CN111850149A

CN111850149A - 一种副溶血弧菌核酸检测质粒dna参考样品、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN111850149A
Application number: CN202010781163.3A
Authority: CN
Inventors: 许龙岩; 陈瑶; 袁慕云; 郝文波; 刘二龙
Original assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Current assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明公开了一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，属于微生物检测领域，该参考样品采用包含来源于不同副溶血弧菌菌株的tdh、trh、tlh及toxR基因的片段插入质粒中形成，各基因以1:1比例串联，基因间以不相关的基因片段进行隔开；本参考品包含明确的tdh、trh、tlh及toxR四种检测基因，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测，还可以作为量值可溯源的参考品进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价。

Description

一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种副溶血弧菌核酸检测质粒 DNA参考样品、制备方法及其应用。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种革兰氏阴性嗜盐性细菌，大量分布在近海岸的海水、海底沉积物和海产品中。目前，已成为许多沿海国家细菌性食物中毒的首位病原菌。同时也是引起我国沿海地区细菌性食物中毒的首位食源性致病菌，是全国食源性疾病微生物病因的主要致病物质之一。目前，由VP引起的食源性疾病已超过沙门氏菌，跃居于食源性致病菌的首位，成为当前世界上分布最广泛、最常见的疾病之一，是国内外极为重视的公共卫生安全问题之一。

VP致病性主要通过与宿主细胞的相互作用体现，一系列研究表明致病性 VP的毒力因子主要有溶血性毒素、脂多糖、尿素酶等。其中，溶血素类毒力因子包括耐热直接溶血素Tdh、不耐热直接溶血素Tlh、和耐热直接相关溶血素Trh，分别由tdh、tlh、trh基因编码。其中，Tdh能使人或兔红细胞发生溶血，称为“神奈川现象”，该现象常用于VP的传统检测方法。Trh具有与Tdh相似的毒性，如致死和肠毒素作用，但却缺乏溶血功能。近90％的临床分离株存在tdh、trh 基因或者两者皆有。Tlh和卵磷脂结合可以使羊的红细胞溶血。而ToxR是由一个跨膜调节蛋白的toxR基因编码，能刺激Tdh。

VP的检测方法主要分为传统检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法三类。传统检测方法要进行增菌、分离、生化鉴定、血清学鉴定及神奈川试验，虽然该方法成熟可靠，但操作繁琐、费时费力。免疫学检测方法主要通过过高特异性的抗体捕获目标菌，借由酶联免疫吸附反应、免疫色谱检测、免疫传感器等技术实现病原菌的富集和快速检测，该方法特异性强、检测效果好、灵敏度高于传统检测方法，但相比于分子生物学检测方法仍有不足。分子生物学检测方法主要有PCR法、LAMP、DNA杂交法、适配体传感器检测法等，该方法效率高、灵敏度高、特异性强，但对技术和设备要求较高。

目前，缺乏针对VP的核酸检测的质粒DNA参考物质，基因组参考品和各个试剂盒自行研制的小片段核酸是主要的参考物质，但是由于这些参考物质在量值和序列溯源方面无法统一，所以各实验室之间检测结果差异较大，缺乏可比性。

质粒DNA参考物质(pDNA)是一类含有所检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，具有稳定性好、准确度高的特点。它不仅可以在核酸的定性检测中作为阳性对照，还可在定量分析中作为定量标准，构建定量分析的标准曲线。因此，质粒DNA参考物质在核酸检测的可追溯性过程中也可起到关键作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，提高VP核酸检测结果的可比性，为VP的核酸相关检测方面提供技术支持，解决病原核酸检测能力快速发展与缺乏参考材料之间的矛盾。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品，采用包含来源于不同副溶血弧菌菌株的tdh、trh、tlh及toxR全长基因的片段插入质粒中形成；

所述副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；

所述tdh、trh、tlh及toxR基因以等比例串联；

所述tdh、trh、tlh及toxR基因间以不相关的基因片段进行隔开。

进一步地，在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。

进一步地，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。

本发明还提供一种上述的副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，包括：

人工合成副溶血弧菌基因tdh、trh、tlh及toxR，基因之间用所述不相关的基因片段间隔；

合成后克隆插入质粒中，经副溶血弧菌扩增后，提取并提纯质粒；

测定浓度并分装；-70℃预冻，经升华和再干燥后，得到冻干粉，即所述副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品。

进一步地，所述质粒为pUC57载体质粒。

进一步地，所述方法还包括对核酸标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的质粒参考品包含完整和准确的目的DNA。

本发明还提供一种上述的副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品在检测副溶血弧菌中的应用。

进一步地，在进行副溶血弧菌检测时，所述副溶血弧菌核酸检测质粒DNA 参考样品作为参考品或对照品。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明用于检测副溶血弧菌的参考品针对生物制品成品、中间品及其原料中副溶血弧菌tdh、trh、tlh及toxR四种检测基因的检测，提供统一参考品。

(2)相对于现有的副溶血弧菌基因组参考品，所有遗传信息只来源于单一菌株，而单一菌株往往未能包含所有的待检测靶标，所包含的检测靶标无法进行定量分析的情况，本参考品所包含明确的tdh、trh、tlh及toxR四种检测基因，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测，还可以作为进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价的参考品。

(3)本发明用于检测副溶血弧菌的参考品经测序检测其基因序列，明确物种是副溶血弧菌，而后经三家以上实验室协作标定确定参考品的量值，并研究其均一性，稳定性等信息；参考品序列、均一性稳定性等信息均有明确信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为质粒DNA标准物质pDNA Vibrio parahaemolyticus的图谱；

图2为质粒DNA标准物质pDNA Vibrio parahaemolyticus建立的实时荧光 PCR标准曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中所述的“份”如无特别说明，均按质量份计。

发明历程

传统的基因检测标准物质通常为病原体基因组核酸提取物，但是由于生物安全性的问题，以及量值难以溯源的问题，往往难以有效地对核酸检测的效果进行评价，各个实验室之间的结果也难以进行比对。而且随着对检测要求的提高，在鉴定中需要同时对副溶血弧菌包括各种毒力基因在内的多种靶标进行同时检测，但有些菌株只携带tdh基因或trh基因，或是两者都没有。在实际检测中，经常需要使用几种不同菌株的基因组作为参考材料，这为实验操作增加了难度和强度。因此亟需研制新型核酸参考材料。

人工DNA合成技术为核酸参考物质的制备提供了新思路，可以通过人工合成来获得完整的基因，并实现将多个检测靶标自由组合起来作为检测靶标。

在此项研究中，本发明选择将副溶血性弧菌的毒力基因tdh、trh、tlh、toxR 通过串联的方式克隆到了重组质粒上，以实现一种核酸参考物质涵盖多个检测目的基因的目标。为了验证这种质粒核酸参考材料能够符合核酸检测的需要，本发明按照《一级标准物质技术规范》的要求，对其序列的准确性，量值的可溯源性，以及纯度、均匀性、稳定性等方面进行了一系列的考察。结果显示本发明制备的副溶血性弧菌tdh、trh、tlh及toxR基因检测质粒DNA参考物质序列正确，纯度良好，均匀性、稳定性满足《一级标准物质技术规范》要求，通过联合定值的方式，使得标准品的量值可以溯源。本品作为核酸参考物质，可用于PCR检验作为阳性对照或是定量标准在任何使用实时定量PCR仪器的研究实验室中对副溶血性弧菌进行相关的鉴定和检测。值得一提的是，本发明比对了质粒DNA核酸参考品和基因组核酸参考品的性能，结果提示使用基因组DNA 和质粒DNA参考样品作为模板生成的标准曲线非常吻合，换而言之，该质粒 DNA参考样品可以代替副溶血性弧菌基因组DNA用于副溶血性弧菌的定量检测。

因此，副溶血性弧菌tdh、trh、tlh及toxR基因检测质粒DNA参考物质的研制，为副溶血性弧菌的相关核酸检测提供了量值溯源的参照标准，为副溶血性弧菌检测实验室的质量控制提供了有力保障。该质粒DNA参考物质的推广应用，可进一步提高各实验室副溶血性弧菌相关检测项目的水平和效率，保障各实验室测量结果的可比性，准确性，提升各实验室间检测结果的认可度。

实施例1质粒的合成、片段设计和克隆

1.片段设计

人工合成副溶血性弧菌检测常用的目的基因序列tdh(LOCUS BA000032)、 trh(GenBank:GU971654.1)、tlh(GenBank:EF640376.1)、toxR(847892-848770 LOCUSAB063113)，作为检测靶标片段。单个基因的核酸序列可在NCBI网站 (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载，并通过序列比对保证选取基因具有明确的代表性和通用性。

2.质粒的构建

将四个基因以1：1的比例串联在一起(以不相关的基因片段aagtcg隔开)，通过全基因人工合成的方法(由上海吉玛生物科技工程有限公司负责进行)并克隆到pUC57中以形成重组质粒(化学合成的双链DNA片段的长度为2469bp，整个质粒的长度酶切和测序鉴定重组质粒，扩增纯化后用于进一步实验，如图1 所示。

3.质粒的鉴定：

质粒提取纯化后(质粒大量提取试剂盒(OMEGA)，经酶切鉴定和测序证实，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，重组质粒中插入片段的序列准确度为100％，符合预期，命名为pDNA Vibrio parahaemolyticus。由此，获得了高纯度的质粒 DNA标准物质。

4.质粒的纯化

紫外分光光度法鉴别质粒DNA标准物质纯度：将获得的质粒DNA标准物质pDNAVibrio parahaemolyticus进行紫外光谱扫描，结果表明，通过紫外法测的pDNA的A₂₆₀/A₂₈₀的比值为1.897±0.236，比值在1.8-2.0间，且A₂₆₀/A₂₃₀的比值大于2.0。因此，可以表明pDNA纯度良好，无乙醇、蛋白质或RNA污染。

实施例2均一度、定值和保存期的测定

1.pDNA均一性的判定

均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。均匀性良好的质粒DNA标准物质，其量值不会受到分装等因素的影响，才能保证了检测结果的可靠性。为了满足国家标准材料技术规范的要求，本发明使用紫外法(最小采样量为1μL)分析pNDA的瓶间均匀度和瓶内均匀度，并通过F 检验对数据进行了分析。

1)瓶间均匀度取样方法：为了进行瓶间均质性测试，随机选择10管pDNA，并用UV重复测量每管中提取的1μL样品3次，取平均值。

2)瓶内均匀度取样方法：随机选择9管pDNA，并从每管样品的上层，中层和下层提取1μL测试样品，根据方差分析(F-测试)。

3)检测方法：紫外分光光度法用于定量样品DNA含量检测。

4)检测结果：通过方差分析(F检验法)分析测量结果并进行判断。统计分析结果表明，在95％置信水平下，F检验在此基础上F<F0.05，判断pDNA的性质值在瓶内均质性上无显著差异，表明该pDNA Vibrio parahaemolyticus在均匀性方面满足qPCR的参考材料的质量要求。瓶间不均匀性所产生的标准偏差最终需要合成到标准不确定度中。

具体的统计数据在表1中示出。

表1 pDNA Vibrio parahaemolyticus均质性统计分析结果

2.pDNA的稳定性

最常见的长期稳定保存条件之一是在-20℃的温度下作为核酸参考物质的特异保存条件。因此，pDNA Vibrio parahaemolyticus样品在保存条件下的紫外光谱监测时间长达12个月。

1.为了进行稳定性研究，制备了以下的批量DNA制剂：

为了进行稳定性研究，将质粒DNA(在TE缓冲液中：10mMTris–HCl[p H 8.0]和1mM乙二胺四乙酸[EDTA])储存在-20℃以便长期保存。确保分装好的每个样品都包含足够的DNA，浓度为30μg/mL(由260nm的紫外吸光度确定)，每管0.1mL。每个样品都包含足够的DNA，浓度为30μg/ml(由260nm的UV 吸光度确定)。使用260nm处的吸光度对所有DNA制备物进行定量，并使用A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀的值对可能的污染物进行分析。

2.取样：在实施例1制备的质粒DNA标准物质pDNAVibrio parahaemolyt icus制备完成后的一年内每月一次对制备的质粒DNA标准物质pDNAVibrio p arahaemolyticus(在-20℃下保存)随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，取平均值，进行长期稳定性考察。

3.统计分析：根据ISO指南35(https：//www.iso.org/standard/60281.html) 使用该数据评估长时间保存的稳定性。直线斜率可用下式计算：

式中：X_i-第i个时间点；Y_i-第i个时间点的观测值；

-所有时间点的平均值；

-所有观测值的平均值。

截距可由下式计算：

直线上每点的标准偏差可用下式计算：

式中：X_i-第i个时间点；Y_i-第i个时间点的观测值；β₁，β₀-回归系数；n- 测量系数。β₁的标准偏差由下式给出：

基于β₁的标准偏差，可用t-检测进行以下判断：即若|β₁|<t0.95,n-2·s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。

经统计学分析，结果表明|β₁|＜t0.95，n－2·S(β₁)，结果显示斜率不显著，如表2所示，表明质粒DNA标准物质pDNAVibrio parahaemolyticus在规定时间内无明显的上升或下降趋势，且变化范围均在特性量值及其不确定度的范围内。

表2 pDNA Vibrio parahaemolyticus长期保存稳定性分析结果

3.pDNA的定值

1)8个实验室用UV方法共同测定pDNAVibrio parahaemolyticus量值；

2)通过统计检查确认每组数据没有异常值和显著差异：汇总全部原始数据，用偏态系数和峰态系数法检验得知全部原始数据符合正态分布；

3)将8个平均值再次计算平均值，求出质粒DNA标准物质pDNA Vibrioparahaemolyticus的总平均值为29.62μg/ml，即为质粒DNA标准物质pDNA Vi brioparahaemolyticus的标准值(单位：μg/ml)。

4)根据各质粒分子的分子量，计算得出质粒DNA标准物质，下式用于计算每微升pDNA Vibrio parahaemolyticus的拷贝数。

pDNA Vibrio parahaemolyticus的拷贝数为1.54×10⁸copies/μl。

4.pDNA的不确定性分析

pDNA的不确定度包括来自于分装引入的不确定度(uh)、长期保存稳定性引入的不确定度(us)、定值时引入的不确定度(uq)。

1)分装引入不确定度(uh)的计算：利用瓶间均匀性数据进行分装引入的不确定度的计算；

根据以下公式计算pDNA Vibrio parahaemolyticus的分装引起的不确定性(uh)：

Q1(组间方差之和)是29.06；Q2(组内方差之和)是16.93；v1是9组之间的自由度；v2是20组内的自由度；

最终计算得出的分装引入的不确定度为0.892μg/mL，相对不确定度为3.0 1％。

2)长期保存稳定性引入的不确定度(us)根据以下公式计算pDNA Vibrio parahaemolyticus在12个月内的长期稳定性引起的不确定性(us)：

us＝S(β₁)×N；

S(β₁)是稳定性线性模型中斜率的标准偏差，S(β₁)＝0.101；N是稳定性评估的时间，N＝12个月；

最终计算得出的稳定性不确定度为1.212μg/mL，相对不确定度为4.09％。

3)定值时引入的不确定度(uq)的计算：

参考ISO指南35，对pDNA的不确定度进行评估。

因此，根据统计公式计算出的不确定度(uq)根据以下公式计算：

s为0.835μg/mL的总平均值的标准偏差；p为实验数量8。

最终统计方法计算出的不确定度为0.296μg/mL,相对不确定度为0.99％。

4)综合不确定度的计算：

经统计计算，质粒DNA参考材料的相对不确定度成分为：均质性(urh)引起的相对不确定度3.01％，有效期内变异性引起的相对不确定度(urs)4.09％，定量过程引入的相对不确定度(urq)0.99％，然后按照以下公式计算参考物质的标准不确定度(Ucrm)：

计算扩展不确定度时，应将标准不确定度乘以包含因子(k＝2)。所以，扩展相对不确定度计按以下公式计算：

U＝Ucrm*k

结果表明：最终计算得到标准不确定度(Ucrm)为1.534μg/mL，扩展不确定度(U)为3.068μg/mL(k＝2)。

实施例3荧光定量标准曲线的制备

1.对pDNA进行倍比稀释

通过A₂₆₀提取pDNA参考品并进行定量，基于5179bp估算pDNA Vibrioparahaemolyticus的拷贝数。

定量后，使用pDNA Vibrio parahaemolyticus制备10倍稀释系列制备2×10 ⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²和2×10¹copies/ml稀释的样品。

2.qPCR反应条件

qPCR的五点标准曲线是使用从pDNA提取的1μl样品的10倍系列稀释液生成的。引物序列和扩增子大小见表3。PCR分析使用ABI SYBR FASTqPCR Master Mix(2X)(NEWEngland Biolabs，UK)，在八联管中以25μl体积进行 PCR反应，每个反应均含10pM引物。PCR方案如下：分别在94℃下10分钟和94℃下15s，在55℃下45s进行40个循环。

表3 tdh、trh、tlh和toxR基因的引物和探针序列

3.标准曲线的建立

每个反应重复3次，并根据Ct值与模板浓度之间的关系建立标准曲线以估计检测限(LOD)，定量限(LOQ)，扩增效率(e)和斜率(K)。各标准曲线的线性相关系数如表4所示。在本发明中，结果发现，这些标准曲线的相关系数均达到0.99，线性良好，表明pDNA Vibrioparahaemolyticus作为qPCR参考品的可靠性，可用于作为用于检测副溶血弧菌的目标基因序列的QPCR扩增的阳性标准材料。

表4副溶血弧菌pDNA建立的标准曲线数据

实施例4质粒DNA参考物质与副溶血性弧菌基因组DNA(gDNA)的可替代性研究

本实施例通过使用基因组标准品分别以梯度稀释的gDNA和质粒DNA参考物质为模板绘制标准曲线，每条标准曲线重复6次。根据统计学原理分析每个标准曲线的线性相关系数和斜率(t检验)。如表5所示，通过评估斜率和截距，在95％置信度下，可认为gDNA建立的标准曲线与质粒DNA参考物质建立的标准曲线之间没有显著差异(P<0.05)。结果表明，可以使用质粒DNA参考物质代替gDNA来进行副溶血性弧菌相关检测。

表5副溶血弧菌pDNA和gDNA标准品代替性研究

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广州海关技术中心

<120> 一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2469

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atgactaaca tcggcaccaa atttctactt gctcaaaggt ttacctttga tccaaatagt 60

aattcgctcg ctgaccaaca aagcggcaac gaagttgtac gattaggaag caacgaaagc 120

cgtatactcc tgatgttggc ggagagacca aacgaagttt taacccgtaa cgagcttcac 180

gagtttgttt ggcgtgagca aggttttgag gtggatgact caagcctgac tcaagcgatt 240

tctactctgc gtaagatgtt gaaggattca accaaatctc cagagtttgt taaaaccgtt 300

ccaaaacgag gctatcaact catttgtact gttgaacgcc taagcccgct ttcttcagac 360

tcaagctcaa ttgaagttga agagccagct tctgataaca atgacgcctc tgctaatgag 420

gtagaaacaa tcgtagagcc gtctttagcg acgacttctg acgcaatcgt tgaaccagaa 480

gcgccagtag tacctgaaaa agcacctgtg gcttctgctg tgaatccttg gattccacgc 540

gttattttat ttttggcact attactaccg atttgcgtac tgctgtttac aaacccagcg 600

gaatctcagt tccgtcagat tggtgagtat cagaacgtac cagtgatgac acctgtaaat 660

cacccgcaaa tcaacaactg gttgccttct attgagcagt gcattgaacg ctacgttaag 720

caccatgcag aagactcgtt accagtggaa gtaattgcca ctggcggaca aaataaccag 780

ctgattttga actacattca tgacagcaac cactcgtatg agaacgtgac attgcgtatt 840

ttcgcaggtc aaaatgatcc aacagacatc tgcaaataaa agtcgatgaa actaagactc 900

tactttgctt tcagtttgat attggtttca atgttttcag tatctaaatc attcgcgatt 960

gatctgccat caataccttt tccttctcca gggtcggctg aactgttatt tgttgttaga 1020

aatacaacaa tcaaaactga atccccggtt aaggcaattg tggaggacta ttggacaaac 1080

cgaaacataa aaagaaaacc atacaaagat gtatacggtc aatcggtttt cacaacagca 1140

ggttcaaagt ggttaagcgc ctatatgaca gtaaacatca atggtcataa ctatacgatg 1200

gcagctcttt ctggttataa agatggtatt tctacggtct tcacaaaatc agagaaaaca 1260

agcctaaagc aagactattc ctcggtaaaa tattttgttg atgacaacga agaatcaata 1320

ccaagtgtaa cttatttaga tgaaacatca gaatactttg ttactgtcga ggcatatgag 1380

agcggcaatg gacatatgtt tgttatgtgc atttccaaca aattatcatt tggtgaatgt 1440

aaatcacaaa attaaaagtc gatgaagtac cgatattttg caaaaaaatc atttttattt 1500

atatccatgt tggctgcatt caaaacattt gcctttgagc ttccatctgt cccttttcct 1560

gcccccggtt ctgatgagat attgtttgtt gttcgagata caacttttaa taccaatgca 1620

ccggtcaatg tagaggtctc tgacttttgg acaaaccgta atgtaaaaag aaaaccgtac 1680

aaagatgttt atggtcaatc agtattcaca acgtcaggta ctaaatggct gacatcctac 1740

atgactgtga acattaatga taaagactat acaatggcag cggtgtctgg ctataagcac 1800

ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcagat caagtacagc ttcaacattc ctatgattct 1860

gtagctaact ttgttggtga agatgaagat tctattccaa gtaaaatgta tttggatgaa 1920

actccagaat attttgttaa tgtagaagca tatgagagtg gtagtggtaa tatattggta 1980

atgtgtatat ccaacaaaga atcgtttttt gaatgtaaac atcaacaata aaagtcgtga 2040

agagcaagag acagcagggg tcagcagaag actgcattgt tggatggaca cattggccag 2100

acgcagacga aagcgcctca gtttaagtga ctcaacacaa gaagagatgc gacaaaatgt 2160

cgtgcgctaa gtgcttgaga tgaacgagtg tcatgcaagg cacaagcgat gtactacatg 2220

agcgcaaggt tacaacatca cgttgtttta ttcgtcacgc cttgttcgag acgctaactt 2280

ctgcgccaga agagcacggt ttcgtgaacg cgagcgatcc ttgtttggac atcaaccgct 2340

catcgtctgt cgattacatg tacacccacg cattgcgctc tgagtgtgca gcgtctggtg 2400

ctgagaagtt tgtgttctgg gatgtcacgc atccaacaac agcaactcac cgctatgaat 2460

ttaccttag 2469

Claims

1.一种副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，采用包含来源于不同副溶血弧菌菌株的tdh、trh、tlh及toxR全长基因的片段插入质粒中形成；

所述副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述tdh、trh、tlh及toxR基因以等比例串联；

所述tdh、trh、tlh及toxR基因间以不相关的基因片段进行隔开。

2.根据权利要求1所述的副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。

3.根据权利要求1所述的副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。

4.一种权利要求1-3任一项所述的副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，其特征在于，包括：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述质粒为pUC57载体质粒。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括对核酸标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的质粒参考品包含完整和准确的目的DNA。

7.一种权利要求1-3任一项所述的副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品在检测副溶血弧菌中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在进行副溶血弧菌检测时，所述副溶血弧菌核酸检测质粒DNA参考样品作为参考品或对照品。