CN105087799A - 一组用于鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量pcr检测的特异性引物和探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一组用于鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）-（3）中的一种：（1）上游引物：5ˊ-CAGAATGATGCTGAAGTTGAACAA-3ˊ；下游引物：5ˊ-GCGTGCGGCGATGTTAGTT-3ˊ；探针：5ˊ-？CTTACGGCAGTGGAGCCAGCATCT？-3ˊ；（2）与（1）所述序列互补的序列；（3）将（1）中所述序列向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。应用本发明的引物和探针能够快速、准确、灵敏、特异性好的定量检测待测样本中鼠伤寒沙门氏菌的含量。

Description

一组用于鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针
技术领域
本发明属于微生物检测方法技术领域，具体涉及一组用于鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针。
背景技术
沙门氏菌是肠杆菌科重要的食源性致病菌之一，在我国食物中毒病例中占有较高比率。鼠伤寒沙门氏菌（SalmonellaTyphimurium）是1982年由Loffler从鼠身上分离出的，是最常见的血清型之一。鼠伤寒沙门氏菌以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属于沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，但有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热；对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。鼠伤寒沙门氏菌因其耐药性能强、传播途径广、侵染宿主多等特点，被广泛关注。研究表明，鼠伤寒沙门氏菌具有极强的多重耐药性，对多数抗生素均表现出抵抗能力。
目前生化鉴定与血清分型是鉴定鼠伤寒沙门氏菌最主要方法。此方法需经过增菌培养、选择筛选、生化鉴定、血清分型等流程，耗时一周左右，不利于快速、准确的对鼠伤寒沙门氏菌进行检测。用免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验等方法检测沙门氏菌的结果尚不理想。近年来发展起来的实时荧光定量PCR（FluorescencequantitativePCR）技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题，它相对常规PCR技术先进、操作简便，实现了实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点。
发明内容
本发明的目的在于设计一组用于用于定量测定鼠伤寒沙门氏菌含量的特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于鼠伤寒沙门氏菌检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。本发明采用基因克隆技术，将鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有STM4493基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。
本发明提供一组用于鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）-（3）中的一种：
（1）、上游引物：5'-CAGAATGATGCTGAAGTTGAACAA-3'；
下游引物：5'-GCGTGCGGCGATGTTAGTT-3'；
探针：5'-CTTACGGCAGTGGAGCCAGCATCT-3'；
所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.2；
（2）、与（1）所述序列互补的序列；
（3）、将（1）中所述序列向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
经实验验证，将（1）中所述序列向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的引物序列也能很好的扩增上述目标核苷酸序列。
作为优选方案，所述探针的5’端荧光报告基团是FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。
本发明还提供鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
本发明的第三个目的是提供上述特异性引物和探针、试剂盒在定量检测鼠伤寒沙门氏菌含量中的应用。
本发明的第四个目的是提供鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测方法，步骤如下：
（1）制备标准品：将鼠伤寒沙门氏菌保守基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有鼠伤寒沙门氏菌保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述鼠伤寒沙门氏菌保守基因片段参见序列表中SEQIDNo.1的第447-822位核苷酸序列；
（2）标准曲线绘制；
（3）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；
（4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行鼠伤寒沙门氏菌的快速定量检测。
作为优选方案，所述鼠伤寒沙门氏菌保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：
上游引物为5'-GCCGCACTTTGGAATGTTAT-3'；
下游引物为5'-TCACAATCCCATTTCATTCCAG-3'。
作为又一优选方案，步骤（3）中所述引物和探针的用量均为1.6μl。
作为又一优选方案，步骤（3）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。
本发明提供用于对鼠伤寒沙门氏菌进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样品的RNA反转录得到的cDNA，也可以通过提取鼠伤寒沙门氏菌的基因组DNA，结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量检测标本中鼠伤寒沙门氏菌含量的目的。本发明所提供的引物和探针可对食品中的鼠伤寒沙门氏菌含量进行定性、定量分析，对判断食品中鼠伤寒沙门氏菌的含量具有重要意义，本发明将在食品检测领域发挥重要作用。应用本发明的引物和探针能够快速、准确、灵敏、特异性好的定量检测待测样本中鼠伤寒沙门氏菌的含量。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为引物和探针体系优化实验结果；其中，a代表引物为1.6μl，探针为1.6μl；b代表引物为1.0μl，探针为1.6μl；c代表引物为1.0μl，探针为0.8μl；d代表引物为2.0μl，探针为0.8μl；e代表引物为1.6μl，探针为0.8μl；f代表引物为2.0μl，探针为1.0μl；g代表引物为1.0μl，探针为0.8μl；h代表引物为1.0μl，探针为1.0μl；i代表引物为2.0μl，探针为1.6μl；
图2为灵敏度实验结果；其中，a代表质粒浓度分别为1.00×108copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×107copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×106copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×105copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×104copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×103copies/ml、g代表质粒浓度为1.00×102copies/ml和阴性对照；
图3为特异性实验结果；其中出现标准扩增曲线的为鼠伤寒沙门氏菌质粒，未出现标准扩增曲线的甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、福氏志贺菌、脑膜炎奈瑟菌、幽门螺旋杆菌、阴性对照；
图4为鼠伤寒沙门氏菌标准曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。
实施例1STM4493基因标准品的制备
要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。STM4493基因具有很高的保守性。本研究采用鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因作为靶序列。本实施例主要采用PCR技术扩增鼠伤寒沙门氏菌的STM4493基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-STM4493，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
一、模板DNA的制备
提取鼠伤寒沙门氏菌（标准菌株）基因组DNA，用作STM4493基因PCR扩增的模板：
（1）取1ml菌悬液，8000r/min离心5分钟，弃上清液；
（2）加入10%蔗糖的TE缓冲液400μl悬浮菌液沉淀，混匀后加入20mg/ml的溶菌酶20μl，37℃作用45min；
（3）加入30μl10%SDS和3μl10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；
（4）加入500μl的酚/氯仿/异戊醇（体积比25:24:1）混匀，12000r/min离心10min；
（5）取上清，加入500μl的氯仿/异戊醇（体积比24:1）混匀，12000r/min离心10min；
（6）取上清，加入50μl3MNaAc和800μl的无水乙醇，-20℃静置30min，离心去上清；
（7）沉淀用70%的乙醇洗涤，干燥；
（8）溶于50μl双蒸水中，-20℃保存。
二、STM4493基因片段的PCR扩增
1、引物的设计与合成
本发明通过对NCBI数据库中鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列（序列表SEQIDNo.1中第447-822位核苷酸序列）为靶目标，应用Primerexpress3软件、PrimerPremier5软件以及Oligo7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。
本专利选取的扩增序列如下：
5’-ATGCGGAAAATGGCCAGCGTTAAGCAAATTATTCGGGACATTAAAGAACAAAAAGTGGCCACAACCGGCAGACGGGTACTGCTGGTTGAAGGTACAGATGATGTCACGGCTTTCCAGAATTTCCTCAGCAGAAAATTTCCGGCATGGGAACAAGATTGGATCCTTGCACCAGCAGGTTCTAAGAAAAATGTGCTTGAGGCGTTAGCCCTTGAAGCCAACTGGCTGGGCGTGGTTGATCGTGACGCATGGACTGACGTGCAGATCGCTGAAAAGCGTCGAAATCTAGCTAATCTACTGGTTCTTCCGCGTTTTTGTATTGAAAGTTATCTGATCGCGCCGGAAGAACTTTGGCTGGTGTTTCAGCCAAAACATCAGCAGGCGATCAATGGCGGCATACAGGCATTTATCCAGGCCGTTCATGATGTTTTACCTCAATGGCGGAACCATGCCGCACTTTGGAATGTTATCCATCCTCTTTGGGAACGGCTGCGCGCTGCCGGTTTTAATACTGCGTTTCATGATCTTAATACAGCACAGAATGATGCTGAAGTTGAACAATGCTTACGGCAGTGGAGCCAGCATCTGGATCCCGATGTCTTGTTAGCCCAGATACAAACGCAAAAAACTAACATCGCCGCACGCTCCCCAACGACGCAATTAACACAGTGCTTTCATGGTAAAATGTTTTTCGAACAGGCAATTGACCCCTTGCTAACCCAGCTTTTGGGTCAGCGGGCTCGTGAACAACGTCAAAAAGATCTGTTCCGCACGTTACCCGTACCTGACGATTTAACTTTTATCTGGAATGAAATGGGATTGTGA-3’。
该外围引物序列如下：
上游引物：STM4493-447F5'-GCCGCACTTTGGAATGTTAT-3'
下游引物：STM4493-822R5'-TCACAATCCCATTTCATTCCAG-3'
扩增片段即保守片段序列，大小为：376bp。
2、PCR反应体系和反应条件
以DNA为模板，以上述外围引物STM4493-447F/STM4493-822R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR反应体系：
10×PCRbuffer5μl
dNTP（2.5μM）4μl
引物F（5μM）4μl
引物R（5μM）4μl
模板2μl
Taq酶（5U）1μl
ddH2O30μl
总体积50μl。
其中引物采用STM4493-447F/STM4493-822R，Taq酶采用北京百泰克PowerTaqPlusDNAPolymerse，PCR扩增仪为北京百泰克iCycling系列96梯度PCR仪。
扩增程序/反应条件：
94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min。取3μL扩增产物进行1%琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。
三、重组质粒pMD18-T-STM4493的构建和转化
1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T（大连宝生物公司）进行连接，采用如下连接体系进行配制：
pMD18-Tvector1μL
回收DNA2μL
Solution15μL
ddH2O2μL
总体积10μL。
配制完成后置于16℃过夜，进行连接反应。
2、pMD18-T-STM4493质粒的转化以及PCR鉴定
（1）从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻；
（2）取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；
（3）42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min；
（4）向1.5mlEP管中加入预冷的400μl的LB液体培养基（不含氨苄青霉素）混匀后，37℃200转/分轻摇培养1h；
（5）将上述培养液摇匀后取100μl涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；
（6）次日观察，从平板上挑取白色单克隆菌落于100μLLB液体培养基（含氨苄青霉素）的PCR管中，37℃振荡培养2-3小时。吸取2μL作为模板进行PCR鉴定，剩余的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；
（7）用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。
引物RV-M/M13-47序列如下：
引物RV-M:5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’；
引物M13-47:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。
PCR反应体系如下：
10×PCRbuffer2μL
dNTP（2.5μM）2μL
引物F（5μM）1.5μL
引物R（5μM）1.5μL
模板2μL
Taq酶（5U）0.5μL
ddH2O10.5μL。
PCR扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min；
（8）采用百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
四、标准品的获取和定量
1、将步骤三得到的含有重组质粒pMD18-T-STM4493的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃200rpm过夜摇培；
2、取1ml培养过夜的菌液转种于30mlLB液体培养基，200rpm增菌培养2-3小时，然后采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；
3、利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可见分光光度计（ND5000）对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度；
4、质粒pMD18-T-STM4493浓度（拷贝数）计算
（1）质粒的分子量=3068bp×660（每对碱基的平均分子量）；
（2）测得质粒浓度为95.48ng/μl，质粒纯度A260/A280=2.05，A260/A230=2.01。因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml。
质粒copies/ml=阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数
其中阿伏伽德罗常数=6.02×1023copies/mol。
因此提取的质粒浓度copies/ml=95×10-9g/ml×6.02×1023copies/mol÷（3068bp×660g/bp·mol）=2.8×1010copies/ml
10μl质粒+18μl的无菌水就得到浓度为1.00×1010copies/ml的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。
实施例2实时荧光定量PCR检测鼠伤寒沙门氏菌方法的建立
一、特异性引物和探针的设计与合成
以上述选取的鼠伤寒沙门氏菌的STM4493基因的保守片段序列为靶目标，应用Primerexpress3软件、PrimerPremier5软件以及Oligo7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针。
作为本发明的核心，一组用于鼠伤寒沙门氏菌实时荧光PCR检测的特异性引物和探针的核苷酸序列如下：
上游引物：STM4493-534F5'-CAGAATGATGCTGAAGTTGAACAA-3'
下游引物：STM4493-642R5'-GCGTGCGGCGATGTTAGTT-3'
探针：STM4493-559P5'-CTTACGGCAGTGGAGCCAGCATCT-3'。
探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA，同时也可以标记其他的荧光报告基团如TET、JOE、HEX、VIC和荧光淬灭基团如DABCYL、BHQ等。
该引物和探针扩增目标核苷酸序列为：
5’-CAGAATGATGCTGAAGTTGAACAATGCTTACGGCAGTGGAGCCAGCATCTGGATCCCGATGTCTTGTTAGCCCAGATACAAACGCAAAAAACTAACATCGCCGCACGC-3’。
二、待测样本的制备
A、样本总RNA的制备
（1）将组织放入研钵中，加入液氮磨碎，每50-100mg组织加入1mlTrizol，用匀浆器进行匀浆处理；
（2）将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，取澄清的匀浆液进行下一步操作；
（3）每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；
（4）4℃10000转/分钟离心15分钟，将水相转移到新管中，每1mlTrizol加入0.5ml异丙醇或者1ml冰乙醇，-80℃冰柜冻存或于-80℃冰柜冻存30分钟以上；
（5）4℃10000转/分钟离心10分钟，弃去上清；
（6）每1mlTrizol至少加1ml75%乙醇。4℃不超过7500转/分钟离心5分钟，弃上清；
（7）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，加入25～200μl无RNase的水，吹打混匀，55～60℃放置10分钟使RNA溶解，-70℃保存。
B、反转录扩增
反转录体系及扩增条件：总mRNA(10pg-1μg)10μl,Oligo(dT)1μl70℃变性10分钟，插入冰中冷却10分钟，加入dNTP1μl，逆转录酶0.5μl，5×RTBuffer0.5μl，PCR专用水7μl，42℃反应2小时。-20℃保存。
三、实时荧光定量PCR条件优化
以浓度为1.00×106copies/ml的阳性质粒为模板，采用百泰克公司生产的2×real-timePCRPremixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，实验采用的实时荧光定量PCR仪为上海枫岭生物技术有限公司生产的FTC-3000实时荧光定量PCR仪。优化步骤一提供的引物和探针的用量。反应体系采用20μl体系，其中引物和探针的量采用表1组合进行反应。
表1PCR反应体系中引物和探针不同用量
反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。结果参照图1，数据显示20μl体系时，引物（5μM）和探针（5μM）分别加入1.6μl，Ct值最小，荧光信号最强。
四、方法评估
1、灵敏度实验
将上述制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml、1.00×103copies/ml、1.00×102copies/ml等作为梯度模板。反应体系如下：
2×premix10μl
PrimerF（5μM）1.6μl
PrimerR（5μM）1.6μl
Probe（5μM）1.6μl
模板2μl
ddH2O补至20μl。
反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果参照图2，数据显示当质粒浓度达到1.00×103copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到1.00×102copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×103copies/ml。
2、特异性实验
为了证实本发明对鼠伤寒沙门氏菌检测的特异性，本申请人选取了其他常见临床感染微生物特异性实验，选取的微生物包括：甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、福氏志贺菌、脑膜炎奈瑟菌、幽门螺旋杆菌。
该特异性试验包括用上述样本的基因组DNA和cDNA为模板进行的试验。上述微生物的DNA提取均采用北京百泰克基因组DNA提取试剂盒（DP2001），RNA提取均采用百泰克RNApure高纯总RNA快速抽提试剂盒（RP1202）,cDNA合成均采用百泰克SuperRTKitcDNA第一链合成试剂盒，采用百泰克公司生产的2×real-timePCRPremixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，反应体系如下：
2×premix10μl
PrimerF（5μM）1.6μl
PrimerR（5μM）1.6μl
Probe（5μM）1.6μl
模板2μl
ddH2O补至20μl。
反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图3，具体结果：不管以cDNA为模板还是以基因组DNA为模板仅鼠伤寒沙门氏菌检测为阳性，其余微生物均为阴性，表明本发明的方法具有很好的特异性。检测结果如表2所示。
表2特异性实验结果
3、标准曲线制备
以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标得到鼠伤寒沙门氏菌的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准，结果参考图4。
4、待测样品的定量检测
以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用鼠伤寒沙门氏菌的特异性引物，以相同的体系同时进行鼠伤寒沙门氏菌基因片段的荧光定量PCR扩增。
PCR反应体系如下：
2×premix10μl
PrimerF（5μM）1.6μl
PrimerR（5μM）1.6μl
Probe（5μM）1.6μl
模板2μl
ddH2O补至20μl。
PCR反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。
通过标准曲线和待测样品的Ct值进行鼠伤寒沙门氏菌的快速定量检测。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>苏州百源基因技术有限公司
<120>一组用于鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>822
<212>DNA
<213>鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因序列
<400>1
atgcggaaaatggccagcgttaagcaaattattcgggacattaaagaacaaaaagtggcc60
acaaccggcagacgggtactgctggttgaaggtacagatgatgtcacggctttccagaat120
ttcctcagcagaaaatttccggcatgggaacaagattggatccttgcaccagcaggttct180
aagaaaaatgtgcttgaggcgttagcccttgaagccaactggctgggcgtggttgatcgt240
gacgcatggactgacgtgcagatcgctgaaaagcgtcgaaatctagctaatctactggtt300
cttccgcgtttttgtattgaaagttatctgatcgcgccggaagaactttggctggtgttt360
cagccaaaacatcagcaggcgatcaatggcggcatacaggcatttatccaggccgttcat420
gatgttttacctcaatggcggaaccatgccgcactttggaatgttatccatcctctttgg480
gaacggctgcgcgctgccggttttaatactgcgtttcatgatcttaatacagcacagaat540
gatgctgaagttgaacaatgcttacggcagtggagccagcatctggatcccgatgtcttg600
ttagcccagatacaaacgcaaaaaactaacatcgccgcacgctccccaacgacgcaatta660
acacagtgctttcatggtaaaatgtttttcgaacaggcaattgaccccttgctaacccag720
cttttgggtcagcgggctcgtgaacaacgtcaaaaagatctgttccgcacgttacccgta780
cctgacgatttaacttttatctggaatgaaatgggattgtga822
<210>2
<211>108
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cagaatgatgctgaagttgaacaatgcttacggcagtggagccagcatctggatcccgat60
gtcttgttagcccagatacaaacgcaaaaaactaacatcgccgcacgc108
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gccgcactttggaatgttat20
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tcacaatcccatttcattccag22
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gagcggataacaatttcacacagg24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cgccagggttttcccagtcacgac24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cagaatgatgctgaagttgaacaa24
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gcgtgcggcgatgttagtt19
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
cttacggcagtggagccagcatct24

Claims (8)

1.一组用于鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）-（3）中的一种：
（1）、上游引物：5'-CAGAATGATGCTGAAGTTGAACAA-3'；
下游引物：5'-GCGTGCGGCGATGTTAGTT-3'；
探针：5'-CTTACGGCAGTGGAGCCAGCATCT-3'；
所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.2；
（2）、与（1）所述序列互补的序列；
（3）、将（1）中所述序列向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
2.根据权利要求所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的5’端荧光报告基团是FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。
3.鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
4.权利要求1或2所述的特异性引物和探针、权利要求3所述的试剂盒在定量检测鼠伤寒沙门氏菌含量中的应用。
5.鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤如下：
（1）制备标准品：将鼠伤寒沙门氏菌保守基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有鼠伤寒沙门氏菌保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述鼠伤寒沙门氏菌保守基因片段参见序列表中SEQIDNo.1的第447-822位核苷酸序列；
（2）标准曲线绘制；
（3）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；
（4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行鼠伤寒沙门氏菌的快速定量检测。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述鼠伤寒沙门氏菌保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：
上游引物为5'-GCCGCACTTTGGAATGTTAT-3'；
下游引物为5'-TCACAATCCCATTTCATTCCAG-3'。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）中所述引物和探针的用量均为1.6μl。
8.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。
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