CN107557427A - 一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其具体经保存液的配制、基质预处理、混悬液的配制、标准物质的制备及菌种鉴定、均匀性验证、定值、稳定性检验，制得含菌数为100~350 CFU/瓶的成品。所得含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质具有良好的均匀性，可解决现有标准物质中鱼肉基质难溶于水的问题，且其品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。

Description

一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质

技术领域

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质。

背景技术

菌种标准物质是生物特性标准物质中较为特殊的一类，通过使用菌种标准物质能够有效保证微生物定量检测高效、准确地运行，但目前国内仅在出入境检验检疫系统内少数几个局在研制，大部分的标准物质都是靠国外引进。2006年，辽宁出入境检验检疫局所研制的食品中微生物菌落总数标准物质被批准为国家二级标准物质。该标准物质包含两种研制方法：一种是以模拟食品实物，添加肠杆菌、沙雷氏菌、芽孢杆菌等具有标准号、可溯源性的菌株经冷冻干燥制成的：另一种是以鱼粉为基质与上述细菌混合经冷冻干燥制成的，而我国在食品基质的食源性致病微生物标准物质领域仍是空白，因此研制添加基质的微生物定量标准物质有重要意义。

副溶血性弧菌广泛分布在沿海和海水中，此菌主要感染水产品，是我国沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。食用感染水产品的易感者男女老幼均可患病引起胃肠炎爆发，但以青壮年为多，病后免疫力不强，可重复感染。本病多发生于夏秋沿海地区，常造成集体发病。近年来沿海地区发病有增多的趋势。潜伏期自1小时至4天不等。临床上以急性起病腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，严重者可出现全身痉挛甚至急性肾功能衰竭。在日本、东南亚、美国及我国台湾地区皆多见。

本发明以副溶血性弧菌为目标菌，通过添加无菌鱼肉粉，配合冻干保护剂，经冷冻干燥、不确定度评估以及对特性值进行均匀性检测和稳定性追踪，得到含一定菌数的含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，并形成了一套食品基质的食源性致病微生物标准物质的制备工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其具有良好的均匀性，且品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其制备方法包括以下步骤：

1)保存液的配制：将副溶血性弧菌标准菌株冻干粉用3％氯化钠碱性蛋白胨水溶解后于36±1℃培养8～18h，后于弧菌显色培养基平板上划线分离，在36±1℃恒温培养18～24h；然后挑取单菌落接种于3％氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1℃培养8～18h；吸取500μL菌液于无菌离心管中，加入500μL质量浓度为40％的无菌甘油，混合，制成保存液；

2)基质预处理：鱼肉剔除脂肪组织和筋，冷冻干燥后脱水率为76％。然后将脱水鱼肉粉碎至组织细度为50目，采用⁶⁰Coγ辐射灭菌后分装备用；

3)混悬液的配制：按1g鱼肉基质加入9mL无菌水的比例，将预处理后的鱼肉基质与水混合成基质悬液，再加入其3倍体积的保护剂，混合制得混悬液；

4)标准物质的制备：取步骤1)制备的保存液20μL加于200mL3％氯化钠碱性蛋白胨水中36±1℃下进行培养，并利用多功能酶标仪定时取样测定培养液的 OD_600nm值，当OD_600nm为0.335±0.1时停止培养，得新鲜菌液，然后将新鲜菌液按混悬液体积浓度0.01％加入到步骤3)制得的混悬液中，于恒温振荡器上 300r/min摇匀30min，再按2mL/瓶进行分装，其含菌量为4.5×10⁴～6.1× 10⁴CFU/mL，最后经冷冻干燥，制得标准物质；

5)检验：将所得标准物质进行菌种鉴定、均匀性验证、定值、稳定性检验，制得成品。

步骤1)所得保存液的平均菌数为5.3×10⁸CFU/mL。

步骤2)所用鱼肉需先经检测不含抗生素；所用⁶⁰Coγ的辐射剂量为6KGY。

步骤3)所述保护剂是将脱脂乳、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和水按体积比 6:10:1:3混合而成。

步骤4)经冷冻干燥后所得标准物质中含菌量为100～350CFU/瓶。

本发明的显著优点在于：

目前含基质的标准物质都存在一个重要的问题，即基质难溶于水，这使得标准物质难以达到满意的均匀性。本发明通过在预处理过程中将鱼肉基质冷冻干燥、粉碎，使所得标准物质能达到良好的均匀性。同时，本发明所得含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。

附图说明

图1冻干样品的稳定性下降率的曲线图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

1材料与方法

1.1材料与试剂

菌源：副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)，ATCC17802，购自上海汉尼生物技术有限公司。

基质：龙利鱼肉，购自沃尔玛超市，-20℃存储备用。

试剂：3％氯化钠碱性蛋白胨水，弧菌显色培养基，3％氯化钠三糖铁琼脂，平板计数琼脂，购自北京陆桥有限公司。海藻糖(分析纯)，北京兰博利德生物技术有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(优级纯)，国药集团化学试剂有限公司；酪氨酸(优级纯)，上海百赛生物技术有限公司；谷氨酸钠(优级纯)，山东西亚化学工业有限公司；德运脱脂牛奶，富祺仕贸易(上海)有限公司。

1.2仪器与设备

KD-TBC-300M电子天平，福建科迪技术有限公司；MODULYO-4K冷冻干燥机 (配有真空泵)，美国edword公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；M37610-33振荡器，金华雷琪实验器材有限公司；Stomacher3500 拍击式均质器，英国SEWARD；SpectraMax M5多功能酶标仪，Molecular Devices 公司；SHKE4450台式恒温振荡器，美国Thermo公司；VXE380超低温冰箱，JOUAN/ 德国公司；Vitek2COMPACT30微生物鉴定仪(配套GP鉴定卡)生物梅里埃公司； BOX389微生物鉴定仪配套麦氏比浊仪，HACH COMPANY公司；5mL西林瓶(配套丁基胶塞)，安徽华欣药用玻璃制品有限公司。

1.3方法

1.3.1制备保存液

将副溶血性弧菌标准菌株冻干粉用3％氯化钠碱性蛋白胨水溶解后于 36±1℃培养8～18h，后于弧菌显色培养基平板上划线分离，在36±1℃恒温培养18～24h；然后挑取单菌落接种于3％氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1℃培养8～ 18h；吸取500μL菌液于无菌离心管中，加入500μL质量浓度为40％的无菌甘油，混合，制成保存液。

1.3.2菌液OD₆₀₀值对应的菌数范围

加保存液20μL于200mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水，设计4个平行，(36±1)℃培养6、7、8、9、10、11、12、15、16、17、18、20、22h，利用多功能酶标仪测定培养液的OD₆₀₀nm值，同时按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行菌落计数。

1.3.3基质的前处理

鱼肉(无抗生素残留)剔除脂肪组织(因动物脂肪较易氧化酸败，使得干粉质量下降，保存状态不稳定，因此尽量剔除脂肪)，冷冻干燥后脱水率为76.23％；将脱水鸡肉用高速万能粉碎机粉碎，至基质组织细度为50目，其呈疏松粉末状，易分散于热水中，有少量的沉淀，⁶⁰Coγ辐射剂量选择6KGY，灭菌后按100g/袋分装于自封袋中，于玻璃干燥锅中存储待用。

1.3.4保护剂的设计

选择脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、酪氨酸、谷氨酸，分别记作M、P、 T、L、G。五种因素分别设计3个水平，以存活率作为指标，进行单因素实验，筛选出3种存活率较高的保护剂脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖，其水平设计见表1，并选用L₉(3³)正交表安排试验，实验设计见表2。每种保护剂配方液加入体积浓度为1％的新鲜菌液(OD₆₀₀＝0.315)，于台式恒温振荡器上混匀 (300r/min，30min)，分别按2mL/瓶分装于无菌西林瓶中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数见表3。以保护率为指标，得出保护率最高的保护剂配方。

保护率B₁计算公式：

式中：C₁为冻干前菌数(CFU/mL)；C₂为冻干后菌数(CFU/mL)

表1单因素水平设计

水平	L	P	G	M	T
						1	5％	4％	3％	30％	5％
2	6％	5％	4％	40％	10％
						3	7％	6％	5％	50％	15％

注：每种保护剂冻干管加纯水补充体积至2mL。

表2正交试验设计

试验序号	T	M	P
				1	1	1	1
2	1	2	3
				3	1	3	2
4	2	1	3
				5	2	2	2
6	2	3	1
				7	3	1	2
8	3	2	1
				9	3	3	3

注：保护剂均用纯水配制，盛于高压灭菌瓶，115℃高压灭菌30min。

表3冷冻干燥参数设计

注：INDF为当前运行程序不停止。

1.3.5混悬液的配制

基质与无菌水混合后称为基质悬液，基质悬液与配方保护剂混合后称为混悬液，根据基质脱水率(估为76.23％)，设计混悬液的配制方案见表4。新鲜菌液 (OD₆₀₀nm＝0.335)按体积1％添加至混悬液，按2mL/瓶分装西林瓶，放-72℃预冻24h，再放入冷冻干燥机抽真空制成冻干粉。冻干程序参数见表5。根据混悬液保护率B3/％，计算公式B3/％＝1-Xn，Xn参见公式(2)，选择最优配制方式。

冻干后样品复原方法：样品于室温(22℃)条件下放置10min，加2mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水，静置10min。

表4混悬液的配制设计

表5冷冻干燥参数设计

注：INDF为当前运行程序不停止。

1.3.6混悬液含菌数的确定

1.3.6.1冻干样品含菌数短期下降率

按照1.3.5得出的最优混悬液配制方式配制100mL混悬液，根据保护率B₂及新鲜菌液含菌数，设计混悬液含菌数(添加混悬液体积1％的菌液)。充分混匀后按2mL/瓶分装于西林瓶中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数见表3。

冻干后样品于-70℃条件保存，并分别于0、7、14、28、40天时取样计数，计算冻干样品菌数的短期下降率X_n。

菌数下降率X_n的计算公式为：

式中：C₀为冻干后当日菌数(CFU/瓶)；C_n为-70℃条件下存储n天后的菌数(CFU/瓶)；X_n为第n天菌数下降率(％)

1.3.6.2混悬液菌数的确定

标准物质含菌数预期值为：100～350CFU/瓶。根据保护率B₂及X₄₀，计算混悬液含菌数。

例：最小混悬液含菌数Y₁的计算公式为：

1.3.7批量制备标准物质冻干样品

按照上述工艺流程制备6个批次，每批次100个样品，共计600个样品，批次编号为：SH1～SH6，固定铝盖后存于-70℃待测。

1.3.8副溶血性弧菌的验证

对制备后的冻干样品利用VITEK2程序进行副溶血性弧菌的鉴定。

1.3.9均匀性验证

按随机表抽样，每批样品抽取15瓶，在控制同样实验条件下进行检测样品的含菌数(CFU/瓶)，对结果进行方差分析。

1.3.10冻干样品的定值

定值结果表示为：标准值±总不确定度。标准值参考1.3.9结果。

1.3.10.1菌落总数计数方法的不确定度评估

将新鲜培养菌液，稀释至适当浓度，吸取1mL于平板计数，平行两次，以结果的对数值进行验证，用合并样本标准差来评估计数带来的不确定度。

1.3.10.2样品定值方法不确定度评估

按随机表取样品10份，每份样品平行测量2次，用结果的对数值进行验证。

1.3.10.3电子天平及移液器的不确定度评估

参照文献及校准所依据的JJG 646-2006《移液器检定规程》、JJG 1036-2008 《电子天平检定规程》对电子天平及移液器精选校准。

1.3.11冻干样品稳定性统计检验

将样品存储在-70℃环境中，于存储0、7、14、28、40、60、90、120、180、 270、360天时分别取出6瓶进行分析。

2结果与分析

2.1菌液OD₆₀₀值及对应的菌数范围

表6 OD₆₀₀值对应的菌数

对新鲜菌液进行OD₆₀₀值检测，根据表6评估菌液的含菌数以方便实验安排。

2.2保护剂正交试验结果

表7正交试验结果

由表7结果可知，8号保护剂配方的保护率最高，B1为1.25％，标准差为 0.045％，选择该保护剂配方作为冻干保护剂。

2.3混悬液的保护率

表8混悬液的保护率

由表8结果可知，9号配制结果：B2为0.06％，标准差为0.048％，选用9 号方案制备混悬液。

2.4副溶血性弧菌验证

VITEK2生化鉴定结果是99％为Vibrio Parahemolyticus，结果判定为Excellentidentifiation。

2.5冻干样品含菌数短期下降率

根据公式2计算菌数下降率X_n，结果见表9。

表9菌数下降率(％)

由表9结果可知样品冻干后菌数从第14天到第40天相对稳定，

2.5均匀性验证

将样品于制备完成的第40天在同一试验条件下进行检测，6个批次记为： m₁～m ₆，每批次抽取15个样品，记为：n₁～n₁₅，检测结果见表10。

表10样品的含菌数(CFU/瓶)

由表10结果可知：

测试总平均值：测试总次数：

注：其中为每批次15个平行的测试结果平均值。

批次间方差和：组间自由度：v₁＝m-1＝5

批次间方差无偏估计：

批次内方差和：组内自由度：v₂＝N-m＝84

批次内方差无偏估计：

将值带入公式后得统计量：

该统计量是自由度(v₁,v₂)的F分布变量。根据自由度及给定的显著性水平α＝0.05，查得F＝1.505<F_α＝2.201，则组内和组间无显著性差异，即样品均匀。

2.6冻干样品的定值

2.6.1冻干样品的标准值

样品的标准值采用均匀性实验的计数结果，即标准值＝266CFU/瓶。

2.6.2样品的不确定度评估

2.6.2.1菌落计数方法不确定度的评估结果

表11计数方法不确定度的检测结果

根据贝塞尔计算公式，计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差 S_p，以评估计数方法带来的不确定度。

根据公式：计算每个样品检测结果的残差值ν_i，并进一步计算样品检测结果的残差平方及残差平方和计算结果见表12。

表12检测结果的残差平方及残差平方和

根据贝塞尔计算公式，可计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差：

其中，m为检测的样本数，即m＝10；n为每个样品重复检测的次数，即 n＝2，总体合成的样本差：则扩展不确定度：U1＝t×Uc；取置信水平95％，f(自由度)＝10，经过查t分布表得：t0.05(10)＝2.228；则U1＝2.228×0.013589608＝0.03027764。对于结果计数的对数值，由计数方法带来的不确定度可忽略不计。

2.7.2.2标准物质定值的不确定度评估结果

取不同批次的冻干标准物质10份(于-70℃存储40天)，每份样品平行测量 2次，计数结果见表13。

表13定值方法不确定度的计数结果

根据贝塞尔计算公式，计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差 S_p，以评估计数方法带来的不确定度。

根据公式：计算每个样品检测结果的残差值ν_i，并进一步计算残差平方及残差平方和计算结果见表14

表14检测结果的残差平方及残差平方和

根据贝塞尔计算公式，可计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差：

其中，m为检测的样本数，即m＝10；n为每个样品重复检测的次数，即n＝2。

总体合成的样本差：则扩展不确定度：U₂＝t×U_c；取置信水平95％，f(自由度)＝10，经过查t分布表得：t_0.05(10)＝2.228；则 U₂＝2.228×5.312721＝11.83674CFU/瓶，取整数则U＝12CFU/瓶。

当测量检验结果用2次测量值平均值表示结果时，其值分布区间至±12CFU/瓶之间。这个取值的区间适用于每一次测量。

2.7.2.3移液器和电子天平的不确定度

移液器本次校准容量相对误差测量结果的扩展不确定度：U＝0.1％(k＝2)；电子天平扩展不确定度U＝2.7934mg。故本标准物质定值中移液器和电子天平的不确定度可忽略不计。

2.8样品的稳定性

样品存储在-70℃，每个时间取6瓶检测，以平均值作为检测数值，结果见表15。

表15冻干样品的稳定性测量数据

注：所有天数含菌数的下降率均是与0天含菌数比值

以时间(d)为横坐标以瓶内下降率(％)为纵坐标绘制曲线如图1。

表16冻干样品的稳定性测量数据方差分析结果

时间(天)	样品数	含菌量(CFU/瓶)
			14	6	291±7
28	6	278±6
			40	6	286±5
60	6	291±6
			90	6	285±5
120	6	277±4
			180	6	281±5
270	6	287±6
			360	6	279±8

注：各处理数据未标肩标或有相同肩标者为差异不显著；大写英文字母表示0.01水平；小写英文字母不同表示0.05水平；表中数据为±SD。

表15中数据显示，保存第14天前，由于冷冻干燥后，样品性状不稳定，细菌对环境温度的变化敏感，样品含菌数下降幅度大，从最初的920CFU/瓶下降到290CFU/瓶；而之后360天稳定在279CFU/瓶。对第14日起的9组数据进行方差分析，结果见表16。其中从第14日起的9个不同保存时间测得的菌含量差异不显著，表明制备的标准物质在-70℃条件下保存第14日至第360日之间其特性值是稳定的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：

1）保存液的配制：将副溶血性弧菌标准菌株冻干粉用3%氯化钠碱性蛋白胨水溶解后于36±1 ℃培养8～18 h，后于弧菌显色培养基平板上划线分离，在36±1 ℃恒温培养18～24h；然后挑取单菌落接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1 ℃培养8～18 h；吸取500 μL菌液于无菌离心管中，加入500 μL质量浓度为40%的无菌甘油，混合，制成保存液；

2）基质预处理：鱼肉剔除脂肪组织和筋，冷冻干燥后脱水率为76%。然后将脱水鱼肉粉碎至组织细度为50目，采用⁶⁰Coγ辐射灭菌后分装备用；

3）混悬液的配制：按1g鱼肉基质加入9mL无菌水的比例，将预处理后的鱼肉基质与水混合成基质悬液，再加入其3倍体积的保护剂，混合制得混悬液；

4）标准物质的制备：取步骤1）制备的保存液20 μL加于200 mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中36±1 ℃下进行培养，并利用多功能酶标仪定时取样测定培养液的OD_{600 nm}值，当OD_{600 nm}为0.335±0.1时停止培养，得新鲜菌液，然后将新鲜菌液按混悬液体积浓度1%加入到步骤3）制得的混悬液中，于恒温振荡器上300r/min摇匀30min，再按2mL/瓶进行分装，其含菌量为4.5×10⁴~6.1×10⁴CFU/mL，最后经冷冻干燥，制得标准物质；

5）检验：将所得标准物质进行菌种鉴定、均匀性验证、定值、稳定性检验，制得成品。

2.根据权利要求1所述含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其特征在于：步骤1）所得保存液的平均菌数为5.3×10⁸CFU/mL。

3.根据权利要求1所述含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其特征在于：步骤2）所用鱼肉需先经检测不含抗生素；所用⁶⁰Coγ的辐射剂量为6KGY。

4.根据权利要求1所述含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其特征在于：步骤3）所述保护剂是将脱脂乳、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和水按体积比6:10:1:3混合而成。

5.根据权利要求1所述含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其特征在于：步骤4）经冷冻干燥后所得标准物质中含菌量为100~350 CFU/瓶。