CN111850150A

CN111850150A - 一种沙门氏菌核酸检测质粒dna参考样品、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN111850150A
Application number: CN202010781165.2A
Authority: CN
Inventors: 袁慕云; 许龙岩; 陈瑶; 郝文波; 刘二龙
Original assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Current assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，属于微生物检测领域，该参考样品采用包含来源于沙门氏菌的肠伤寒特异性序列se、鼠伤寒特异性序列st以及共有的aceA基因的片段插入质粒中形成，各基因以1:1:1比例串联，基因间以不相关的基因片段进行隔开；本参考品包含明确的se、st、aceA三种检测基因片段，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测，还可以作为量值可溯源的参考品进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价。

Description

一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA 参考样品、制备方法及其应用。

背景技术

沙门菌(salmonella,Sa)属于肠杆菌科，是威胁人类及动物健康的食源性致病微生物，能够引起伤寒、副伤寒、肠胃炎及败血症等严重疾病。在世界各国细菌性食物中毒病例中，其引起的食物中毒常居榜首或第二位。沙门氏菌在日常生活中非常常见，如在生鸡蛋壳、家禽，红肉中，除此之外，被污染的水是全世界沙门氏菌的主要来源。有数据已经证实在发展中国家约有2000万人感染沙门氏菌，同样的在美国，德国等国家也是沙门氏菌的多发地。沙门氏菌的血清型有超过2500种，但是英国的一项调查表明，肠炎沙门菌(salmonellaenteritidis,SE)和鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium,ST)感染占到人类Sa 感染患者的75％以上。因此，快速鉴定并确定沙门氏菌的型别，对食品安全具有重要的意义。

目前沙门氏菌的检测方法在不断的快速发展中，聚合酶链式反应(PCR)等核酸检测技术的不断提升一定程度的克服了传统检测方法耗时长、操作复杂、特异性差等缺点。基于核酸的检测特异性强、灵敏度高、快速等优点已成为食源性病原微生物常规的检测方法之一，在食源性病原微生物检测中发挥着重要的作用。但是目前用于PCR的阳性核酸参考品十分缺乏。要同时进行沙门氏菌的鉴定和型别分析，往往要使用多个基因组参考品才能完成，而基因组参考品中检测靶基因的量值，又难以确定和溯源，因此使用基因组DNA作为参考品，缺点是难以同时为多个靶标提供可溯源的定量参考。因此在检测效果和实验室结果评价方面存在严重不足。

质粒DNA参考物质(pDNA)是一类含有所检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，具有稳定性好、准确度高的特点。它不仅可以在核酸的定性检测中作为阳性对照，还可在定量分析中作为定量标准，构建定量分析的标准曲线。因此，质粒DNA参考物质在核酸检测的可追溯性过程中也可起到关键作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其核苷酸序列如 SEQ IDNo.1所示；

其采用包含来源于不同沙门氏菌菌株的se、st、aceA基因的片段插入质粒中形成；

所述se、st、aceA基因以1:1:1比例串联；

所述se、st、aceA基因间以不相关的基因片段进行隔开。

进一步地，在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。

进一步地，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。

本发明还提供一种上述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，包括：

人工合成沙门氏菌基因se、st、aceA，基因之间用所述不相关的基因片段间隔；

合成后克隆插入质粒中，经沙门氏菌扩增后，提取并提纯质粒；

测定浓度并分装；-70℃预冻，经升华和再干燥后，得到冻干粉，即所述沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品。

进一步地，所述质粒为pUC57载体质粒。

进一步地，所述方法还包括对核酸标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的质粒参考品包含完整和准确的目的DNA。

本发明还提供一种上述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品在检测沙门氏菌中的应用。

进一步地，在进行沙门氏菌检测时，所述沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品作为参考品或对照品。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明的用于检测沙门氏菌的参考品针对生物制品成品、中间品及其原料中沙门氏菌se、st、aceA三种检测靶标序列的检测，提供统一参考品。不仅可以用于沙门氏菌的定性检测，还可以作为鼠伤寒和肠伤寒鉴别的参考品。

(2)相对于现有的沙门氏菌基因组参考品，所有遗传信息只来源于单一菌株，无法在定性检测的同时进行型别检测，需要多个基因组参考品才能准确进行沙门氏菌的鉴定。而且基因组参考品所包含的检测靶标无法进行定量分析的情况，本参考品所包含明确的se、st、aceA三种检测基因，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测和型别鉴定，还可以作为进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价的参考品。

(3)本发明用于检测沙门氏菌的参考品经测序检测其基因序列，明确物种是沙门氏菌来源，而后经三家以上实验室协作标定确定参考品的量值，并研究其均一性，稳定性等信息；参考品序列、均一性稳定性等信息均有明确信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为质粒DNA标准物质pDNA Salmonella的图谱；

图2为质粒DNA标准物质pDNA Salmonella建立的实时荧光PCR标准曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

发明历程

为了能够提供为多个检测靶标进行定性定量参考的参考品，本研究针对沙门菌的aceA基因、肠炎沙门菌特异序列se、鼠伤寒沙门菌的特异性序列st，通过人工合成方法制备了核酸检测参考品，实验结果表明，人工合成的肠炎伤寒沙门氏菌片段准确包含se、st、aceA基因序列，成功插入PUC57质粒后能够在大肠杆菌中稳定扩增。经过多个实验室联合定值后，可获得序列和量值均准确和具有可追溯性的质粒核酸参考品pDNA Salmonella。

在具体的使用过程中，用aceA基因鉴定沙门氏菌，se和st序列用于区别肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌，通过一次荧光PCR扩增就可以确认检测样本是否受到沙门菌、肠炎沙门菌及鼠伤寒沙门菌的污染。

pDNA Salmonella的制备解决了需要鉴别沙门氏菌的型别的时候，需要使用多种基因组核酸参考品的问题。同时，随着人工合成技术的提高，质粒参考品在制备成本和生物安全性上也具有极大的优势。

为了评估pDNA Salmonella作为核酸检测参考品的性能，本发明通过多个实验室联合定值以及均一性，稳定性实验，证实pDNA Salmonella具有良好的稳定性及均一性。符合《一级标准物质技术规范》要求。作为核酸检测的参考品，可为伤寒沙门氏菌的定量及可追溯性提供基础。本发明评价了pDNA Salmonella 替换基因组DNA的可行性，结果表明，使用pDNA Salmonella和基因组DNA 为模板生成的标准曲线吻合，这也证实了其之间可以进行替换。

因此，pDNA Salmonella具有序列准确、纯度高、均匀性和稳定性高的特点，符合《一级标准物质技术规范》的要求，可以在任何使用实时PCR仪器的研究实验室中对沙门氏菌进行常规、可靠的鉴定和病理学特征分类。出于生物安全考虑，除用作qPCR参考材料外，也可作为常规PCR的阳性对照。本发明为人工合成质粒作为病原菌核酸检测参考品的应用提供了实践基础。

实施例1质粒的合成、片段设计和克隆

1.片段设计

序列来源沙门氏菌的aceA(GenBank:U43344.1)、SE特异性序列se(GenBank:AF370707.1)、ST特异性序列st(GenBank:CP001363.1)。单个基因的核酸序列可从NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nih gov/nucleotide))下载，并通过序列比对保证选取基因具有明确的代表性和通用性。

2.质粒的构建

将3个基因以1：1：1的比例串联在一起(以不相关的基因片段aagtcg隔开)，通过全基因人工合成的方法(由上海吉玛生物科技工程有限公司负责进行) 并克隆到pUC57中以形成重组质粒(化学合成的双链DNA片段的长度为829bp，整个质粒的长度酶切和测序鉴定重组质粒，扩增纯化后用于进一步实验，如图1 所示。

3.质粒的鉴定：

质粒提取纯化后(质粒大量提取试剂盒(OMEGA))，经酶切鉴定和测序证实，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，重组质粒中插入片段的序列准确度为100％，符合预期，命名为pDNA Salmonella。由此，获得了高纯度的质粒DNA标准物质。

4.质粒的纯化

紫外分光光度法鉴别质粒DNA标准物质纯度：将获得的质粒DNA标准物质pDNASalmonella进行紫外光谱扫描，结果表明，pDNA的A₂₆₀/A₂₈₀比例为 1.926±0.43，超过1.8，A₂₆₀/A₂₃₀的比例为2.26±0.26，超过2.0，表明pDNA溶液中无乙醇、蛋白质或RNA污染，符合核酸参考物质的标准。

实施例2均一度、定值和保存期的测定

1.pDNA均一性的判定

均一性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。均一性良好的质粒DNA标准物质，其量值不会受到分装等因素的影响，才能保证了检测结果的可靠性。为了满足国家标准材料技术规范的要求，本发明使用紫外法(最小采样量为1μL)分析pNDA的瓶间均匀度和瓶内均匀度，并通过 F检验对数据进行了分析。

1)瓶间均匀度取样方法：为了进行瓶间均质性测试，随机选择10管pDNA，并用UV重复测量每管中提取的1μL样品3次，取平均值。

2)瓶内均匀度取样方法：随机选择10管pDNA，并从每管样品的上层，中层和下层提取1μL测试样品，根据方差分析(F-检验)。

3)检测方法：紫外分光光度法用于定量样品DNA含量。

4)检测结果：通过方差分析(F-检验法)分析测量结果并进行判断。统计分析结果表明，在95％置信水平下，F-检验在此基础上，判断pDNA的性质值在瓶内和瓶间均质性上无显著差异，表明该pDNA在均匀性上满足qPCR的参考材料的要求。具体的统计数据在表1中示出。

表1 pDNA Salmonella均质性统计分析结果

2.pDNA的稳定性

对于核酸类制品最常用的长期稳定保存方式为-20℃低温保存，因此在稳定性检验中采取采用紫外法对其进行了长达12个月的稳定性检测。

1.为了进行稳定性研究，制备了以下的批量DNA制剂：

将pDNA Salmonella(在TE缓冲液中：10mM Tris–HCl[pH 8.0]和1mM 乙二胺四乙酸[EDTA])储存在-20℃以便长期保存。每个样品都包含足够的DNA，浓度为30μg/ml(由260nm的UV吸光度确定)。使用260nm处的吸光度对所有DNA制备物进行定量，并使用260/280和260/230nm处的吸光度比率对可能的污染物进行表征。

2.取样：在实施例1制备的质粒DNA标准物质pDNA Salmonella制备完成后的一年内每月一次对制备的质粒DNA标准物质pDNA Salmonella(在-20℃下保存)随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，取平均值，进行长期稳定性考察。

3.统计分析：根据ISO指南35(https：//www.iso.org/standard/60281.html) 使用该数据评估长时间保存的稳定性。直线斜率可用下式计算：

式中：X_i-第i个时间点；Y_i-第i个时间点的观测值；

-所有时间点的平均值；

-所有观测值的平均值。

截距可由下式计算：

直线上每点的标准偏差可用下式计算：

式中：X_i-第i个时间点；Y_i-第i个时间点的观测值；β₁，β₀-回归系数； n-测量系数。β₁的标准偏差由下式给出：

基于β₁的标准偏差，可用t-检测进行以下判断：即若|β₁|<t0.95,n-2·s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。

经统计学分析，结果表明|β₁|＜t0.95，n－2·S(β₁)，结果显示斜率不显著，如表2所示，表明质粒DNA标准物质pDNA Salmonella在规定时间内无明显的上升或下降趋势，且变化范围均在特性量值及其不确定度的范围内。

表2 pDNA Salmonella长期保存稳定性分析结果

3.pDNA的定值

1)8个实验室用UV方法共同测定pDNA Salmonella量值；

2)通过统计检查确认每组数据没有异常值和显著差异：汇总全部原始数据，用偏态系数和峰态系数法检验得知全部原始数据符合正态分布；

3)将8个平均值再次计算平均值，求出质粒DNA标准物质pDNA Salmonella 的总平均值为30.08μg/ml，即为质粒DNA标准物质pDNA Salmonella的标准值(单位：μg/ml)。

4)根据各质粒分子的分子量，计算得出质粒DNA标准物质，下式用于计算每微升pDNA Salmonella的拷贝数。

pDNA Salmonella的拷贝数为7.706×10⁸copies/μl。

4.pDNA的不确定性分析

pDNA的不确定度包括来自于分装引入的不确定度(uh)、长期保存稳定性引入的不确定度(us)、定值时引入的不确定度(uq)。

1)分装引入不确定度(uh)的计算：利用瓶间均匀性数据进行分装引入的不确定度的计算；

根据以下公式计算pDNA Salmonella的分装引起的不确定性(uh)：

Q1(组间方差之和)是1.783；Q2(组内方差之和)是3.273；v1是9组之间的自由度；v2是20组内的自由度；

最终计算得出的分装引入的不确定度为0.586ug/ml，相对不确定度为1.94％。

2)长期保存稳定性引入的不确定度(us)根据以下公式计算pDNA Salmonella 在12个月内的长期稳定性引起的不确定性(us)：

us＝S(β₁)×N；

S(β₁)是稳定性线性模型中斜率的标准偏差，S(β₁)＝0.055；N是稳定性评估的时间，N＝12个月；

最终计算得出的稳定性不确定度为1.66ug/ml，相对不确定度为5.51％。

3)定值时引入的不确定度(uq)的计算：

参考ISO指南35，对pDNA的不确定度进行评估。

因此，根据统计公式计算出的不确定度(uq)根据以下公式计算：

s为1.016μg/mL的总平均值的标准偏差；p为实验数量8。

最终统计方法计算出的不确定度为0.3592μg/mL,相对不确定度为1.19％。

4)综合不确定度的计算：

经统计计算，质粒DNA参考材料的相对不确定度成分为：均质性(urh)引起的相对不确定度1.94％，有效期内变异性引起的相对不确定度(urs)5.51％，定量过程引入的相对不确定度(urq)1.19％，然后按照以下公式计算参考物质的标准不确定度(Ucrm)：

计算扩展不确定度时，应将标准不确定度乘以包含因子(k＝2)。所以，扩展相对不确定度计按以下公式计算：

U＝Ucrm*k

结果表明：最终计算得到标准不确定度(Ucrm)为1.7966μg/mL，扩展不确定度(U)为3.5932μg/mL(k＝2)。

实施例3荧光定量标准曲线的制备

1.对pDNA进行倍比稀释

通过A₂₆₀提取pDNA参考品并进行定量，基于3539bp估算pDNA Salmonella 的拷贝数。

定量后，使用pDNA Salmonella制备10倍稀释系列制备2×10⁶、2×10⁵、2 ×10⁴、2×10³、2×10²和2×10¹copies/ml稀释的样品。

2.qPCR反应条件

qPCR的五点标准曲线是使用从pDNA提取的1μl样品的10倍系列稀释液生成的。引物序列和扩增子大小见表3。PCR分析使用ABI SYBR FASTqPCR Master Mix(2X)(NEWEngland Biolabs，UK)，在八联管中以25μl体积进行 PCR反应，每个反应均含10pM引物。PCR方案如下：分别在94℃下10分钟和95℃下30s，在55℃下45s进行40个循环。

表3荧光定量PCR引物序列

3.标准曲线的建立

每个反应重复3次，并根据Ct值与模板浓度之间的关系建立标准曲线以估计检测限(LOD)，定量限(LOQ),扩增效率(e)和斜率(K)。各标准曲线的线性相关系数如表4所示。在本发明中，结果发现，这些标准曲线的相关系数均达到0.99，线性良好，表明pDNASalmonella作为qPCR参考品的可靠性，可用于作为用于检测沙门氏菌的目标基因序列的QPCR扩增的阳性标准材料。

表4标准曲线的斜率、相关系数、扩增效率和检测下限

实施例4质粒DNA参考物质与沙门氏菌基因组DNA(gDNA)的可替代性研究

本实施例通过使用基因组标准品分别以梯度稀释的gDNA和质粒DNA参考物质为模板绘制标准曲线，每条标准曲线重复6次。根据统计学原理分析每个标准曲线的线性相关系数和斜率(t检验)。如表5所示，通过评估斜率和截距，在95％置信度下，可认为gDNA建立的标准曲线与质粒DNA参考物质建立的标准曲线之间没有显著差异(P<0.05)。结果表明，可以使用质粒DNA参考物质代替gDNA来进行沙门氏菌相关检测。

表5沙门氏菌pDNA和gDNA标准品代替性研究

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广州海关技术中心

<120> 一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 829

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gatatcagtg taatacttat tggttagatc ggtatgatct tgaatatttt tatatcgata 60

gtttggatta catagtagag ttatttcact ttgcaataca gctttaatta tagttttgtc 120

aagttgtaat ttatctataa aaatattatt tatagtattt tctattagga gaagtgtttc 180

gactaacttg atatttgtat tgattttttg tttgtagata ttccgtagca attgagttga 240

attgtgttca agcaatggtg aacaaacata atcccatgat tgctcttgag agtcccagtc 300

atttttagct atttcaatag cattggtgac taattcgata atttcatctt caatttctgg 360

atatggtact gaggctaatt caccactagt aaagctaagt gtgggggcta gtattgataa 420

ataatggttt acaaccggag tgcacattaa tcccgcagcg taaagcaact catttttgtt 480

atttgaaaag aagtcggatc tatcctaatg aaaataaatg tgttttatct gatgcaagag 540

ggggagggag gagctttagc caaaagaaaa ccgccgggag aggcggtttg atgtggttgg 600

ttcgtcactg attttttagg cgcttttgtg cagcgagcat gttctggaaa gcctctttat 660

atagctcatt ctgacctcta agccggtcaa tgagtttttc tttctcagat tcagggagta 720

tatcaaaaag gtttagtaaa tcagcctgtt gtctgctcac cattcgccag ccaccacctt 780

cgaagttgtc atcgtaagta ccagaagaac gaacgtagtt cattagatc 829

Claims

1.一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

其采用包含来源于不同沙门氏菌菌株的肠伤寒特异性序列se、鼠伤寒特异性序列st以及共有的aceA基因的片段插入质粒中形成；

所述se、st、aceA基因以1:1:1比例串联；

所述se、st、aceA基因间以不相关的基因片段进行隔开。

2.根据权利要求1所述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。

3.根据权利要求1所述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。

4.一种权利要求1-3任一项所述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，其特征在于，包括：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述质粒为pUC57载体质粒。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括对核酸标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的质粒参考品包含完整和准确的目的DNA。

7.一种权利要求1-3任一项所述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品在检测沙门氏菌中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在进行沙门氏菌检测时，所述沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品作为参考品或对照品。