌液稀释液，倾注15mL冷却至42℃的BP培养基（使用前加入亚碲酸钾卵黄增菌液），摇匀。待平板冷却凝固后，倒置于培养箱中(36±1)℃培养18h~24h；

（3）BP平板涂布法

取三个制好的BP琼脂平板，将2.2.1项下制备的菌液稀释液以0.3mL、0.3mL、0.4mL的量分别加入到三个平板中（根据GB4789.10-2010规定），用无菌三角推棒将菌液涂布整个平板，静置10min，待菌液吸收完全后，倒置于培养箱中(36±1)℃培养18h~24h。

以上三组试验各进行十次平行测定，同时用生理盐水做空白对照，培养后观察结果。

2.2.3 结果判定

计数在BP平板上菌落直径为2mm~3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈，用接种针接触菌落有似奶油至树胶样硬度的菌落，记录具有该典型特征的金黄色葡萄球菌的菌落数。

2.3 金黄色葡萄球菌菌浓度标准曲线的绘制

2.3.1 试验方法

a.采用2.1.3项下的培养方法制备菌悬液，涡旋振荡器上混匀后4℃冰箱保存备用；

b.取装有50mLBHI的150mL三角锥瓶6个，编号为14、15、16、17、18、19h；

c.用移液枪分别吸取0.2μL a中的菌悬液加入到已编号的6个三角锥瓶中，轻微震荡摇匀后塞紧锥形瓶胶塞，置于(36±1)℃培养14~19h。

d.按照设计的时间点进行菌落计数并测定OD₆₀₀值。

2.3.2 菌落计数

根据2.2选择的计数方法计算菌落总数。

2.3.3 OD₆₀₀值测定

分别吸取150μL菌悬液于八连管中（每支试管分别作三个平行），用多功能酶标仪测定OD₆₀₀值。

2.3.4 绘制标准曲线

以OD₆₀₀为横坐标，对应菌落数的对数值为纵坐标，绘制浓度标准曲线。

2.4 保护剂选择试验

2.4.1 保护剂系统

脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、L-谷氨酸钠

2.4.2 正交实验设计

采用L₉（3⁴）正交表进行试验，分别以脱脂乳、PVP、蔗糖、L-谷氨酸钠作为因素A、B、C、D，各取三个不同水平，以金黄色葡萄球菌的存活率为指标。各因素水平设计见表1。

表1 保护剂各因素水平设计表

2.4.3 菌液和保护剂的制备

a.采用2.1.3项下的培养方法，于盛有50mLBHI培养液的250mL三角锥瓶中扩大培养金黄色葡萄球菌后，测定OD₆₀₀值，根据菌浓度曲线估计原始菌量，以无菌生理盐水稀释至菌液的含菌量为10⁴CFU/mL；

b.根据正交表，用蒸馏水配制不同因素水平的保护剂，100mL/瓶，调节pH值至7.4，115℃高压灭菌30min；

c.于每瓶保护剂中各加入1mL a中制备的菌液稀释液，充分混匀后，吸取2mL混合液于灭菌西林瓶中，盖上丁基胶塞。取无菌水和菌液的混合液2mL作为空白对照。每个水平的保护剂制备10支西林瓶。

d.计数保护剂中的实际含菌量。从混有菌液的保护剂中吸取1mL于无菌平皿中，倾注15mL冷却至42℃的BP培养基（使用前加入亚碲酸钾卵黄增菌液），摇匀。待平板冷却凝固后，倒置于(36±1)℃培养箱中培养18h~24h。

2.4.4 冷冻干燥

根据样品共晶点（可在冻干机温度曲线上测得）及干燥所需时间设定冻干程序参数，将西林瓶进行冷冻干燥。冻干程序参数见表2。

表2 冻干参数设计

2.4.5 生化试验

使用VITAK 2 COMPACT（全自动微生物分析系统）仪鉴定冻干后的金黄色葡萄球菌。

2.4.6 存活率测定

采用2.2选择的计数方法测定活菌数。

取出冻干样品，待其恢复室温后，加入2mL无菌水进行溶解，复水后吸取1mL于无菌平板中，平行制备两板，置(36±1)℃中培养18h~24h。

2.4.7 优化组合验证试验

对比正交法筛选出的保护剂最优组合与试验相对最好组合。试验方法同2.3。

2.5 鸡肉基质的制备

2.5.1 鸡肉中药物残留检测（四大类抗生素）

a.提取样液：随机抽取适量鸡肉制成10g肉糜，置于50mL的离心管中，加入20mL柠檬酸-丙酮缓冲液，于涡旋振荡器上充分振荡3min，70℃-75℃水浴20min后，2000rpm离心15min，静置备用。

b.培养检测：取1.3(9)中制备好的抗生素鉴定用平板各两个，将4片小滤纸片呈“十字型”均匀码放在各个平板上，并在平板底部做好标记（+、-、样、样）。其中两片滤纸片共滴加100μL a中的上清液（直至纸片吸满为止），另一片滴加100μL的标准工作液（阳性对照，制备见1.3(8)），最后一片滴加无菌水（阴性对照）。将平板放入4℃冰箱冷藏30min后，30℃培养18h。

上述操作步骤依据《SNT 1750-2006 抗生素类检测MIA法》。

c.结果判定：用电子游标卡尺测量抑菌圈的直径大小。如果样液在三种平板上均无抑菌圈，而标准工作液的抑菌圈达到14mm±1mm，即为“阴性”；如果样液在三种平板上任一平板呈现抑菌圈，且抑菌圈的直径在12mm以上，则为“初筛阳性”；如果样液在三种平板上任一平板呈现抑菌圈，且10mm＜抑菌圈的直径＜12mm，则为可疑，需重新测试。

2.5.2 鸡肉前期处理

a.工具灭菌：高速组织捣碎机的搅拌部件用次氯酸钠浸泡后，于使用前用75%酒精擦拭干净；刀具洗净后以75%酒精擦拭并用火焰灭菌。

b.制备肉糜：将鸡胸脯肉切成小块，并用剪刀挑除脂肪及筋膜等组织，用高速组织捣碎机搅碎2min至肉糜状；收集肉糜于均质袋中，500g/袋，用拍击式均质器匀质3min。

c.分装保存。用5#塑封袋分装肉糜，25g/袋，储存于-70℃冰箱待用。

2.5.3 ⁶⁰Coγ辐照灭菌 

灭菌前测定鸡肉糜所含菌落的总数（按照GB 4789.2-2010方法）为3.8×10³ CFU/mL，为保证灭菌后其含菌量小于10 CFU/mL，以达到试验基质无菌的要求，则所需⁶⁰Coγ辐射剂量为6KGY。灭菌后的鸡肉糜仍按照GB 4789.2-2010方法测定含菌落总数。

2.6 批量制备标准物质

2.6.1 标准物质的脱水性试验

取体积为25mL的西林瓶20个，称取5g灭菌鸡肉肉糜于其中，每瓶加入混合菌液4mL，轻轻盖上丁基胶塞，记录每瓶的总质量；将样品均匀码放于冻干机的隔板层，按表3设置冻干参数；冻干结束后，压盖密封西林瓶，分别测定20个西林瓶冻干后的质量。

表3 冻干参数设计

2.6.2 标准物质的制备

制备培养至对数期中后期的新鲜菌液，测其OD₆₀₀值，根据浓度标准曲线估算菌液的浓度；再采用梯度稀释法将菌液稀释至菌浓度为1.5×10⁴~3.5×10⁴CFU/mL，吸取1mL菌液稀释液加入到300mL保护剂中，制得混合菌液。

称取5g鸡肉肉糜于25mL西林瓶中，每瓶加入混合菌液4mL，轻轻盖上丁基胶塞，将样品均匀码放于托盘中送入冻干机，置于隔板层上，按表3设置冻干参数。样品冻干后，压盖密封西林瓶后，加铝盖封口。制备好的标准物质于-20℃保存。本实施例制得标准物质的含菌浓度为100~300CFU/瓶。

2.7 标准物质定值方法

根据标准物质冻干前后的质量差（即标准物质脱水的质量），吸取相应体积的无菌水（7mL）对冻干物质进行溶解复原，静置1min左右，再加入9mL无菌水，用无菌针状物将溶解物充分混合均匀，制成1:2的菌悬液，用平头移液管吸取1mL于无菌平皿中，平行制备3片，倾注15mL冷却至42℃的BP培养基（使用前加入亚碲酸钾卵黄增菌液），摇匀。待平板冷却凝固后，倒置于(36±1)℃培养箱中培养18h~24h。

定值结果一般表示为：标准值±总不确定度。

2.8 标准物质鉴定

2.8.1 生化性状试验

VITAK 2 COMPACT鉴定，同2.4.5。

2.8.2 均匀性试验

按照统计学要求，每批次至少取15份样品进行验证。

（1）重复性试验

按贝塞尔(Bessel)公式算得的重复性标准差记为Sr。下标r被称为“重复性限”，它是重复性条件下两次测量结果之差以95%的概率所存在的区间。假定多次测量所得结果呈正态分布，而且算得的Sr充分可靠(自由度充分大)，则可求得，即重复性限约为重复性标准差的3倍。

（2）再现性试验

通常用复现性标准差（以Sr，r为复现性限）来表示测量结果分散性，按贝塞尔公式进行计算。

2.8.3 稳定性试验

以标准物质制备完成的时间为起始时间，定时对标准物质的含菌量进行测定，并以时间为横坐标，菌种含量为纵坐标，绘制菌含量-时间曲线。根据曲线分析其稳定性。

2.9 标准物质不确定度评定

2.9.1 金黄色葡萄球菌菌落总数测定的不确定度评估 

随机抽取15份样品，每份样品作2个平行测试，按照2.2试验选择的计数方法，对这些样品进行菌落计数，再利用贝塞尔计算公式计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差，从而计算出不确定度。

2.9.2 标准物质的定值方法不确定度评估 

根据对标准物质均匀性不确定度的评估结果对标准物质定值方法进行不确定度评估。所用的评估方法与金黄色葡萄球菌菌落总数测定的不确定度评估相同。

2.9.3 电子天平的不确定度评估 

电子天平不确定度评估的参考测量依据：JJG99-2006《砝码检定规程》；JJG1036-2008《电子天平检定规程》；JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》。电子天平计量误差包括重复性误差、线性误差和四角误差三项。

试验过程中所用电子天平Satorius/德国的BS200S-WEI，最大量程为310g，测量分度d=1mg，检定分度e=10mg，线性误差，四角误差。本次试验所用的是加载最大标准砝码值为100g的F1等级砝码装置进行检测。

（1）重复性误差的标准不确定度Ur的评估

在重复性条件下，用天平最大载荷的二分之一即155g，对天平进行9次重复性测量，用极差法对结果进行分析计算。重复性误差表示为，用平衡位置最大值减去平衡位置最小值，公式记为。

（2）线性误差标准不确定度U _L 的评估 

线性误差的标准不确定度主要由线性误差的不确定度Ui与加载砝码的不确定度U_A这两项互相独立的不确定度合并而成，因此需要分别计算以及。

（1）最大量程（100g）的加载砝码标准的不确定度：

式中砝码量测允许误差值；k为包含误差因子。

注：在置信水平p值为95%，自由度Vf足够时，包含误差因子为。

（2）电子天平线性误差的测量值服从均匀性分布，置信水平为95%时，包含误差因子，线性误差的不确定度为：

式中为电子天平线性误差。

（3）电子天平的线性误差的标准不确定度U_L计算如下：。

（4）四角误差标准不确定度U _C 的评估 

该误差测量使用天平最大量程的1/3的载荷量进行试验。将其放置称量盘的四角即称量盘左、右、前、后四个偏向中心和正中心部位进行测量。 

（5）合成标准不确定度U评定

综上，各不确定度分量彼此并无相关，计算合成标准不确定度U；

自由度：。

3 结果

3.1 三种不同方法计数金黄色葡萄球菌菌液的结果

采用PCA计数法（A组）、Baird-Parker倾注法（B组）、Baird-Parker平板涂布法（C组）三种计数方法对含菌量相同的金黄色葡萄球菌样液进行计数，结果如表4所示。

表4 不同测定方法对金黄色葡萄球菌菌液的计数结果（单位：CFU/瓶）

对试验所得结果进行方差分析，分析结果见表5。

表5 方差分析结果

注：同列数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P<0.01）；小写字母不同表示差异显著（P<0.05）；相同字母表示差异不显著（P>0.05）。（下同）

从表5可以看出：

（1）PCA计数法与BP倾注法相相比，P值大于0.05，与BP平板涂布法相比，P值小于0.05，表明PCA计数法与BP倾注法的菌落计数结果差异不显著，但与BP平板涂布法的菌落计数结果有显著性差异。

（2）BP倾注法与BP平板涂布法相比，其P值小于0.01，表明采用这两种方法计数金黄色葡萄球菌对结果影响差异极显著。

根据GB4789.2-2010规定，食品中菌落总数的计数采用的是PCA计数法，因为本试验所使用的菌种是标准菌株，所以可利用PCA计数法来衡量和对比另外两种计数方法的准确度。上述试验结果表明，BP倾注法用于计数金黄色葡萄球菌，其计数结果与细菌总数测定一致，且从SD值来看，BP平板倾注法< BP平板涂布法，表明采用BP平板倾注法计数金黄色葡萄球菌的结果精密度、结果稳定、再现性较好，有利于试验结果的复现。因此，本试验中所涉及金黄色葡萄球菌计数均采用BP倾注法。

3.2 金黄色葡萄球菌菌生长曲线及浓度标准曲线的绘制 

表6 不同培养时间下金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值及菌浓度测量值

图1是以OD₆₀₀值为横坐标、对应菌种浓度的对数值为纵坐标，绘制出的金黄色葡萄球菌的菌种浓度标准曲线，其线性方程为y=11.406x+2.9686（R²=0.9709）

3.3 保护剂的确定

3.3.1 保护剂试验结果

保护剂配方的正交试验结果见表7。

表7 配方保护剂试验结果

注：(1)K1为水平1的结果之和，K2为水平2的结果之和，K3为水平3的结果之和；(2)T为总和；(3)R为极差

3.3.2 配方保护剂试验结果分析

（一）各因素对菌种存活率的作用大小 

极差R的大小反映了试验中各因素作用的大小，从表7中极差R的大小，可确定各因素对存活率影响的大小为：C（蔗糖）＞B（PVP）＞D（L-谷氨酸）＞A（脱脂乳），其中蔗糖对菌种存活率的影响最显著，其次是PVP和L-谷氨酸，在一定范围内，脱脂乳对活菌率的影响最小。

（二）各因素对菌种存活率的影响

图2为保护剂配方中不同水平脱脂乳、PVP、蔗糖、L-谷氨酸对金黄色葡萄球菌冷冻干燥后存活率的作用曲线。

从表7的结果和图2可以看出：

（1） 脱脂乳10%、20%、30%这3个水平中，20%脱脂乳中金黄色葡萄球菌的存活率较高。

（2） 金黄色葡萄球菌的存活率随PVP浓度的增高而提高，以PVP浓度为8%时最好。

（3） 金黄色葡萄球菌的存活率在蔗糖为12%时为最高，因此以蔗糖浓度为12%最适宜。

（4） 金黄色葡萄球菌的存活率与L-谷氨酸浓度成反比关系，因此以浓度为1%的L-谷氨酸最佳。

由此可以初步确定最优的水平组合为A₂B₃C₂D₁，即20%脱脂乳、8%PVP、12%蔗糖和1%L-谷氨酸配比组成的保护剂为最佳保护剂。

（三）方差分析

表8 方差分析结果

注：(1)在计算过程中，由于因素A的极差R、均方值相对于因素B、C、D的极差、均方值小，对因素A不作方差分析。(2)本试验采用除效应很大的因素B、C、D值以外的部分作为误差项，所以对误差估计偏大，故采用10%和5%两个显著水平。

从表8方差分析结果显示，PVP、蔗糖、L-谷氨酸的P值均小于0.05，表明三者对金黄色葡萄球菌冷冻干燥后的存活率均有极显著的影响；而区组P值大于0.25，说明区组效应不显著。

3.3.3 优化组合验证结果

分别以正交法筛选出的最优组合A₂B₃C₂D₁与实验相对最好组合A₃B₃C₂D₁配比作为保护剂，对金黄色葡萄球菌进行冷冻干燥，用BP倾注法测定冷冻干燥前后活菌数，计算其存活率，结果见表9。

表9 两种组合保护剂对金黄色葡萄球菌冷冻干燥保护效果的比较

从表9看出，A₂B₃C₂D₁组合的保护剂用于金黄色葡萄球菌冷冻干燥，其存活率达58%，明显高于A₃B₃C₂D₁组合保护剂的存活率（46%）。

3.4 标准物质冷冻干燥脱水结果

标准物质冷冻干燥后脱水率的测定结果见表10，其中：

冻干前后质量差(g)=冻干前总质量(g)-冻干后总质量(g)；

脱水率(%)=冻干前后质量差/冻干前总质量×100%。

表10 标准物质冷冻干燥后脱水率结果

从表10结果可看出，标准物质冻干后的脱水率平均为17.57%，冻干后的质量平均约为9g-7.23g=1.77g≈2g（其中9g为5g鸡肉糜+4g混合菌液），即每支西林瓶含有2g标准物质。

3.5 均匀性试验结果 

对鸡肉作为基质的金黄色葡萄球菌菌种标准物质共进行了5个批次的成品制备，每个批次分别制备10个。按照统计学要求进行试验，每个样本至少取10份。按照2.7项下的定值方法进行计数。抽检的样品于同一时间、同一试验条件下进行检测。标准物质中金黄色葡萄球菌的计数结果见表11，方差分析结果见表12。

表11 标准物质中金黄色葡萄球菌的菌数（单位：CFU/瓶）

表12 方差分析结果

表12方差分析结果表明，5个批次间金黄色葡萄球菌的含量差异不显著，说明所制备的标准物质中金黄色葡萄球菌的含量是均匀的。

3.6 稳定性试验结果 

从制备好的标准物质中定期任取三瓶，按2.7的定值方法测定菌数，根据菌数随时间的变化来分析标准物质的稳定性，实验结果见表13。

表13 标准物质的稳定性试验

图3是以时间为横坐标，标准物质的菌数为纵坐标，绘制的稳定性实验曲线。

从图3可以看出，标准物质在前两周内菌数大幅度下降，从最初的277 CFU/瓶下降到184 CFU/瓶；而之后120天稳定在140 CFU/瓶。对第35日起的七组数据进行方差分析，结果见表14，其中，从第42日起的六个不同保存时间测得的金黄色葡萄球菌含量差异不显著，表明制备的标准物质在-20℃条件下保存第42日至第120日之间其特性值是稳定的。

表14 方差分析结果

3.7 不确定度评估结果 

3.7.1  金黄色葡萄球菌计数方法的不确定度评定结果 

取不同批次的10份样品进行检测，每份样品平行测定2次，共进行20次菌种计数的检测，检测结果见表15；根据贝塞尔计算公式，计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差S_p，以评估计数方法给标准物质带来的不确定度。

表15 计数方法不确定度的检测结果

         注：X₁、X₂为每份重复测定的两个结果。

根据公式：=lgX_i -，计算每个样品检测结果的残差值，并进一步计算样品检测结果的残差平方及残差平方和，计算结果见表16。

表16 检测结果的残差平方及残差平方和

       根据贝塞尔计算公式，可计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差：

==0.053335729；

其中，m为检测的样本数，即m=10；n为每个样品重复检测的次数，即n=2；

总体合成的样本差U _c ==0.053335729/ 1.414213562=0.038；

    则扩展不确定度：U=t×U _c ；取置信水平95%，v（自由度）=10，经过查t分布表得：t_0.05(10)=2.228；

得出U=2.228×0.038=0.084。

    当检测结果以2次测量对数值的平均值表示时，其值区间分布于±0.084之间。这个取值区间适合于任何一次测量。

3.7.2 金黄色葡萄球菌标准物质定值方法的不确定度评定结果

取不同批次的冻干标准物质10份，按照2.7的定值方法进行测量，每份样品平行测量3次，计数结果见表17。

表17 定值方法不确定度的计数结果 

注：X₁、X₂、X₃为同一样品3次测定结果。

  据贝塞尔计算公式，计算出上述检验值对数值的标准偏差合并样本样品标准差：

    ==4.024922359；

其中，m为检测的样本数，即m=10；n为每个样品重复检测的次数，即n=2；

    则总体合成的样本差U _c ==2.846049894；

   则扩展不确定度：U =t×U _c ；取置信水平95%，v（自由度）=10，经过查t分布表得：t_0.05(10)=2.228；

得出U=2.228×2.846049894=6.340999164，取整数则U=6。

    当测量检验结果用3次测量值平均值表示结果时，其值分布区间至±6之间。这个取值的区间适用于每一次测量。

3.7.3 电子天平的不确定度评估 

电子天平不确定度的评估结果见表18。

表18 电子天平不确定度的评估结果 

（1）四角误差的标准不确定度Uc评估 

四角误差的标准测量结果不确定度应该按照正态分布情况考虑。在置信水平为95％时，包含误差因子k=3；因此四角误差的标准测量结果不确定度为：

。

（2）线性误差的标准不确定度U _L 评估 

U _L 的计算公式为：

其中，电子天平线性误差U_i属于B类的不确定度，该测量值服从均匀性分布，置信水平为95%时，包含误差因子：

，式中△Z为电子天平线性误差； 

U _A 为使用最大量程加载砝码（100g）标准的不确定度，在置信水平p值为95%，自由度V_f足够时，包含误差因为k=3：

,式中δ为砝码量测允许误差值；

则。

（3）重复性误差测量结果的标准不确定度Ur评估

重复性误差：；当n=9，其测量值接近正态分布的前提下，每次测量结果的试验标准差，式中，C为极差系数（由表19查得），则：

。

表19 极差系数C及自由度

（4）合成标准不确定度U

合成标准不确定度：

自由度：

其中，U_C的V_f足够大记为∞；U_L的V_f足够大记为∞；根据表19极差系数C及自由度，当n=9时，V_f=6.8。

（5）扩展不确定度U

置信水平为95％时由JJG 1059-1999附录A得包含因子k=1.96。

扩展不确定度：U = k×u=1.96×1.42518=2.7934mg

因此本试验用的电子天平的扩展不确定度为U=2.7934mg，在本标准制备中可忽略不计。 

此外，本发明标准物质的定值方法及不确定度的评估方案适用于标准物质的定值和不确定度的测定，可作为制备成果适用性的理论依据，给同类制作工艺提供参考。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (9)

1. 一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，其特征在于：经鸡肉肉糜的制备、鸡肉肉糜的灭菌、菌悬液的制备、混合菌液的制备、标准物质的制备、包装制得成品；再经标准物质的定值、均匀性试验、稳定性试验、不确定度评估得到所述标准物质。

2. 根据权利要求1所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，其特征在于：所述成品的制备具体包括以下步骤：

1）鸡肉肉糜的制备：将鸡胸脯肉切成小块，并挑除脂肪及筋膜，用灭菌处理过的高速组织捣碎机搅碎2min至肉糜状；将鸡肉肉糜放于均质袋中，用拍击式均质器匀质3min；

2）鸡肉肉糜的灭菌：将匀质后的鸡肉肉糜采用⁶⁰Coγ辐射灭菌，使菌落总数小于10 CFU/g，再于-70℃下备用；

3）菌悬液的制备：将冻干管中的标准金黄色葡萄球菌菌种用灭菌生理盐水溶解后，划线接种于BP平板上，35-37℃下培养18-24h；再从BP平板上挑取单个典型菌落，划线接种于营养琼脂斜面，35-37℃下培养18-24h；取菌苔划线接种于BP平板上35-37℃下培养18-24h后挑取单菌落接种到BHI肉汤中，35-37℃下培养18-24h，制成菌悬液；

4）混合菌液的制备：取培养至对数期中后期的新鲜菌悬液，测定其OD₆₀₀值，根据浓度标准曲线估算菌液的浓度；采用梯度稀释法，用灭菌生理盐水将菌悬液稀释至菌浓度为1.5×10⁴~3.5×10⁴CFU/mL；吸取1mL菌液稀释液加入到300mL保护剂中，制备成混合菌液；

5）标准物质的制备：将5g灭菌后的鸡肉肉糜装入25mL的西林瓶中，每瓶加入4mL混合菌液后，轻轻盖上丁基胶塞，再样品均匀码放于冻干机的隔板层上进行冻干；

6）包装：冻干结束后，压盖密封西林瓶，加铝盖封口后于-20℃保存制得成品。

3. 根据权利要求2所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，其特征在于：步骤1）所述鸡胸脯肉需先经抗生素残留检测，不含抗生素。

4. 根据权利要求2所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，其特征在于：步骤2）所用⁶⁰Coγ的辐射剂量为6KGY。

5. 根据权利要求2所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，其特征在于：步骤3）所述保护剂是将脱脂乳、PVP、蔗糖和L-谷氨酸加水配制而成；

每100mL保护剂中脱脂乳的质量浓度为20%、PVP的质量浓度为8%、蔗糖的质量浓度为12%、L-谷氨酸的质量浓度为1%。

6. 根据权利要求2所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，其特征在于：步骤4）所述浓度标准曲线是将菌悬液于35-37℃下分别培养14、15、16、17、18、19h后，采用倾注法计算菌落数，并测定OD₆₀₀值，再以OD₆₀₀值为横坐标，对应菌落数的对数值为纵坐标，绘制而成。

7. 根据权利要求2所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，其特征在于：步骤5）所述冻干采用美国LABCONCO公司生产的FreeZone Triad冷冻干燥机。

8. 根据权利要求2所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，其特征在于：所制得的含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质的规格为2g/瓶；其中金黄色葡萄球菌的浓度为100~300 CFU/瓶。

9. 一种如权利要求1所述含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质的应用，其特征在于：使用前，在标准物质中加入7mL无菌水，使其溶解。